BAB III METODE PENELITIAN
3.5 Cara Kerja Penelitian
3.5.1. Induksi akar dari eksplan daun
Eksplan daun tanaman ginseng jawa (Talinum paniculatum Gaertn.) dilakukan sterilisasi bertingkat dengan menggunakan larutan detergen selama 3 menit dan larutan klorox 10 % selama 4 menit kemudian dibilas dengan menggunakan akuades sebanyak tiga kali. Daun yang telah disterilisasi kemudian dipotong 1-2 cm dan ditanam dalam media MS padat yang mengandung zat pengatur tumbuh auksin IBA 2 ppm di dalam botol kultur selama 11 hari.
3.5.2. Sterilisasi ruang kerja
Laminar Air Flow (LAF) sebelum digunakan sebaiknya disemprot dengan alkohol 70 % dan dikeringkan dengan menggunakan kertas tissue. Kemudian lampu UV yang ada di dalam Laminar Air Flow (LAF) dinyalakan selama 15-20 menit. Sebelum menggunakan Laminar Air Flow (LAF), lampu UV dimatikan dan diganti dengan lampu neon.
3.5.3. Sterilisasi alat
Sterilisasi alat dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC, tekanan 1 atm selama 20 menit. Alat-alat yang disterilkan dengan menggunakan autoclave adalah botol kultur, cawan petri, gelas ukur, erlenmeyer, pinset, dan scalpel. Sebelum disterilisasi, alat-alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu. Untuk alat-alat pinset, scalpel, cawan petri setelah dicuci kemudian dikeringkan dan dibungkus dengan menggunakan kertas payung.
3.5.4. Pembuatan larutan stok mikronutrien (100 x konsentrasi)
Untuk pembuatan larutan stok mikronutrien dengan volume 100 mL (100 kali konsentrasi), maka tiap bahan kimia penyusun larutan mikronutrien ditimbang terlebih dahulu dengan menggunakan timbangan analitik. Daftar bahan kimia penyusun larutan mikronutrien dapat dilihat pada lampiran 1 dan dikalikan 100 x. Kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam erlenmeyer 200 mL yang berisi akuades sebanyak ±80 mL. Setiap kali memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan dengan menggunakan magnetic stirer. Larutan yang sudah jadi ditambah akuades hingga volumenya menjadi 100 mL, kemudian dimasukkan ke dalam botol, tutup dengan aluminium foil dan diberi label: MIKRO MS 100X, 1mL/L dan disimpan dalam lemari es.
3.5.5. Pembuatan larutan stok zat besi (40 x konsentrasi)
Untuk pembuatan larutan stok zat besi dengan volume 200 mL (40 kali konsentrasi), maka menimbang 1.492 mg/L Na2EDTA dan 1.112 mg/L Fe2SO4. 7H2O ditimbang terlebih dahulu dengan menggunakan timbangan analitik. Kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam dua erlenmeyer berbeda berisi 75 mL akuades. Larutan Fe2SO4. 7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian ditambahkan larutan Na2EDTA sedikit demi sedikit sambil diaduk hingga larutan tercampur dan berwarna kuning. Larutan yang sudah jadi dibiarkan dingin pada suhu kamar, kemudian ditambahkan akuades sampai volumenya menjadi 200 mL. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam botol, menutup dengan menggunakan aluminium foil dan diberi label: ZAT BESI MS 40X, 5 mL/L dan disimpan dalam lemari es.
3.5.6. Pembuatan larutan stok vitamin (50 x konsentrasi)
Untuk pembuatan larutan stok vitamin dengan volume 200 mL (50 kali konsentrasi), maka tiap bahan kimia penyusun larutan vitamin ditimbang terlebih dahulu dengan menggunakan timbangan analitik. Daftar bahan kimia penyusun larutan stok vitamin dapat dilihat pada lampiran 1 dan dikalikan 50 x. Kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam erlenmeyer 500 mL yang berisi akuades sebanyak 150 mL. Larutan yang sudah jadi ditambah akuades hingga volumenya menjadi 200 mL, kemudian dimasukkan ke dalam botol, menutup dengan aluminium foil dan diberi label: VITAMIN MS 50X, 4 mL/L dan disimpan dalam lemari es.
3.5.7. Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh auksin IBA 1000 ppm (100 mg/100 mL)
Untuk pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh auksin IBA 1000 ppm yaitu dengan menimbang sebanyak 0,1 g, kemudian memasukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL. Meneteskan larutan KOH 1N dan memanaskan sampai larut (jernih) sambil diaduk. Untuk mempercepat proses kelarutan maka ditambahkan akuades sebanyak 50 mL. Bila sudah larut kemudian ditambah dengan akuades sampai volumenya menjadi 100 mL. Memasukkan dalam botol dan menutup dengan aluminium foil dan disimpan dalam lemari es. Untuk membuat media MS dengan zat pengatur tumbuh IBA 2 ppm maka mengambil 2 mL/L
3.5.8. Pembuatan media kultur jaringan tanaman
Media yang digunakan pada penelitian ini adalah Murashige dan Skoog (MS) semi-solid sebagai media pertumbuhan akar dan media subkultur. Untuk pembuatan media MS dengan volume 1000 mL maka tiap bahan kimia penyusun makronutrien ditimbang terlebih dahulu sesuai resep. Daftar bahan kimia penyusun media MS dapat dilihat pada lampiran 1. Kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam erlenmeyer 1000 mL yang berisi akuades sebanyak 500 mL. Kemudian ditambahkan 1 mL mikronutrien, 5 mL larutan stok zat besi, 4 mL larutan stok vitamin, 100 mg myo-inositol, dan 30 g sukrosa. Selanjutnya ditambahkan zat pengatur tumbuh auksin ke dalam erlenmeyer. Setelah itu, pH larutan diukur sebesar 5,6-5,8 apabila terlalu asam ditambah KOH beberapa tetes dan apabila
terlalu basa ditambah beberapa tetes HCl. Setelah pH sesuai, ditambahkan akuades sampai volume 1000 mL dan 4 g agar-agar ke dalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan (sambil diaduk) sampai agar-agar larut. Dalam keadaan masih cair, media dibagi ke dalam beberapa botol kultur. Ditutup rapat dengan aluminium foil. Media disterilkan dalam autoclave pada suhu 1210C, tekanan 1,2 atm selama 15 menit. Setelah tekanan pada autoclave menunjukkan angka 0, media segera dikeluarkan dari autoclave (tidak boleh menunggu sampai dingin di dalam autoclave) dan disimpan di dalam ruang inkubator.
3.5.9. Subkultur
Akar adventif yang berumur 11 hari dengan panjang akar ± 2 cm disubkultur dengan cara mengambil daun beserta akar hasil induksi dan disubkultur pada cawan petri yang berisi media MS semi-solid (agar 0,4 %). Kemudian diinkubasi dan dilakukan subkultur dengan periode 2 minggu, 3 minggu, dan 4 minggu dalam kondisi gelap selama 10 minggu.
3.6.0. Uji KLT (Kromatografi Lapis Tipis)
Uji kromatografi lapis tipis dilakukan dengan cara menimbang 0,1 gram berat kering akar kemudian menggerus menggunakan mortar dan diberi 10 ml etanol 96 % selanjutnya dipanaskan selama 45 menit di dalam waterbath dengan suhu 800C, kemudian menotolkan sampel sebanyak 5 μL dengan menggunakan mikropipet pada plat KLT kemudian dilakukan elusi dengan menggunakan bejana yang berisi larutan 2-propanol:air dengan perbandingan (14:3) (Yachya, 2012). Untuk membandingkan keberadaan
kandungan saponin di dalam sampel maka dibuat larutan standart dengan cara mengambil 0,1 gr saponin standart dan dilarutkan ke dalam 1 mL etanol 96 % kemudian dilakukan elusi dengan menggunakan plat KLT. 3.6.1. Ekstraksi saponin
Eksplan yang telah dipanen ditimbang berat basah, kemudian memasukkan ke dalam oven untuk menghilangkan kadar air akar pada suhu 500C selama 7 hari kemudian menimbang berat kering akar adventif. Untuk mengekstraksi saponin akar adventif yang telah didapatkan ditimbang 0,1 gram kemudian digerus dengan menggunakan mortar hingga menjadi serbuk dan diberi 10 mL etanol 96 % selanjutnya dipanaskan selama 45 menit di dalam waterbath dengan suhu 800C, kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 365 nm (Stahl, 1985). Untuk mengetahui kandungan saponin yang didapatkan, maka terlebih dahulu dibuat kurva standar saponin dengan konsentrasi 2,5; 5; 7,5; 10 ppm dengan panjang gelombang 365 nm. Kurva standar yang diperoleh (Lampiran 5) menunjukkan hubungan antara nilai absorbansi dengan konsentrasi saponin, sehingga dapat diketahui kandungan saponin sampel dari nilai absorbansinya. Untuk mengetahui nilai saponin dalam mg/g (Suskendriyati et al., 2004)maka digunakan rumus:
S = Saponin di dalam sampel x fp Berat sampel