Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor, berlangsung sejak bulan September 2004 sampai dengan bulan Januari 2005.
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini terdiri dari : eksplan bagian pucuk yang diambil dari tanaman induk yang ditumbuhkan di lingkungan laboratorium, zat pengatur tumbuh (ZPT) yang terdiri dari 6-benzyl amino purine (BAP) dan indole acetic acid (IAA), alkohol 70%, sodium hipoklorit, bahan-bahan pembuatan media MS-0, spirtus, betadin, tween, agar, sukrosa, aquadestilata, plastik, karet gelang dan alat tulis menulis.
Peralatan yang digunakan terdiri dari : autoklaf gas, laminar air flow, alat tanam (pinset, scalpel, gunting), lampu bunsen, pipet, pH meter/kertas lakmus, botol kultur, rak kultur dan timbangan analitik.
Metodologi Penelitian
Percobaan disusun berdasarkan rancangan acak kelompok faktorial yang terdiri dua faktor. Faktor pertama adalah penggunaan BAP dengan empat konsentrasi, masing-masing 0, 1, 2, dan 3 ppm. Faktor kedua adalah penggunaan IAA dengan tiga konsentrasi masing-masing 0, 0.5, dan 1 ppm. Setiap kombinasi perlakuan diulang
sebanyak 10 kali, sehingga terdapat 12 kombinasi perlakuan dan 120 satuan percobaan.
Tabel 3. Kombinasi perlakuan pemberian BAP dan IAA pada multiplikasi tunas daun dewa IAA (ppm) BAP (ppm) (0.0) I0 (0.5) I1 (1.0) I2 (0) B0 BB0I0 BB0I1 BB0I2 (1) B1 BB1I0 BB1I1 BB1I2 (2) B2 BB2I0 BB2I1 BB2I2 (3) B3 BB3I0 BB3I1 BB3I2
Model linier rancangan yang digunakan adalah : Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + εijk.
Yijk = nilai pengamatan karena adanya pengaruh BAP konsentrasi ke-i atau IAA konsentrasi ke-j pada kelompok ke-k
μ = nilai rata-rata hasil pengamatan untuk setiap satuan percobaan αi = nilai pengamatan karena pengaruh perlakuan BAP konsentrasi ke-i βj = nilai pengamatan karena pengaruh perlakuan IAA konsentrasi ke-j (αβ)ij = nilai pengamatan karena pengaruh interaksi BAP pada konsentrasi ke-i
dan IAA pada konsentrasi ke-j
εijk. = pengaruh galat pada perlakuan BAP konsentrasi ke-i, IAA konsentrasi ke-j dan kelompok ke-k
i = 1, 2, 3, 4 untuk perlakuan BAP j = 1, 2, 3 untuk perlakuan IAA
k = pengaruh ulangan/kelompok
Data pengamatan diuji menggunakan sidik ragam, jika berpengaruh nyata dilanjutkan dengan uji Duncan`s Multiple Range Test (DMRT) pada taraf kesalahan 5 % (Gomez dan Gomez 1995, Mattjik dan Sumertajaya 2002).
Pelaksanaan perbanyakan tanaman secara in vitro untuk tahap multiplikasi tunas, urutan kegiatan yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :
Persiapan tanaman induk
Daun dewa ditanam dalam pot plastik dan ditumbuhkan di lingkungan laboratorium kultur jaringan. Pemangkasan pucuk dilakukan pada tanaman untuk memacu pertumbuhan tunas lateral sebagai sumber eksplan.
Persiapan bahan tanam
Tunas lateral dari tanaman induk dipotong dengan menggunakan gunting pangkas 1-2 buku per tunas, kemudian potongan tunas berbuku tersebut dibersihkan dengan menggunakan detergen yang dilarutkan ke dalam air aquades. Selanjutnya eksplan dimasukkan ke dalam wadah untuk dicuci dengan air mengalir selama 1 jam. Sterilisasi air aquades dan peralatan
Kegiatan sterilisasi dilakukan terhadap air aquades dan sejumlah peralatan tanam yang akan digunakan. Air aquades disterilkan dalam autoklaf gas selama 1 jam sejumlah 100 ml setiap botol yang ditutup dengan plastik sebagai bahan untuk kegiatan sterilisisasi eksplan di dalam laminar.
Sterilisasi peralatan yang terdiri dari pinset, gunting, scalpel, petridish juga dilakukan dalam autoklaf gas selama 1 jam bersama-sama dengan sterilisasi air aquades. Sterilisasi dilakukan pada temperatur 1210C dengan tekanan 17.5-20 psi selama 1 jam. Untuk laminar air flow disterilkan dengan menghidupkan laminar (kipas angin dan lampu UV) selama 30-60 menit sebelum digunakan. Selanjutnya laminar disemprot dengan alkohol 70 % dan dibiarkan sampai mengering.
Pembuatan media
Media yang akan dibuat terdiri dari media MS-0 (Lampiran 5, komposisi media MS) untuk penanaman prakondisi, media untuk scalling up eksplan dan media perlakuan multiplikasi tunas. Sebelum membuat komposisi media, dibuat terlebih dahulu larutan stok untuk media MS dan ZPT. Pembuatan media MS-0 dilakukan dengan menyiapkan larutan sebanyak 1 liter yang berisi komposisi unsur hara makro, unsur hara mikro, vitamin, myo-inositol, sukrosa dan agar sesuai dengan kebutuhan masing-masing yang diambil dari larutan stok yang sudah disediakan. Untuk pembuatan media untuk scalling up dilakukan dengan menambahkan BAP 0,5 ppm dan IAA 1 ppm ke dalam larutan media MS-0. Media perlakuan multiplikasi tunas dibuat dengan menambahkan masing-masing kombinasi perlakuan ZPT ke dalam larutan media MS-0, masing-masing BAP 0, 1, 2 dan 3 ppm dan IAA 0, 0.5 dan 1 ppm.
Larutan stok ZPT dibuat dengan cara melarutkan 10 mg BAP atau IAA dengan pelarutnya masing-masing kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml air steril. Untuk perlakuan BAP 1 ppm dimasukkan 10 ml larutan stok BAP ke dalam labu takar 1000 ml, sedangkan untuk BAP 2 dan 3 ppm masing-masing larutan stok dipipet sebanyak 20 dan 30 ml. Pada perlakuan IAA, untuk 0.5 ppm dimasukan 5 ml larutan stok,
sedangkan untuk 1 ppm dimasukkan 10 ml larutan stok IAA ke dalam labu takar. Labu takar yang telah berisi perlakuan kemudian ditambahkan larutan sukrosa 30 g/l serta aquadestilata ke dalamnya sampai batas tera. Setelah itu pH media diukur dengan pH meter/kertas lakmus pada kisaran 5,7-6,0. Bila pH sudah tepat, larutan dimasak pada panci enamel dan ditambahkan 7 g/l agar-agar sampai semua agar-agar terlarut dan larutan terlihat jernih. Selanjutnya media dituangkan ke botol kultur dengan tinggi permukaan larutan + 25 ml (20 mm) dari dasar botol. Botol kemudian ditutup dengan plastik dan direkatkan dengan karet gelang lalu disterilkan dalam autoklaf gas pada temperatur 1210C tekanan 17,5-20 psi selama 30 menit. Setelah itu botol dibiarkan hingga dingin lalu disimpan dalam ruang kultur bertemperatur 180C. Sterilisasi eksplan
Eksplan berupa potongan tunas 1 buku yang telah dibersihkan dengan detergen dan dicuci dengan air mengalir selama 1 jam kemudian disterilkan di dalam laminar. Untuk persiapan sterilisasi disiapkan larutan sodium hipoklorit 1, 5 dan 10 %, betadin, tween, alkohol 70 % dan air steril.
Larutan sodium hipoklorit (sunclin) 1 % dibuat dengan cara menambahkan 1 ml sunclin ke dalam 99 ml aquadestilata steril, sedangkan larutan sodium hipoklorit 5% dan 10 % dibuat dengan menambahkan masing-masing 5 dan 10 ml sunclin ke dalam 95 dan 90 ml aquadestilata steril.
Sterilisasi didalam laminar dimulai dengan mencelupkan eksplan ke dalam alkohol 70% kemudian eksplan dibilas 3 kali dengan air steril dan selanjutnya direndam ke dalam larutan sodium hipoklorit 10 % selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril 3 kali. Eksplan direndam lagi dengan larutan sodium hipoklorit 5 % selama 20 menit, kemudian dibilas dengan air steril 3 kali. Setelah itu bahan tanam diletakkan di cawan petri yang sudah berisi larutan sodium hipoklorit 1 % yang ditambahkan betadin dan tween sebanyak 3-5 tetes. Eksplan dipotong setiap buku dan dihilangkan daunnya untuk siap ditanam pada botol kultur yang telah berisi media.
Penanaman eksplan pada media MS-0
Eksplan ditanam di media prakondisi (MS-0) selama 1 minggu. Setelah itu eksplan yang tidak terkontaminasi dipindahkan ke media scalling up yaitu media MS yang ditambah BAP 0,5 ppm dan IAA 1 ppm untuk multiplikasi tunas.
Penanaman eksplan pada media perlakuan
Tunas yang telah bermultiplikasi pada media scalling up dipindahkan ke media perlakuan kombinasi BAP dan IAA dengan konsentrasi yang telah ditentukan masing- masing 1 tunas per botol kultur.
Untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap multiplikasi tunas, dilakukan pengamatan dan pengukuran terhadap beberapa parameter pertumbuhan vegetatif yang terdiri dari : a) warna daun diamati secara visual dengan skala 1 = hijau, 2 = hijau keunguan, 3 = merah keunguan, setiap minggu b) jumlah tunas dihitung untuk setiap botol kultur, setiap minggu, c) tinggi tunas diamati setiap minggu, e) jumlah daun total per botol kultur diamati setiap minggu, f) jumlah akar diamati setiap minggu, dan g) diameter kalus dan jumlah plantlet diamati di akhir pengamatan.