Rittenburg JH and Smith CJ. 1990. Fundamentals of immunoassay, In Development and Application of Immunoassay for Food Analysis. J.H. Rittenburg (Ed.).
Elsevier Applied Science. London and New York, 29-57.
Savard ME, Sinha RC, Lau R, Seguin C, and Buffam S. 2003. Monoclonal antibodies for fumonisins B
1, B
2dan B
3. Food and Agricultural Immunology 15(2): 127-134.
Szurdoki F, Trousdale E, Ward B, Gee SJ, Hammock BD, and Gilchrist DG. 1996.
Synthesis of protein conjugates and development of immunoassays for AAL toxins. American Chemical Society:1-8.
Usleber E, Straka M, and Terplan G. 1994. Enzyme immunoassay for fumonisin B
1applied to corn-based food. Journal of Agricultural and Food Chemistry 42:
1392-1396.
Wang S, Quan Y, Lee N, and Kennedy IR. 2006. Rapid determination of fumonisin B1 in food samples by enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold immunoassay. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54: 2491-2495.
Yeung JM and Newsome WH. 1995. Biotin-streptavidin complex as sensitive
enhancer for enzyme-linked immunosorbent assay for foods. In New Frontiers
in Agricultural Immunoassay. Kurtz D, Skerrit JH, Stanker I, Eds.; AOAC
International 12: 163-170.
Yeung JM, Prelusky DB, Savard ME, Dang BDM, and Robinson LA. 1996. Sensitive immunoassay for fumonisin B
1in corn. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44: 3582-3586.
Yu FY and Chu FS. 1999. Production and characterization of antibodies against
fumonisin B
1. Journal of Food Protection 59: 992-997.
ABSTRAK
Percobaan ini bertujuan untuk memproduksi antibodi monoklonal (AbMk) yang digunakan sebagai pereaksi ELISA untuk mendeteksi fumonisin. Mencit BALB/c diimunisasi dengan fumonisin B1-ovalbumin (FB1-Ova) 10 µg/ekor secara intra vena (iv), kemudian sel limfosit mencit yang hiperimun tersebut difusikan dengan sel mieloma Sp2/0-Ag 14 menggunakan polietilen glikol (PEG 4000) sebagai fusogen. Dari 25 klon yang terbentuk dipilih 8 klon yang menghasilkan antibodi dengan titer 5.000-10.000 dan kisaran optical density pada 450 nm (OD450) sebesar 0,610-0,973. Kloning yang dilakukan terhadap klon 2B1F6 menghasilkan subklon 2B1F6 yang memiliki respon antibodi tertinggi. Sel hibridomaini disimpan di dalam nitrogen cair, dan setelah 30 hari sel dikultur kembali dalam medium hipoksantin-timidin (HT) untuk mengetahui viabilitas sel.
Pertumbuhan yang baik terlihat setelah sel dikultur selama 7 hari, di mana perkembangbiakan berkisar antara 2x106 - 6,9x107 sel/ml. Produksi AbMk melalui kultur sel hibridoma secara in vitro dalam 40 ml medium RPMI mengandung 10%
FBS menghasilkan antibodi dengan konsentrasi 2,81 mg/ml setelah pengendapan dengan ammonium sulfat dan purifikasi melalui kolom affinitas HiTrap Protein A HP. Produksi AbMk dalam cairan asites mencit BALB/c (in vivo) yang disuntik dengan sel hibridoma dari subklon 2B1F6F7 dengan konsentrasi 5x106 sel/ml secara intra peritoneal menghasilkan antibodi 1,62 mg/ml. Karakterisasi AbMk dengan menggunakan kit identifikasi subkelas imunoglobulin komersial menunjukkan bahwa antibodi tersebut termasuk ke dalam subkelas imunoglobulin G1 (IgG1) dengan rantai berat kappa (k-heavy chain) yang dikonfirmasi dengan gel elektroforesis (SDS-PAGE).
ABSTRACT
The objective of this experiment was to produce monoclonal antibody to be used as the reagen of ELISA for the detection of fumonisins. BALB/c mice were immunized intra vena with 10 µg FB1-Ova each. The lymphocyte cells of the ice were then fused with Sp2/0-Ag 14 myeloma cell-line using poly ethylene glycol (PEG 4000) as the fusogen. Eight clones out of 25 clones produced antibodies with titers ranged between 5,000-10,000 and optical density 0.610-0.973 at 450 nm. Cloning of the 2B1F6 clones produced 2B1F6F7 subclone with high antibody response. The hybridoma cells of the subclone were kept in liquid nitrogen and after 30 days the the cells were re-cultured in hypoxantine-timidine (HT) medium to evaluate the viability. The culture showed cell growth at concentration ranged between 2x106 - 6,9x107 cells/ml after 7 days incubation. In-vitro production of monoclonal antibodies from the 2B1F6F7 subclone in 40 milliliters of RPMI medium contained 10% foetal bovine serum produced 2.81 mg/ml antibodies after purification using ammonium sulphate and HiTrap Protein A HP affinity column.
On the other hand, the in-vivo antibody production by injecting 2x106 cells/ml of the subclone to BALB/c mice intra-peritoneally obtained 1.62 mg/ml antibodies from the ascitic fluids after the same purification process.. Characterization of the
monoclonal antibodies using a commercial immunoglobulin identification kit indicated that the antibodies produced by the 2B1F6F7 subclone were immunoglobulin G1 (IgG1) subclass with kappa-heavy chain which was confirmed by gel electrophoresis (SDS-PAGE).
PENDAHULUAN
Antibodi monoklonal (AbMk) adalah antibodi yang digunakan secara ekstensif dalam imunoasai, terutama dalam bidang biomedis untuk diagnosis dan pengobatan penyakit. Selain itu, AbMk juga diaplikasikan untuk mendeteksi berbagai kontaminan pada bahan pangan atau pakan serta hasil olahannya, seperti mikotoksin (Azcona-Olivera et al. 1992a, Yeung et al. 1996, Yu & Chu 1999a ,1999b, Barna-Vetro et al. 2000, Barna-Vetro 2002).
Fumonisin adalah mikotoksin yang banyak mengkontaminasi hasil pertanian yang digunakan sebagai bahan pangan dan pakan. Di antara metode yang umum digunakan untuk mendeteksi fumonisin adalah enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Metode ini dikembangkan dengan menggunakan antibodi poliklonal atau antibodi monoklonal. Penggunaan antibodi poliklonal dalam ELISA sering menimbulkan kesalahan pembacaan karena adanya reaksi silang dengan senyawa lain yang memiliki struktur serupa dengan senyawa yang dianalisis, misalnya dengan fumonisin B2, B3, dan senyawa sfingolipid (sfingosin dan sfinganin). Di sisi lain, antibodi monoklonal (AbMk) memiliki spesifitas yang tinggi karena dihasilkan oleh klon yang berasal dari sel tunggal. Antibodi monoklonal dihasilkan dengan memproduksi hibridoma melalui fusi sel limfosit mencit hiperimun dan sel mieloma dengan bantuan polietilen glikol (PEG).
Penggunaan PEG ini sangat krusial dan sangat menentukan tingkat keberhasilan fusi sel. PEG bersifat toksik bagi sel, dan toksisitasnya ditentukan oleh bobot molekul. Umumnya PEG yang digunakan memiliki bobot molekul antara 600-6.000 (Zola 1987).
Azcona-Olivera (1992a) memproduksi antibodi monoklonal anti fumonisin melalui fusi sel limfosit mencit yang diimunisasi antigen FB1-CT dan sel mieloma NS-1 dengan bantuan PEG 1450 sebagai fusogen. Titer antibodi serum yang dihasilkan dari percobaan ini berkisar antara 3.200-6.400. Dengan menggunakan antigen yang sama, Yu dan Chu (1999) melaporkan bahwa AbMk
yang disekresikan oleh sel hibrdoma hasil fusi antara sel limfosit mencit hiperimun dengan sel mieloma menggunakan PEG 1500 dapat menstimulasi pembentukan antibodi dalam serum dengan titer 1.000-10.000. Sementara Barna-Vetro et al. (2000) menggunakan FB1-KLH untuk memproduksi antibodi monoklonal yang digunakan untuk mendeteksi kontaminasi fumonisin secara ELISA. Fusi sel limfosit dan mieloma Sp2/0-Ag14 dilakukan dengan menggunakan PEG 1600. Hibridoma yang dihasilkan dari fusi sel tersebut menghasilkan antibodi dengan titer 100.000.
Pada percobaan ini digunakan FB1-Ova sebagai antigen untuk menstimulasi pembentukan respon imun pada mencit. Sel mieloma yang digunakan untuk fusi adalah Sp2/0-Ag14 dengan PEG 4000 sebagai fusogen.
Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk produksi hibridoma yang dapat mensekresi antibodi monoklonal yang akan digunakan sebagai perangkat ELISA untuk mendeteksi fumonisin pada bahan pangan dan pakan.
MATERI DAN METODE
Bahan dan Alat
Pada percobaan ini digunakan mencit betina jenis BALB/c umur 6-8 minggu. Selain itu digunakan bahan biologis seperti sel limfosit mencit yang telah diimunisasi, sel mieloma Sp2/0-Ag14 (ATCC), sel pemberi makan (sel timus), dan foetal bovine serum (FBS, GibcoBRL 26140-087).
Medium dan bahan-bahan lainnya yang digunakan untuk kultur sel yaitu medium RPMI 1640 (Gibco P-1502), suplemen medium hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT, Sigma H-0262), hipoksantin-timidin (HT, Sigma, H- 0137), biru tripan (ICN cat. 19553), OPI (Sigma O-5003), dan MEM non essensial amino acid (NEAA, Sigma M-7145), sodium hidrogen karbonat (Merck K34323529 507), polietilen glikol (PEG) dengan bobot molekul 4000 (Calbiochem), dimetil sulfoksida (DMSO, Merck 8-02912-1000), L-glutamin (Sigma, G-3126), dan antibiotika penisilin-streptomisin (Meiji), phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4, buffer karbonat-bikarbonat pH 9,6 , asam sulfat (H2SO4), Tween-20, ammonium sulfat (Merck A189517 044), tris-HCl (GibcoBRL, cat.
15506-017), sodium fosfat (Merck A194678), asam sitrat (Univar, D3247), kit identifikasi imunoglobulin (Sigma), air deionisasi (dH2O) steril, dan nitrogen cair.
Seluruh bahan dan pereaksi yang digunakan pada percobaan ini disiapkan dengan prosedur seperti tercantum pada Lampiran 2. Untuk menghindari kontaminasi mikroba dan kapang, ke dalam medium HAT dan HT ditambahkan 100 µg/ml campuran antibiotika penisilin-streptomisin (PenStrep) dan 2,5 µg/ml fungizon. Pengujian sterilitas medium dilakukan dengan menginkubasi medium dalam pelat kultur jaringan (96 sumur) selama 24 jam pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5 %. Adanya kontaminasi diketahui melalui pengamatan fisik (kekeruhan) atau melalui pengamatan di bawah mikroskop.
Peralatan yang digunakan pada percobaan ini meliputi biohazard, inkubator CO2, botol kultur 25 cm2 dan 75 cm2, pelat kultur jaringan 24 dan 96 sumur (, pipet, pipet mikro multi channel, cawan petri, peralatan bedah, mikroskop, hemasitometer, alat penghitung sel, ELISA reader, dan spektofotometer.
Imunisasi
Imunisasi dilakukan dengan cara menyuntikkan imunogen FB1-Ova pada mencit BALB/c secara intra vena (iv). FB1-Ova (10 μg) disuntikkan secara intra vena (iv) pada ekor setiap minggu selama 3 minggu. Pada minggu ke-4 dilakukan pengujian titer antibodi secara ELISA tidak langsung. Pada minggu berikutnya, penyuntikan diulangi dengan dosis FB1-Ova yang sama. Tiga minggu setelah itu, imunisasi kembali dilakukan dengan menyuntikan separuh dari dosis sebelumnya (5 μg). Empat hari setelah penyuntikan terakhir, limpa mencit dipanen untuk difusikan dengan sel mieloma. Adapun jadual imunisasi yang dilakukan seperti terlihat pada Tabel 12.
Tabel 12 Program imunisasi mencit BALB/c dengan FB1-Ova secara intra vena
Perlakuan
Minggu
1 2 3 4 5 8 8+4 H
Kontrol - - - Uji Ab - - -
FB1-Ova 10 μg 10 μg 10 μg Uji Ab 10 μg 5 μg Fusi
Pengujian titer antiserum
Pengujian titer antibodi dilakukan pada minggu ke-4 setelah imunisasi.
Darah diambil melalui pembuluh vena mata dengan menggunakan pipet pastur steril. Serum dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 11.000 g selama 3 detik, dan pengujian antibodi dilakukan secara ELISA tidak langsung menggunakan prosedur seperti yang tercantum pada Lampiran 3. Sebelumnya dilakukan penentuan kondisi optimum dari antigen, antibodi (antiserum), dan enzim konjugat. Pada penentuan kondisi optimun digunakan pengenceran antigen 1:50, 1:100, 1:200, antiserum 1:5.000, 1:10.000, dan konjugat enzim (goat antimouse IgG-HRP) 1:20.000 dan 1:30.000. Selanjutnya, pengujian dilakukan menggunakan prosedur ELISA tidak langsung seperti diuraikan pada Lampiran 3.
Kondisi optimum ditentukan dengan memilih nilai optical density (OD) tertinggi yang dihasilkan oleh tiap komposisi antigen, antiserum, dan enzim konjugat.
Produksi hibridoma
Untuk pembuatan hibridoma dibutuhkan sel mieloma, sel limfosit dan sel pemberi makan (sel timus) yang dipersiapkan satu minggu sebelum pelaksanaan fusi sel.
Persiapan sel mieloma
Sel mieloma Sp2/0-Ag14 ditumbuhkan pada medium pertumbuhan (MP) yang mengandung 10% FBS dan antibiotika PenStrep 100 µg/ml hingga fasa logaritmik. Kultur sel mieloma diinkubasi pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5%
dan dipertahankan pada konsentrasi 105–2x106 sel/ml. Umumnya, pertumbuhan
optimum tercapai 7-10 hari setelah dikultur tergantung pada kondisi sel induk yang ditumbuhkan. Kultur sel yang baik dengan viabilitas di atas 95% digunakan untuk fusi dengan sel limfosit. Sel dikeluarkan dari botol kultur dengan menggunakan pipet hingga sebagian besar sel terlepas dari dinding botol dan disentrifus selama 5 menit pada kecepatan 1500 g. Medium dibuang dan endapan disuspensikan kembali dengan 10 ml RPMI. Jumlah sel dihitung di bawah mikroskop dengan menggunakan hemasitometer dan alat penghitung sel melalui pewarnaan biru tripan 0,1% (1:10). Untuk fusi sel, dibuat suspensi dengan konsentrasi 1 x 106 sel / ml.
Pembuatan sel pemberi makan (feeder cells)
Sel pemberi makan berfungsi sebagai suplemen untuk pertumbuhan sel yang terfusi (sel hibridoma). Sel pemberi makan diperoleh dari timus BALB/c normal berumur 6-8 minggu. Dua ekor mencit diterminasi dengan cara dislokasi tulang leher, kemudian dibedah untuk diambil timusnya. Timus dicuci dalam medium RPMI, dan sel dikeluarkan dengan cara merobek timus pada kedua ujungnya, kemudian medium dimasukkan kedalamnya hingga sebagian besar sel ke luar. Selanjutnya, suspensi sel disentrifus dan endapan dicuci dua kali dengan RPMI, lalu di disuspensikan kembali dengan medium pertumbuhan (MP). Sel ditumbuhkan dalam botol kultur steril (75 cm2) yang berisi 20-30 ml MP dan diinkubasi pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5%. Setelah 5-7 hari, sel yang sudah pada padat dipanen dan diambil supernatannya dengan jalan sentrifugasi, lalu disaring melalui membran nitroselulosa 0,22 μm untuk langsung digunakan sebagai suplemen pada medium HAT dan HT, atau disimpan pada suhu -20 oC hingga saat digunakan. Seluruh pekerjaan dilakukan dalam ruang steril (Biohazard).
Persiapan sel limfosit
Sel limfosit diperoleh dari limpa mencit yang diimunisasi dengan FB1 -Ova. Mencit diterminasi dengan cara dislokasi tulang leher dan dibasahi dengan alkohol 70%, selanjutnya pekerjaan dilakukan di ruang steril (Biohazard). Kulit bagian perut dibuka dengan gunting atau pisau bedah steril tanpa merobek lapisan
dalam. Dengan menggunakan gunting atau pisau bedah yang lain, lapisan dalam dibuka dan limpa diambil secara hati-hati tanpa menyentuh organ lainnya. Limpa diletakkan pada cawan petri steril yang berisi medium RPMI dan dicuci sekali. Sel dikeluarkan dengan cara menyuntikkan medium RPMI dan mengoyak limpa dengan syringe atau forsep. Selanjutnya suspensi sel tersebut disentrifus pada 1500 g selama 5 menit. Medium dibuang dan sel disuspensikan kembali dengan 10 ml RPMI. Sel dihitung di bawah mikroskop dengan menggunakan hemasitometer dan alat penghitung sel melalui pewarnaan biru tripan 0,1% (1:10), kemudian dibuat suspensi 1 x 108 sel / ml.
Fusi sel
Fusi sel limfosit dan sel mieloma Sp2/0-Ag14 dilakukan dengan menggunakan PEG 4000. Suspensi sel limfosit dan mieloma masing-masing 10 ml dicampurkan, ditambahkan RPMI hingga 40 ml dan dibagi ke dalam 2 tabung, kemudian disentrifus selama 5 menit pada kecepatan 1500 g. Supernatan dibuang dan pelet dilepaskan dari dasar tabung dengan diselentik secara perlahan-lahan, kemudian ke dalam tiap tabung ditambahkan larutan 1 ml larutan PEG 50% dalam DMSO-RPMI 15% tetes demi tetes dalam waktu satu menit. Setelah itu, secara perlahan ditambahkan 5 ml RPMI pada 5 menit pertama, 10 ml pada 5 menit kedua, 10–15 ml pada 5 menit terakhir dan ditambahkan RPMI hingga 40 ml.
Selanjutnya campuran sel disentrifus, supernatan dibuang, dan pelet dicuci dengan RPMI 2x40 ml. Sel disuspensikan kembali dengan 10 ml medium HAT, didistribusikan dalam mikroplat kultur jaringan (96 sumur), dan sebagiannya dimasukkan ke dalam botol kultur 75 cm2 sebagai master. Kultur sel disimpan dalam inkubator pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5%.
Pada hari ke- 4 atau hari ke-5, ke dalam tiap sumur ditambahkan 0,1 ml medium HAT. Setelah 9-10 hari, separuh medium diganti dengan medium HAT yang segar. Pada hari ke-10 sampai dengan hari ke-14 pertumbuhan sel diamati.
Jika terdapat pertumbuhan sel, pH medium akan berubah, sehingga medium yang semula berwarna merah akan berubah menjadi kuning. Pada saat itu dilakukan pengujian antibodi dari supernatan menggunakan metode ELISA tidak langsung
(Lampiran 3). Setelah 10 -14 hari, medium HAT diganti secara bertahap dengan medium HT. Seminggu kemudian jika sel telah tumbuh dengan baik, medium HT diganti dengan RPMI yang mengandung 10% FBS.
Kultur sel hibridoma positif yang mensekresikan antibodi dibuat duplikat dengan memindahkan sel ke dalam mikroplat kultur jaringan (24 sumur) dan botol kultur (25 cm2 dan 75 cm2). Sebagian sel segera disimpan pada suhu -70oC dan dalam nitrogen cair, sedangkan bagian yang lainnya dikloning untuk mendapatkan sekresi antibodi dari klon sel tunggal (antibodi monoklonal).
Kloning dan Kultur Sel Hibridoma
Kloning dilakukan untuk memastikan bahwa sel penghasil antibodi merupakan suatu koloni yang berasal dari satu sel. Untuk mendapatkan klon yang berasal dari satu sel hibridoma dilakukan pengenceran terbatas 1:102, 1:104 dan 1:106 hingga diperoleh satu sel pada setiap sumur (Zola, 1987). Sel hibridoma kemudian diperbanyak melalui kultur sel dalam 40 ml medium RPMI mengandung 10% FBS dan antibodi yang disekresikan dalam supernatan diuji dengan ELISA tidak langsung seperti diuraikan pada Lampiran 3.
Penyimpanan dan Uji Viabilitas Sel Hibridoma Penyimpanan
Sel hibridoma yang mensekresikan antibodi disimpan dalam medium RPMI yang mengandung 20% foetal bovine serum (FBS) dan 15% dimetil sulfoksida (DMSO). Suspensi sel dimasukkan ke dalam tabung penyimpanan dengan alikuat 1 ml/tabung dan disimpan dalam freezer bersuhu -70oC. Setelah satu malam tabung dipindahkan ke dalam nitrogen cair.
Uji viabilitas hibridoma
Sel beku yang telah disimpan dalam nitrogen cair dihangatkan dalam penangas air dengan suhu pada suhu 37oC hingga mencair dan segera diencerkan
dengan medium RPMI, kemudian disentrifus pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Endapan sel disuspensikan kembali dengan medium HT yang mengandung 10% FBS dan didistribusikan pada mikroplat 24 sumur. Sel diamati di bawah mikroskop dan sel hidup dihitung dengan menggunakan hemasitometer dan alat penghitung sel melalui pewarnaan biru tripan 0,1% (1:10). Selanjutnya pengamatan dan penghitungan jumlah sel hidup dilakukan setiap hari selama 7 hari.
Produksi dan Karakterisasi Antibodi Monoklonal Produksi antibodi secara in vitro
Sel yang telah disimpan dalam nitrogen cair ditumbuhkan kembali pada medium HT. Sebelumnya sel dicairkan dalam penangas air bersuhu 37oC dan segera dipindahkan ke dalam medium pertumbuhan (MP), kemudian disentrifus pada 11000 g selama 3 detik. Supernatan dibuang dan pellet disuspensikan kembali dengan medium HT dan didistribusikan ke dalam pelat kultur jaringan 24 sumur. Setelah pertumbuhan sel stabil (3-4 hari) dipindahkan ke dalam botol kultur 25 cm2. Setelah sel mencapai fasa logaritmik (6-7 hari), supernatan dipanen. Pada kultur berikutnya digunakan medium pertumbuhan dan supernatan terus dipanen setiap kali sel mencapai fasa logaritmik. Supernatan dikumpulkan untuk pengujian antibodi secara ELISA tidak langsung dan disimpan pada suhu -70oC hingga dilakukan pemurnian antibodi.
Produksi antibodi dalam cairan asites
Disiapkan 10 ekor mencit betina berumur 6 minggu dan dikondisikan selama satu minggu sebelum percobaan. Selanjutnya mencit disuntik dengan 0,5 ml pristan steril, 14 hari kemudian disuntikan sel hibrid (5x106 sel) intra peritoneal Seteleh 10-14 hari, cairan asites dipanen, disentrifus 5000 g selama 15 menit, dan supernatan dipisahkan dari endapan.
Purifikasi antibodi
Larutan ammonium sulfat jenuh dibuat dengan melarutkan 75 gram ammonium sulfat pada dalam 100 ml akuades. Supernatan dan cairan asites
diukur volumenya, ditambahkan larutan ammonium sulfat jenuh dengan volume yang sama secara perlahan sambil diaduk. Pengadukan diteruskan selama satu jam pada suhu 4oC. Selanjutnya campuran disentrifus pada 3000 g selama 15 menit.
Supernatan dibuang dan endapan dicuci dua kali dengan larutan ammonium sulfat jenuh, kemudian dilarutkan dengan akuades sebanyak setengah dari volume semula. Larutan didialisis selama tiga hari dalam larutan phosphate buffer saline (PBS) pH 7,6 dengan suhu 4oC. Pergantian buffer dilakukan setiap hari hingga ion sulfat tidak ada lagi yang diketahui dengan menambahkan larutan barium khlorida (Zola, 1987).
Pemurnian antibodi yang dihasilkan dari supernatan dan cairan asites dilanjutkan dengan menggunakan kolom HiTrap Protein A HP (Amersham).
Disiapkan buffer pengikatan (binding buffer) 20 mM sodium fosfat pH 7,0 , buffer pengelusi 0,1M asam sitrat pH 3-6, dan buffer tris-HCl pH 9,0. Sebanyak 10 tabung penampung fraksi diisi dengan 0,2 ml buffer tris-HCl pH 9,0. Kolom dikondisikan dengan 25 ml binding buffer dan dibilas kembali dengan 50 ml binding buffer. Sampel (2 ml) ditambahkan 8 ml binding buffer , dimasukkan ke dalam kolom, kemudian dicuci dengan 35 ml binding buffer. Imunoglobulin dielusi dari kolom dengan 20 ml buffer pengelusi dan 2 ml fraksi ditampung ke dalam botol penampung yang berisi buffer tris-HCl. Selanjutnya imunoglobulin diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm.
Karakterisasi antibodi monoklonal
Antibodi yang dihasilkan oleh sel hibridoma dikarakterisasi secara ELISA dengan antibodi penangkap menggunakan kit identifikasi subkelas imunoglobulin (Sigma) dengan prosedur kerja seperti diuraikan pada pengujian antibodi (Lampiran 4). Hasil ini dikonfirmasi dengan gel elektroforesis (SDS-PAGE) menggunakan bahan yang tercantum pada Lampiran 1.
HASIL DAN PEMBAHASAN Titer Antiserum
Melalui titrasi dapat diketahui bahwa kondisi optimum untuk pengujian antibodi secara ELISA tidak langsung tercapai pada pengenceran antigen FB1 -Ova 1:200, antiserum 1:5.000, dan goat antimouse IgG-HRP enzim konjugat komersial 1:20.000 (Lampiran 8). Kondisi ini digunakan untuk pengujian titer antibodi pada kegiatan selanjutnya.
Pengujian antibodi yang dilakukan pada minggu ke-4 menunjukkan adanya respon antibodi pada serum mencit yang diberi FB1-Ova 10 µg/ekor dengan titer 5.000 (OD450= 0,359-0,976). Hasil pengujian antibodi terhadap 10 sampel serum mencit secara ELISA tidak langsung disajikan pada Tabel 13. Dari tabel tersebut terlihat adanya respon antibodi pada serum mencit yang diimunisasi dengan FB1-Ova, di mana nilai OD lebih tinggi daripada serum kontrol negatif (OD=0,168) dan kontrol konjugat enzim (OD=0,139). Respon imun ini terbentuk karena adanya proliferasi sel B yang disebabkan oleh pemberian antigen FB1-Ova secara berulang. FB1 sebagai hapten membentuk epitop pada permukaan Ova sebagai protein pembawa sehingga dapat dikenali oleh sistem imun (Baratawidjaja 2004).
Titer antibodi yang dihasilkan pada percobaan ini setara dengan yang dilaporkan oleh Yu dan Chu (1999) yang menggunakan FB1-CT sebagai antigen.
Sedangkan dengan menggunakan antigen KLH diperoleh titer antibodi 100-1000 (Christensen et al. 2000). Namun, jika dibandingkan dengan titer antibodi jauh lebih rendah dengan yang dilaporkan oleh Barna-Vetro et al. (2000) yaitu 100.000, di mana antigen yang digunakan adalah FB1-KLH. Hal ini disebabkan oleh adanya perbedaan rantai FB1-KLH yang lebih panjang dan bobot molekul yang lebih besar dibandingkan dengan FB1-Ova. Menurut Wang et al. (2006) sensitifitas dan spesifitas antibodi yang dihasilkan tergantung pada panjang rantai antigen dan jenis protein pembawa yang digunakan. Semakin panjang rantai antigen, antibodi yang dihasilkan semakin sensitif.
Antiserum yang dihasilkan ini mengandung antibodi spesifik yang dapat bereaksi dengan antigen FB1-Ova sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi fumonisin secara imunoasai (ELISA).
Tabel 13 Respon antibodi yang terdeteksi pada serum mencit yang diimunisasi dengan FB1-Ova pada pengenceran 1:5.000
Kode serum Optical Density ( 450 nm)
Kserum (-) 0.168
Kserum (+) 1.394
Kkonjugat 0.139 Mencit-1 0.662 Mencit-2 0.634 Mencit-3 0.488 Mencit-4 0.455 Mencit-5 0.788 Mencit-6 0.618 Mencit-7 0.520
Mencit -8 0.676
Mencit -9 0.664
Mencit -10 0.785
Mencit -11 0.976
Mencit -12 0.512
Mencit -13 0.600
Mencit -14 0.423
Mencit -15 0.503
Mencit -16 0.879
Mencit -17 0.500
Mencit -18 0.487
Mencit -19 0.359
Mencit -20 0.974
Pertumbuhan Sel Mieloma
Sel mieloma (Sp2/0-Ag14) dikultur pada medium pertumbuhan (MP) yang mengandung 10% FBS mencapai fasa logaritmik pada hari 5 dan hari ke-6 dengan kondisi yang sangat baik untuk digunakan pada fusi sel. Gambar 22 menunjukkan pertumbuhan sel mieloma pada fasa logaritmik.
Gambar 22 Pertumbuhan sel mieloma Sp2/0-Ag14 pada fasa logaritmik dalam medium RPMI mengandung 10% FBS
Fusi Sel Limfosit Mencit dan Sel Mieloma
Mencit yang digunakan untuk fusi adalah mencit yang memberikan respon antibodi tertinggi (M-11). Pada pengamatan di bawah mikroskop sesaat setelah fusi dilakukan terlihat adanya interaksi antara sel limfosit dan sel mieloma.
Gambar 23 memperlihatkan adanya pembengkakan sel dan penggabungan sel sesaat setelah fusi, yang terjadi karena adanya pengaruh PEG yang berperan sebagai fusogen. Pada percobaan ini digunakan PEG 4000 untuk menghindari kemungkinan terjadinya toksisitas dan proses fusi dapat dilakukan dengan kecepatan normal. PEG dengan bobot molekul rendah bersifat toksik terhadap sel, sehingga proses fusi harus dilakukan secepat mungkin, sedangkan PEG dengan bobot molekul tinggi merupakan cairan yang sangat kental, sehingga proses fusi sulit dilakukan.
Fusi sel menyebabkan penggabungan sel limfosit-mieloma (hibridoma), limfosit-limfosit, mieloma-mieloma. Namun ada pula sel limfosit dan mieloma yang tidak terfusi yang bercampur dalam satu sumur. Untuk itu, perlu dilakukan seleksi sel dengan menambahkan medium HAT. Pada sistem HAT sel mieloma tidak dapat bertahan karena tidak memiliki enzim hipoksantin guanin fosforibosil transferase (HGPRT) untuk bertahan hidup melalui jalur penyelamatan, sedangkan sel limfosit umumnya berumur pendek. Dengan demikian hanya sel