Karakterisasi morfologi dilakukan pada bulan April 2009 sampai April 2010 di sentra produksi pamelo Sumedang, Gunung Muria (Kudus dan Pati) dan Magetan. Analisis isoenzim dikerjakan pada bulan Maret 2011 di Laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Analisis molekuler dengan ISSR dilakukan pada bulan Maret-Juni 2011 di Laboratorium Pusat Kajian Buah Tropika IPB. Konfirmasi tingkat ploidi dengan analisis jumlah kromosom dilakukan di Laboratorium Mikroteknik, Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB pada bulan September 2010 sampai Pebruari 2011, dan analisis flow
cytometry dilakukan di Laboratorium Genetika Tumbuhan, LIPI Biologi,
Cibinong pada bulan Pebruari 2012.
Karakterisasi Morfologi pada Aksesi Pamelo Berbiji dan Tidak Berbiji
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan ialah bagian-bagian vegetatif dan reproduktif tanaman 14 aksesi tanaman pamelo asal Sumedang: Cikoneng ST, Magetan: Jawa 1, Jawa 2, Jawa 3, Magetan, Sri Nyonya, Adas Duku, Bali Putih, Nambangan, Bali Merah 1, Bali Merah 2, Kudus: Muria Merah 1, Muria Merah 2 dan Pati: Bageng Taji yang tumbuh di kebun petani. Alat yang digunakan ialah pH meter tanah, thermo-higrometer, jangka sorong dan altimeter.
Metode
Identifikasi pamelo secara morfologi dilakukan berdasarkan descriptor list IPGRI (1999) yang telah dimodifikasi (Lampiran 1). Tanaman pamelo yang diamati telah dewasa (telah berbuah), berumur lebih dari 6 tahun, dengan asumsi cir-ciri morfologi dan fisiologi tanaman telah stabil (secara visual sifat genetik telah tampak dan stabil) dan pertumbuhan tanaman tampak normal, tidak ada indikasi atau gejala kekurangan hara. Metode pemilihan contoh dilakukan secara terarah, yaitu dari setiap lokasi yang dipilih dalam satu daerah diamati sebanyak tiga pohon contoh yang dapat mewakili populasi tanaman.
Pengamatan karakter kuantitatif dan kualitatif dievaluasi dari 10 daun, 10 bunga dan 10 buah dari setiap tanaman. Dalam penelitian ini aksesi pamelo dikelompokkan tidak berbiji, bila jumlah biji per buah kurang dari 10, dimasukkan kelompok potensial tidak berbiji, jika dalam satu aksesi terdapat buah berbiji dan tidak berbiji, dan kelompok buah berbiji jika jumlah biji per buah ≥10.
Karakterisasi Biokimia dengan Isoenzim pada Aksesi Pamelo Berbiji dan Tidak Berbiji
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan untuk analisis ialah daun muda pamelo aksesi berbiji (Cikoneng ST, Jawa 2, Jawa 3, Magetan, Sri Nyonya, Adas Duku, Bali Putih dan Muria Merah 2), tidak berbiji (Muria Merah 1, Bali Merah 2, Bageng Taji, Jawa 1) dan potensial tidak berbiji (Nambangan dan Bali Merah 1), yang diperoleh dari hasil eksplorasi di tiga sentra produksi pamelo di Sumedang, Gunung Muria (Pati dan Kudus) dan Magetan.
Metode
Teknik analisis isoenzim esterase (EST), malat dehidrogenase (MDH), peroksidase (PER), dan asam fosfatase (ACP) mengikuti metode Horry (1989), sedangkan aspartat amino transferase (AAT) atau glutamat oksaloasetat transaminase (GOT) menggunakan metode Wendel dan Weeden (1989).
Pengambilan contoh daun dan penyiapan gel
Contoh daun yang diambil dari lapangan disimpan dalam kertas koran yang sudah dibasahi dengan air, kemudian disusun dan dimasukkan ke dalam kantong plastik. Di laboratorium, contoh daun bersama kertas koran dan plastiknya dipindahkan ke dalam refrigerator.
Gel dibuat dari 10% pati kentang dengan 225 ml larutan penyangga gel (Lampiran 2). Sebanyak 150 ml larutan penyangga dituangkan ke dalam erlenmeyer, dimasukkan ke dalam oven Ultra X sampai mendidih. Sisa larutan penyangga lain dicampur dengan pati kentang dalam erlenmeyer lain sambil digoyang-goyang agar tercampur merata. Larutan penyangga yang telah mendidih dikeluarkan dari oven dan dituangkan pada campuran larutan penyangga dan pati. Campuran ini dimasukkan kembali ke dalam oven. Setelah mendidih, pati gel dikeluarkan dan divakum untuk menghilangkan gelembung udara, dan segera dituang dalam cetakan gel. Setelah dingin gel ditutup dengan plastik untuk menghindari penguapan. Gel disimpan dalam suhu kamar selama satu malam sebelum digunakan.
Ekstraksi Enzim dan Elektroforesis
Isoenzim diisolasi dari daun muda pamelo. Sebanyak 100 mg contoh ditambah 0.5 ml larutan pengekstrak (Lampiran 3) dan sedikit kuarsa digerus dalam mortar sampai halus.
Larutan enzim diserap dengan kertas saring ukuran 4 mm x 5 mm. Gel dipotong dan diberi pewarna tanda biru bromofenol 0.2 % (b/v) untuk memudahkan pengamatan. Kertas saring yang sudah mengandung enzim disisipkan dalam potongan gel (dengan jarak 3-4 mm antar contoh).
Gel ditutup dengan plastic wrap, dan dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi penyangga elektroda (Lampiran 4). Elektroforesis dilakukan pada suhu 4oC selama kurang lebih 4 jam dengan kuat arus stabil (0.25-0.26 mA). Pada awal elektroforesis voltase yang digunakan sebesar 50 V selama 30 menit, kemudian 100 V selama 1 jam, selanjutnya dibuat konstan 150 V.
Pewarnaan
Setelah selesai elektroforesis, gel bagian anoda dan katoda dipisahkan, dan kertas saring yang melekat pada potongan gel dikeluarkan. Gel dipotong horisontal menjadi dua bagian menggunakan kawat halus masing-masing setebal 1-2 mm. Gel diletakkan dalam nampan, lalu diberi pewarna tiap enzim. Komposisi larutan pewarna yang digunakan mengikuti metode Wendel dan Weeden (1989). Selesai proses pewarnaan, gel dicuci dengan air bersih, kemudian lembaran gelnya difoto, dan pola pitanya digambar.
Esterase (EST). Sebanyak 120 mg α-naftil asetat dan 120 mg β-naftil asetat dilarutkan dalam 6 ml aseton. Sebanyak 200 mg fast blue RR salt dilarutkan dalam 200 ml 0.1 M penyangga fosfat pH 7.0 (Lampiran 5). Kedua larutan dicampurkan dan diaduk dengan stirrer, kemudian disiramkan dalam nampan yang sudah berisi gel. Gel diinkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit dalam ruang gelap.
Peroksidase (PER). Sebanyak 100 mg 3-amino-9-etil karbozole dilarutkan dalam 5 ml aseton. CaCl2.2H2O sebanyak 100 mg dilarutkan dalam 200 ml 0.05 M natrium asetat pH 5.0. Kedua larutan dicampurkan dan ditambah 1 ml H2O2 3%, kemudian dituang ke dalam nampan berisi gel. Gel diinkubasi dalam suhu ruangan pada kondisi gelap selama semalam.
Malat Dehidrogenase (MDH). Sebanyak 0.015 g DL-malic acid, 0.001 g β-NAD, 50 ml tris HCl pH 8.5, 0.001 g NBT dan 0.002 g PMS, dilarutkan dan dituangkan pada nampan berisi gel.
Asam Fosfatase (ACP). Sebanyak 50 mg Na- α-asam naftil fosfat, 50 mg MgCl2 dan 50 mg Fast Garnet GBG salt dilarutkan dalam 50 ml 50 mM buffer Na-setat pH 5.0, dan dituangkan pada gel.
Aspartat Amino Transferase (AAT). Sebanyak 200 mg Fast Blue BB salt dilarutkan dalam 20 ml larutan AAT (Lampiran 6). Gel diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit di dalam ruang gelap.
Pengamatan dilakukan terhadap jumlah dan posisi pita-pita yang terbentuk pada gel. Pola pita isoenzim yang terbentuk digambar zimogramnya berdasarkan pengukuran mobilitas pita (Rf) dan hanya pita yang stabil dan konsisten yang dipilih. Nilai Rf dihitung dengan cara membandingkan jarak pita yang terbentuk
dari setiap sumur dengan jarak migrasi terjauh. Sistem enzim yang memperlihatkan keragaman dipakai untuk mengukur kemiripan genetika antar aksesi.
Karakterisasi Molekuler dengan ISSR pada Aksesi Pamelo Berbiji dan Tidak Berbiji
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah DNA dari aksesi pamelo berbiji (Cikoneng ST, Jawa 2, Jawa 3, Magetan, Sri Nyonya, Adas Duku, Bali Putih dan Muria Merah 2), tidak berbiji (Muria Merah 1, Bali Merah 2, Bageng Taji, Jawa 1) dan potensial tidak berbiji (Nambangan dan Bali Merah 1). Bahan lainnya adalah pasir kuarsa, merkaptoetanol, PVP (polyvinyl polypyrrilidone), CTAB (Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide) (Lampiran 7), akuades steril, CIAA (Chloroform : Iso Amyl Alcohol (24:1)) (Lampiran 8), alkohol absolut 70%, isopropanol, etanol 70% (Lampiran 9), agarose, air bebas ion, parafilm, buffer TAE 1x (Lampiran 10), loading dye (Lampiran 11), kit PCR (Go Taq Greenmaster mix Promega), primer ISSR, 1 kb lader, tris HCl (Lampiran 12), NaCl (Lampiran 13), etidium bromida (Et Br), dan white tip 0.5-10µl.
Alat yang diperlukan berupa microtube ukuran 1.5 ml dan 0.2 ml, mortar, mikropipet, vorteks, centrifuge, waterbath, mesin PCR (Applied Biosystem 2720 thermal cycler), perangkat elektroforesis, UV transluminator dan kamera digital.
Metode Isolasi DNA
Genom DNA diekstraksi dari daun muda menggunakan metode CTAB (Doyle dan Doyle 1990). Sebanyak 1 g contoh ditambah 300 µl buffer ekstraksi (Lampiran 14), sedikit PVP dan kuarsa digerus dalam mortar hingga halus, dmasukkkan ke dalam tabung 1.5 ml. Larutan ini diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65oC selama 20 menit, sambil dikocok tiap 10 menit. Setelah inkubasi, ditambahkan larutan kloroform:isoamil alkohol atau CIAA (24:1) sebanyak 600 µl, divorteks selama 1 menit agar homogen, dan disentrifuse 11 000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan DNA dari bahan lainnya.
Supernatan hasil sentrifuse dimasukkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan CIAA kembali sebanyak satu kali volume supernatan, dan disentrifuse lagi. Pada supernatan yang diperoleh ditambahkan isopropanol sebanyak satu kali volume. Larutan DNA ini disentrifuse kembali, dan supernatannya dibuang, sehingga endapan (pelet) DNA tertinggal di ujung tabung. Pelet DNA ditambah alkohol 70 % sebanyak 100 µl dan disentrifuse kembali. Alkohol kemudian dibuang dan pelet DNA dikeringkan, dengan cara membalikkan tabung dan disimpan di dalam desikator sampai pelet DNA mengering. Pelet DNA yang telah kering ditambah air bebas ion sebanyak 10 µl untuk dijadikan stok DNA.
Uji kualitas DNA total dilakukan melalui pemisahan DNA pada gel agarose 0.8%, yang direndam dalam larutan TAE 10 x menggunakan perangkat elektroforesis, pada 80 V selama 50 menit. Sebagai pembanding konsentrasi DNA total, digunakan lambda DNA (Promega). Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan Et Br 1% selama 30 menit, kemudian dibilas dengan air. Dokumentasi menggunakan kamera digital dengan penyinaran UV transluminator.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi (penggandaan) contoh DNA dilakukan dengan mesin PCR (Applied Biosystem 2720), menggunakan 15 primer koleksi PKBT IPB. Dari 15 primer tersebut, dipilih 10 primer acak (Tabel 1) yang menghasilkan pita polimorfik. Primer ini telah diuji melalui tahap optimasi suhu annealing di laboratorium PKBT.
Komposisi bahan untuk amplifikasi contoh DNA pamelo dengan primer ISSR terdiri atas 10 ng.µl-1 DNA, 1 µl primer, 12.5 µl PCR mix (Go Taq Green Master Promega), dan air bebas ion hingga mencapai volume 25 µl. Tahapan dalam program mesin PCR, adalah pradenaturasi suhu 94°C selama 4 menit, diikuti dengan denaturasi suhu 94°C selama 30 detik, annealing suhu 36°C -53°C selama 30 detik, dan ekstensi suhu 72°C selama 1 menit, penurunan suhu 72°C selama 5 menit, dan pendinginan suhu 4°C sampai tak terhingga. Proses PCR ini diulang sebanyak 35 siklus.
Pengamatan terhadap hasil PCR dilakukan menggunakan agarose 1.2%, yang dielektroforesis selama 50 menit. Gel kemudian direndam Et Br selama 30 menit, dibilas dengan air dan pita-pita yang terbentuk didokumentasi menggunakan kamera digital dengan penyinaran UV transluminator.
Tabel 1 Nama dan susunan basa primer koleksi PKBT IPB
No. Nama primer Susunan basa Suhu annealing
1. PKBT2 (AC)8TT 53oC 2. PKBT3 (AG)8T 53 oC 3. PKBT4 (AG)8AA 53 oC 4. PKBT7 (GA)9A 54 oC 5. PKBT8 (GA)9C 54 oC 6. PKBT9 (GA)9T 54 oC 7. PKBT11 (GT)9C 54 oC 8. PKBT12 (GT)9T 54 oC 9. RED12 (AGAC)4 36 oC 10. RED17 (GAC)5 54 oC
Analisis Data Molekuler
Skoring pita DNA dilakukan berdasarkan keberadaan pita DNA pada setiap kultivar. Pita-pita DNA yang terbentuk dari hasil analisis molekuler penanda dianggap sebagai satu karakter yang mewakili satu lokus DNA. Pita-pita DNA dengan laju migrasi yang sama diasumsikan sebagai lokus yang homolog. Profil DNA tersebut selanjutnya diterjemahkan ke dalam data biner berdasarkan kehadiran pita (1) dan tidak ada pita DNA (0) untuk membangun matrik kemiripan.
Analisis Keragaman Berdasarkan Data Karakterisasi Morfologi, Isoenzim dan Molekuler
Analisis kemiripan data morfologi, isoenzim dan molekuler dilakukan melalui fungsi SIMQUAL (Similarity for Qualitative Data), sedangkan pengelompokan data matrik (cluster analysis) dan pembuatan dendrogram dilakukan dengan fungsi SAHN (Sequential Agglomerative Hierarchical and
Arithmetic), dan tingkat kepercayaan dendrogram ditentukan dengan fungsi
MxComp menggunakan program Numerical Taxonomy and Multivariate System (NTSYSpc) versi 2.02 (Rohlf 1998). Keselarasan pengelompokan ditentukan berdasarkan nilai goodness of fit, yaitu tingkat kesamaan nilai matriks similarity
coefficient, dengan interpretasi kesesuaian matriks korelasi dua data sangat sesuai
(nilai r (korelasi kofenetik dari MxComp) ≥0.9), sesuai (0.8≤r≤0.9), tidak sesuai (0.7≤r≤0.8), dan sangat tidak sesuai (r≤0.7).
Untuk mengurangi jumlah peubah yang akan dianalisis, digunakan analisis komponen utama, dengan mengekstrak nilai ragam dari eigenvector dari
eigenvalue utama, dengan tingkat keragaman paling tinggi menggunakan program
Minitab versi 1.4. Hasil analisis komponen utama dapat dipetakan dalam dua atau tiga sumbu utama.
Analisis Tingkat Ploidi pada Aksesi Pamelo Berbiji dan Tidak Berbiji
Analisis Jumlah Kromosom Bahan dan Alat
Bahan yang diperlukan ialah akar tanaman pamelo aksesi berbiji (‘Muria Merah 2’, ‘Adas Duku’, ‘Sri Nyonya’), tidak berbiji (‘Muria Merah 1’ dan ‘Bageng Taji’) dan potensial tidak berbiji (‘Nambangan’), bahan untuk analisis kromosom (8-Hydroxyquinolin 0.002 M, asam asetat 45%, HCl 1 N, aseto orcein 2%). Alat yang digunakan berupa mikroskop Olympus BX41, gelas obyek dan penutup, pinset, water bath, alat fotografi.
Metode
Metode yang digunakan mengacu pada Sastrosumarjo (2006) yang telah dimodifikasi. Ujung akar tanaman pamelo dipotong sepanjang 0.5-1.0 cm dan segera dimasukkan ke dalam larutan 0.002 M 8-hydroxyquinoline selama 3 jam pada suhu 4 oC. Akar tersebut dicuci dengan air, difiksasi dalam asam asetat 45% selama 10 menit pada suhu ruang. Berikutnya ujung akar dimasukkan ke dalam botol berisi campuran HCl dengan asam asetat 45% (3:1) selama 2 menit. Proses pelunakan (maserasi) akar dilakukan dengan memasukkan botol berisi akar ke dalam water bath dengan suhu 60 oC selama 2 menit. Ujung akar diletakkan di
atas gelas obyek, dipotong bagian ujungnya 1-2 mm, ditetesi dengan aseto orcein 2%, ditutup dengan gelas penutup, dilewatkan di atas api bunsen 2-3 kali. Gelas penutup diketuk dengan ujung pensil berkaret (squash), kemudian ditekan dengan ibu jari.
Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop pada perbesaran 1000x. Dari setiap individu tanaman dipilih beberapa sel yang menunjukkan fase metafase, karena pada fase ini kromosom tampak menyebar.
Analisis Flow Cytometry Bahan dan Alat
Untuk mengkonfirmasi hasil analisis jumlah kromosom dilakukan analisis ploidi tanaman pamelo, menggunakan Partec Flow Cytometry (D-48161 Münster Jerman). Bahan tanaman yang digunakan berupa daun pamelo kelompok aksesi berbiji (Cikoneng ST, Jawa 2, Jawa 3, Magetan, Sri Nyonya, Adas Duku, Muria Merah 2), potensial tidak berbiji (Nambangan, Bali Merah 1) dan tidak berbiji (Bali Merah 2, Bageng Taji dan Muria Merah 1).
Metode
Kira-kira 0.5 cm2 daun muda dicacah menggunakan silet tajam dalam cawan petri berdiameter 55 mm berisi 250 µl buffer ekstraksi Partec HR-A selama 30-90 detik. Hasil cacahan daun disaring dengan Partec 50 µm Cell Trics
disposable filter ke dalam tabung kecil, kemudian ditambahkan larutan pewarna
(dengan Propidium Iodida dan RNAse) sebanyak 1.0 ml. Sampel tersebut diinkubasi di tempat gelap selama 30-90 menit, kemudian dianalisis di flow
cytometer. Pengamatan dilakukan terhadap intensitas fluoresens relatif DNA total
aksesi pamelo yang diamati.