Percobaan terdiri atas dua tahap pengujian yaitu pengujian ketahanan terhadap blas daun dan pengujian ketahanan terhadap blas leher malai. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi dan Rumah Kasa Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BB-BIOGEN), Bogor. Percobaan tahap pertama dilakukan pada bulan Januari sampai dengan Maret 2004. Percobaan kedua dilakukan pada bulan Agustus 2004 sampai dengan Maret 2005.
Pengujian Ketahanan terhadap Blas Daun
Bahan tanam sebanyak 120 genotipe yang terdiri atas 113 galur padi haploid ganda asal kultur antera dari persilangan varietas unggul dengan varietas lokal, 5 genotipe tetua dan 2 genotipe kontrol. Tetua terdiri dari Krowal, Sigundil, Grogol, Jatiluhur dan Gajah Mungkur (Tabel Lampiran 1). Kontrol terdiri atas varietas Asahan sebagai kontrol tahan dan Kencana Bali sebagai kontrol peka.
Benih bernas dari setiap genotipe dioven selama 3 x 24 jam pada suhu 450C kemudian ditanam dalam barisan dengan jarak 4 x 3 cm dalam bak plastik. Bak plastik ukuran 38 x 26 x 10 cm diisi media tanah yang berasal dari kebun percobaan Cikemueh BB-BIOGEN Bogor. Tiap bak plastik ditanami 20 galur padi yang diuji. Pemupukan dilakukan sehari sebelum tanam dengan dosis 7.5 g urea, 3 g SP-36 dan 2 g KCl per bak.
Isolat P. grisea diperoleh dari Instalasi Penelitian Padi (INLITPA) Muara, Bogor. Ras yang digunakan adalah ras 001, ras 033 dan ras 173. Setiap ras ditumbuhkan pada media PDA (potato dextrose agar) dalam ruang inkubasi bersuhu 25oC. Setelah 7 hari isolat murni dipindahtanamkan ke media sporulasi OMA (oat meal agar) pada cawan petri selama 10 hari dalam ruang inkubasi bersuhu 25oC. Penggosokan permukaan OMA dilakukan dengan menggunakan kuas halus steril. Pencucian koloni cendawan
menggunakan aquades steril ditambah Streptomycin 0.02 g/l air. Cawan dibiarkan terbuka selama 2 hari dalam ruang inkubasi bersuhu 28oC yang berlampu TL 20 watt supaya terjadi sporulasi.
Penggosokan kedua dilakukan dengan menggunakan campuran 1 liter aquades dan 1 ml Tween 20. Larutan hasil penggosokan merupakan suspensi konidia P. grisea disaring dan digunakan sebagai inokulum. Kerapatan inokulum dihitung dengan menggunakan haemocytometer dan diatur sampai menjadi 3 x 105 konidia/ml larutan.
Inokulasi P. grisea dilakukan dengan cara menyempotkan suspensi konidia ke tanaman padi yang berumur 18 hari setelah tanam (HST) secara merata sebanyak 50 ml suspensi konidia/bak. Tanaman yang telah diinokulasi segera dimasukkan ke ruang lembab selama 48 jam dan kelembaban dipertahankan di atas 90%. Selanjutnya tanaman dipindahkan ke rumah kasa yang dindingnya dilapisi kain dan alasnya dilapisi goni. Untuk mempertahankan kelembaban di atas 90% dilakukan penyiraman dengan sprinkler embun secara terus menerus sampai waktu pengamatan.
Pengamatan dilakukan terhadap: (1) Periode laten, yaitu waktu yang dibutuhkan sejak inokulasi sampai munculnya gejala bercak khas blas pada daun, pengamatan dilakukan mulai 1 hari setelah inokulasi (HSI) sampai 7 HSI. (2) Skala penyakit, diamati pada 7 HSI, daun yang diamati adalah seluruh daun yang telah membuka sempurna. Penskoran blas daun dan pengelompokan ketahanan dilakukan berdasarkan sistem evaluasi standar untuk penyakit blas daun dari IRRI (1996; Tabel Lampiran 3). Skala skala 0-2 = tahan, skala 3 = moderat tahan, skala 4-6 = moderat rentan dan skala 7-9 = rentan (Ou 1973). (3) Intensitas serangan (%) dihitung berdasarkan:
% ) V N ( ) v n ( I i i 100 × ∑ ×× =
dimana, I = intensitas serangan, ni = jumlah tanaman terserang dengan skala ke-i, vi = skala ke-i masing-masing tanaman terserang, N = jumlah tanaman total yang diamati dan V = skala tertinggi yaitu 9. Genotipe dengan intensitas serangan = 10 % dianggap tahan dan di atasnya dianggap rentan.
Pengujian Ketahanan terhadap Blas Leher Malai
Genotipe yang digunakan pada pengujian ketahanan terhadap blas leher malai sebanyak 17 galur haploid ganda yaitu GRGM9, JTGR17, JTGR18, GRGM12, SGJT19, SGJT34, SGGM8, SGJT29, GRJT14, GRJT18, SGGM5, SGJT3, GRJT23, GRJT19,
SGJT36, SGJT28 dan JTKR7. Tetua terdiri atas Krowal, Sigundil, Grogol, Jatiluhur dan Gajah Mungkur. Pembanding tahan blas leher digunakan varietas Limboto dan pembanding rentan adalah Cirata. Isolat blas yang digunakan adalah 2 ras yaitu ras 173 dan 033. Ras 173 sangat virulen dan ras 033 dijumpai sangat dominan menyerang blas leher di lapangan (Nasution et al. 2004).
Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan petak terpisah dengan 3 ulangan. Ras P. grisea terdiri atas 2 ras yaitu ras 033 dan ras 173 sebagai petak utama dan genotipe yang diuji sebagai anak petak. Setiap perlakuan petak utama ditempatkan dalam satu ruangan tersendiri.
Penyemaian benih dilakukan dalam waktu yang berbeda untuk mendapatkan fase berbunga yang sama. Setelah benih berumur tiga minggu, bibit dipindahtanamkan ke dalam ember yang telah diisi tanah dari INLITPA Muara sebanyak lima tanaman per ember. Dosis pupuk yang digunakan adalah 0.5 kg pupuk kandang, 2 g Urea, 1 g SP36, 1 g KCl per ember. Dinding Rumah Kasa dilapisi kain belacu dan lantainya dilapisi dengan karung goni serta disiram secara terus menerus untuk menjaga kelembaban ruangan.
Persiapan inokulum dilakukan seperti pada percobaan blas daun. Inokulasi P. grisea dilakukan dengan cara semprot ke tanaman padi pada saat malai sudah keluar 30%. Penyemprotan dilakukan pada sore hari menjelang malam, kemudian dibiarkan tanpa disiram. Penyiraman mulai dilakukan keesokan harinya dengan sprinkler embun secara terus menerus untuk menjaga kelembaban sekitar 90%.
Pengamatan dilakukan setiap minggu mulai satu minggu setelah inokulasi sampai seminggu sebelum panen. Pengamatan dilakukan terhadap (1) intensitas serangan (%) dan (2) skala penyakit. Intensitas serangan dihitung berdasarkan:
% N
n I = ∑ ×100
di mana, I = intensitas serangan, n = jumlah malai terserang, N = jumlah malai yang diamati. Skala penyakit diamati berdasarkan sistem evaluasi standar untuk penyakit blas leher malai dari IRRI (1996) sebagai berikut : 0 = tidak ada serangan, 1 = serangan kurang dari 5%, 3 = serangan 5-10%, 5 = serangan 11-25%, 7 = 26-50% dan 9 = serangan lebih dari 50%. Pengelompokan ketahanan berdasarkan sistem evaluasi standar untuk penyakit blas leher malai dari IRRI (1996). Skala 0-1 = tahan (T), skala 3-4 = moderat tahan (MT), skala 5-6 = moderat rentan (MR) dan skala 7-9 = rentan (R).
Ragam genotipe (Vg2) dan ragam fenotipe (Vp2) dan heritabilitas dalam arti luas (Hbs) diduga berdasarkan sidik ragam untuk percobaan dalam rancangan split plot (Singh et al. 1993). Koefisien keragaman genetik dan koefisien keragaman fenotip diduga berdasarkan cara Singh dan Chaudhary (1979). Untuk menentukan hubungan antara ketahanan terhadap blas daun dan blas leher malai dilakukan analisis korelasi sederhana antara intensitas serangan blas daun dan blas leher malai pada masing-masing ras (Gomez dan Gomez 1995).