METODE PENELITIAN
3.3.3. Cara Pengambilan Sampel
commit to user
70 sampai besar sampel terpenuhi (Sastroasmoro, et al., 1995)
3.4. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas (independent variabel) : Kemoterapi neoadjuvant
2. Variabel tergantung (dependent variabel) : a. Tingkat Ekspresi LMP1 , CD4+ dan CD8+ b. Rasio CD4+/CD8+
3.5. Defenisi Operasional
1. Karsinoma Nasofaring (KNF)
Defenisi : Tumor ganas epitel skuamosa yang primernya terletak di nasofaring Alat ukur : Biopsi tumor primer
Cara ukur : Melihat hasil pemeriksaan patologi anatomi Hasil ukur : Karsinoma Undifferentiated
2. Kemoterapi neoadjuvant
Definisi : pemberian pengobatan kemoterapi dengan regimen Cisplatin dan 5 Fluorourasil satu seri (3 kali) dan dilanjutkan radioterapi dengan Cobalt 60.
Cara ukur : dosis kemoterapi Cisplatin 50 – 100 mg/BSI , 5 Fluorourasil 500 – 100 mg/BSI dan Radioterapi 66-70 Gy dengan dosis fraksi selama 33 kali.
commit to user
71 3. Ekspresi LMP1
Defenisi : Ekspresi protein LMP 1 pada KNF jenis Undiferentiated. Alat ukur : Imunohistokimia
Cara ukur : Imunoreaktivitas antibodi EBV – LMP CS 1-4 Lab Vision Hasil ukur : Nilai positif : warna coklat keemasan.
Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam skor histologi. Variabel skala ordinal. 4. Ekspresi CD4+
Definisi : ekspresi protein CD4+ pada KNF jenis Undifferentiated Alat ukur : imunohistokimia
Cara ukur : Imunoreaktivitas antibodi monoklonal mouse anti human CD4+ Hasil ukur : Nilai positif : warna kecoklatan pada membran sel limfosit T. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam skor histologis. Variabel skala ordinal. 5. Ekspresi CD8+
Definisi : ekspresi protein CD8+ pada KNF jenis Undifferentiated Alat ukur : imunohistokimia
Cara ukur : Imunoreaktivitas antibodi monoklonal mouse anti human CD8+ Hasil ukur : Nilai positif : warna kecoklatan pada membran sel limfosit T. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam skor histologis. Variabel skala ordinal. 6. Rasio CD4+/CD8+
Rasio CD4+/CD8+ merupakan nilai pengukuran status sistem imun . Rasio limfosit T yang mengekspresikan antigen CD4+ terhadap ekspresi antigen CD8+. Nilai ini umumnya dipakai untuk diagnosis dan staging dari penyakit yang menggambarkan sistem imun termasuk pada infeksi oleh EBV
commit to user
72 (http://www.monodofacto.com/fact/Dictionary ? measure) . Nilai rasio ekspresi CD4+/CD+ dinyatakan sebagai skala ordinal .
3.6. Alat Penelitian.
Alat penelitian yang dipakai pada penelitian ini yaitu :
1. Alat pemeriksaan THT Yaitu : lampu kepala, spekulum hidung, spatula lidah, pinset bayonet, kapas, lidokain efedrin 2 %.
2. Alat dan bahan melakukan biopsi nasofaring : tang biopsi ( blakesley forceps ), spekulum hidung, pinset bayonet, kapas, kasa, alat nasoendoskopi, xylocain spray 10%, PBS formalin, botol untuk menyimpan jaringan biopsi.
3. Bahan untuk pewarnaan jaringan nasofaring dengan tehnik imunohistokimia antara lain antibodi EBV- LMP 1 CS 1-4 Lab Vision, mouse monoclonal antibody anti human CD4+ dan mouse monoclonal antibody anti human CD8+
4. Alat untuk pengecatan imunohistokimia : Mikrotom, Poly L-Lysine glass slide (SIGMA), termometer, mounting media (Canada Balsem), microwave oven, inkubator, pipet mikro, deck glass, stop watch, humidified chamber, ruangan dalam kondisi kelembaban tinggi.
5. Mikroskop OLYMPUS seri BX 41
3.7. Cara Kerja
Penderita dengan kecurigaan KNF dilakukan biopsi nasofaring dengan bantuan nasoendoskopi. Jaringan yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi PBS formalin. Botol yang berisi jaringan dikirim ke
commit to user
73 Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Moewardi Surakarta untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan hematosillin eosin oleh dokter spesialis Patologi Anatomi.
Preparat dengan hasil bacaan histopatologi KNF jenis Undifferentiated, selanjutnya blok parafin dilakukan pemotongan setebal 4 mikron. Dari masing-masing kelompok blok parafin, dipotong menjadi 3 slide dan digunakan untuk pemeriksaan LMP1 , ekspresi CD4+ dan ekspresi CD8+. Ketiga slide dilakukan pengecatan imunohistokimia sebagai berikut :
1. Pemotongan blok parafin dengan tebal 4-5 mikron. Diletakkan pada slides poly-L-lysine selanjutnya dinkubasi pada suhu 37oC selama 1 malam (agar lebih merekat pada slides).
2. Deparafinisasi :
- Direndam dalam xylol I selama 5 menit - Direndam dalam xylol II selama 5 menit - Direndam dalam xylol III selama 5 menit - Direndam dalam xylol IV selama 5 menit
- Direndam dalam alkohol absolut selama 5 menit - Direndam dalam alkohol 95% selama 5 menit - Direndam dalam alkohol 70% selama 5 menit - Dicuci dengan aquadest selama 5 menit
3. Retrival antigen dilakukan pada microwave oven dengan buffer sitrat pH 6,4 pada suhu sedang selama 2 menit kemudian dilanjutkan pada suhu rendah selama 1 menit.
commit to user
74 4. Cuci dengan PBS selama 2 X 5 menit.
5. Tahapa quencing endogenous peroksidase yaitu dengan memasukkan slide-slide tersebut ke dalam metanol H2O2 0,3% selama 30 menit.
6. Cuci kembali dengan aquades/PBS selama 2 X 5 menit.
7. Langkah-langkah selanjutnya ini dilakukan dengan humidified chamber :
a. Diberikan blocking reagent, biarkan selama 30 menit dan cuci dengan aquadest / PBS 2 x 5 menit.
b. Ditambahkan antibodi primer yang telah dilarutkan sebelumnya dalam antibodi diluent ( 1:50 ), dan ditunggu selama 60 menit atau disimpan terlebih dahulu dalam kulkas pada suhu 4 0 C selama 18 jam dan dicuci dengan aquadest / PBS selama 2 x 5 menit.
c. Ditambahkan antibodi sekunder berlabel biotin, ditungu selama 30 menit, pada suhu 30 0 C, lalu dicuci dengan aquadest atau PBS 2 x 5 menit.
d. Ditambahkan substrat DAB (diamino Benzidine), ditunggu selama 5 menit, lalu cuci dengan aquadest / PBS 2 x 5 menit.
e. Dilakukan perwarnaan counterstain dengan hematocylin mayer selama 30 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir selama 2 – 5 menit
f. Ditempelkan deck glass pada mounting media
8. Masing-masing sampel diamati dengan mikroskop cahaya dan dievaluasi pada 9 lapang pandang dengan sebaran yang merata, kemudian dibuat reratanya.
commit to user
75 LMP1, ekspresi CD4+ antibodi yang digunakan adalah mouse monoclonal antibody anti human CD4+, dan ekspresi CD8+ antibodi yang digunakan adalah mouse monoclonal antibody Human CD8+ dengan pengenceran 1:100. Sistem deteksi enzimatis ABC ( Avidin Biotin Complex ) menggunakan enzim peroksidase dan DAB ( Diamino Benzidin ) sebagai substan enzim. Nilai positif ditunjukkan dengan warna coklat keemasan hingga tua.
Penilaian makna tingkat ekspresi LMP1, ekspresi CD4+, dan ekspresi CD8+ secara kuantitatif dinyatakan dalam Intensitas (I) dan Persentase (P) dan dinyatakan sebagai Skor Histologi ( SH ). Skor histologis dihitung dengan rumus uji statistik Mann-Whitney dengan rumus sebagai berikut :
(Tan,et. al., 2001)
Keterangan :
SH= Skor Histologis PS= Persentase Positif Sedang PK = Prosentase Positif Kuat IN = Intensitas Negatif IK = Intensitas Positif Kuat IS = Intensitas Positif Sedang IL = Intensitas Positif Lemah PN = Presentase Negatif
commit to user
76
Tabel 3.1. Nilai P ( prosentasi jumlah sel ).
Kisaran Grade
0 – 25 % 1 26 – 50 % 2 51 – 75 % 3 76 – 100 % 4
Tabel 3.2. Penilaian intensitas warna.
Intensitas Grade Reaksi warna IHC pada Membran Sel
Kuat 3 Coklat Tua Sedang 2 Coklat Muda Lemah 1 Kuning Keemasan Negatif 0 Biru - Ungu
(Budiani et al.,., 2006)
Interval nilai skor histologis Makna kualitatif
0,00 – 3,75 : Negatif
3,76 – 7,50 : Positif lemah
7,51 – 11,25 : Positif sedang
11,26 – 15,00 : Positif kuat
Skor histologi ekspresi LMP1, ekspresi CD4+ dan ekspresi CD8+ adalah kalkulasi grade intensitas dan prosentase.
commit to user
77 Penilaian intensitas dan prosentase dilaksanakan secara manual dengan mikroskop. Nilai skor histologis yang diperoleh berasal dari sembilan lapang pandang untuk masing-masing slide dan diambil nilai reratanya.