Alakomi HL, Skytta E, Saarela M, Mattila-Sandholm T. 2000. Lactic acid permeabilizes Gram- negatif bacteria by disrupting the outer membrane. J.
Appl. Environ. Microbiol. 66:2001-2005.
August EG. 2000. Kajia n Penggunaan Lipase Amobil dari Aspergillus niger pada Pembuatan Monoasilgliserol yang Bersifat Antibakteri dari Minyak Kelapa. Thesis Program Pascasarjana I P B. Bogor.
Bautista DA, Hill AR, Griffiths MW. 1993. An all natural approach to preserve cottage cheese. Modern Dairy 72 (1):12-13.
Best GK. 1999. Antibacterial Chemotheraphy. http://pharminto.com/publ/msb/ Newdrgs.html. (18 Agustus 1999).
Blaszyk M, Holley RA. 1998. Interaction of monolaurin, eugenol and sodium citrace on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms. Int.
J. of Food Microbiol. 39:175-183.
Blom H. 1997. Addition of 2,5% Lactate and 0,25% acetate control growth of
Listeria monocytogenes in vacuum-packed, sensory-acceptable servelat
sausage and cooked ham stored at 4 oC. Int. J. of Food Microbiol. 38:71-76. Bloomfield SF. 1991. Methods for Assessing Antimicrobial Activity. Di dalam:
Denyer S P, Hugo WB (ed). Mechanism of action of chemical biocides their
Brannen AL. 1993. Introduction to Use of Antimicrobials. Di dalam: Davidson PM, Branen AL (ed) Antimicrobial in Food. Marcel Dekker.New York.
Cabo ML, Braber AF, Koenreaad PM. 2002. Apparent antifungal activity of several lactic acid bacteria againts Penicillium discolor is due to acetic acid in the medium. J. of Food Protec. 65: 1309-1316.
Castilo A, Lucia LM, Mercado I, Acuff GR. 2001. In-plant evaluation of a lactic acid treatment for reductio n of bacteria on chilled beef carcasses. J. of Food
Protec, vol 64 no 5:738-740.
Chipley JR, Story LD, Todd PT. 1981. Inhibition of Aspergillus growth and extracellular aflatoxin accumulation by sorbic acid and derivative of fatty acid. J. Food Safety 3:109-120.
Cuesta M. 2000. Requirement of autolytic activity for bacteriocin- induced lysis.
Appl. and Env. Microbiology. 2000. p. 3174-3179.
Daeschei MA. 1989. Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use as food preservatives. Food Technology.
Davidson PM, Branen AL. 1994. Antimicrobials in Food. Marcel Dekker, New York.
D, Aost JY. 2000. Salmonella. Di dalam: Lund BM, Baird-Parker TC, Gould GW (ed). The Microbiological Safety and Quality of Food. Volume 3. Aspen Publisher Inc. Maryland.
Duxbury DD. 1986. Combination emulsifier/acidulant extend cheese seauce shelf life. Food Proc. 46(9): 38-39.
Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Depdikbud, Dirjen Dikti, PAU Pangan dan Gizi, IPB. Bogor.
Frazier WC, Westhof DC. 1987. Food Microbiology. McGraw Hill Publishing Iowa USA.
Garburtt J. 1997. Essentials of Food Microbiology. Arnold, London, Sydney, Auckland.
Gourama H, Bullerman B. 1995. Antimycotic and antiaflatoxigenik effect of lactic acid bacteria. J. of Food Protec. Vol. 57, No. 11: 1275-1280.
Granum PE, Baird – Parker TC. 2000. Bacillus species. Di dalam: Lund BM, Baird-Parker TC, Gould GW (ed). The Microbial Safety and Quality of
Food Vol II. Maryland: Aspen. Hlm 1029-1039.
Hasenhuetti G L, Hartel RW. 1997. Food Emulsifies and Their Applications. International Thomson Publishing. New York.
Hofvendahl K, Barebel H. 2000. Factor affecting the fermentative lactic acid production from renewable resources. Enzyme and Microbial Technology
26: 87-107.
Hugo WB, Russel AD. 1987. Pharmaceutical Microbiology. Blackwell Scientific Publication, Oxford.
Igoe RS, Hui YH 1996. Dictionary of Food Ingredient 3 rd ed Chapman and Hall, New York.
Indriyati W. 2004. Kajian Aktivitas Antimikroba Campuran Mono dan Diasilgliserol Hasil Pemanfaatan Destilat Asam Lemak Minyak Kelapa. Thesis Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Jay JM.1996. Modern Food Microbiology 5th edition. Chapman and Hall, New York.
Jenie BSL.1996a. Peranan bakteri asam laktat sebagai pengawet hayati makanan.
J. Ilmu dan Teknol. Pangan. 1 (2):60 – 73.
Jenie BSL, Fardiaz S, Tandriarto N. 1996b. Produksi kultur kering Lactobacillus
plantarum dan aplikasinya pada pengawetan ikan lamuru. Seminar Permi,
11 – 13 November 1996.
Jenie BSL. 1999. Peranan Bakteri Asam Laktat Sebagai Pangawet Pangan Non Fermentasi. Materi Pengajaran Mata Kuliah Bioteknologi Bakteri Asam Laktat. Program Studi Ilmu Pangan Program Sarjana Institut Pertanian Bogor.
Jenie BSL, Atifah N, Suliantari. 2001. Peningkatan keamanan dan mutu pindang ikan kembung (Rastellinger sp) dengan aplikasi kombinasi natrium asetat, bakteri asam laktat dan pengemasan Vakum. J. Ilmu dan Teknol. Pangan.
XII (1): 21 – 27.
Kabara JJ. 1993. Medium-Chain Fatty Acids and Esters. Di dalam: Davidson, P. M danA. L Branen (ed), Antimicrobial in Food 2nd ed. Marcel Dekker, New York.
Kanazawa A, Ikeda T dan Endo T. 1995. A novel approach to mode of action of cationic biocides morphological effect on antibacterial activity. J Appl
Bacteriol 78:55-60.
Kim JM, Marshall MR, Wei CI, 1995. Antibacterial activity in extracts of Camelia
japonica L. petals and its application to a model food system. J. Food
Protec. 1255-1260.
Leverentz B, et al. 2006. Biocontrol of the food-borne pathogens Listeria
monocytogenes and Salmonella enterica serovar poona on fresh-cut apples
with naturally occurring bacterial and yest antagonists. Appl. Environ.
Microbiol. 72 : 1135-1140.
Lisker N, Poster N. 1982. Antifungal activity of lauricidin and related compounds.
J. Food Safety 4:27-32.
Loessner M, Susane G, Sandra S, Siegfried S. 2003. A pediocin – producing
Lactobacillus plantarum strain inhibits Listeria monocytogenes in a
multispesies cheese surface microbial ripening consortium. App and Env.
Microbiol p. 1854-1857.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms. 10th Edition. Southern Illinois University Carbondale.
Magnusson J. 2003. Antifungal activity of lactic acid bacteria, Doctor’s dissertation, Departemen of Microbiology, Swedish University of Agricultural Science. Sweden.
Mappiratu. 1999. Penggunaan Biokatalis Dedak Kasar Dalam Biosintesis Antimikroba Monoasilgliserol Dari Minyak kelapa. Disertasi Program Pascasarjana IPB, Bogor.
Mappiratu. 2000. Pengaruh waktu reaksi alkoholisis terhadap rendemen dan aktivitas antimikroba etil ester minyak kelapa. Laporan Penelitian Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, Palu.
Mariani. N. 2001. Aplikasi bakteri asam laktat untuk meningkatkan keamanan dan umur simpan buah melon (Cucumis melo L.) olah minimal. Skripsi Fakultas Teknologi Hasil Pertanian, IPB. Bogor.
Moreau C, Moss M. 1997. Mould, Toxin and Food. John Wiley and Sons. Chichester. New York. Brisbane.
Ming X, Weeber GH, Ayres JW, Sandine WE. 1997. Bacterio cin applied to food packaging materials to inhibit Listeria monocytogenes on meats. J. Food
Sci. 62:413-415.
Murray PR, Rosenthal KS, Kobayashi GS, Pfallerial MA. 1998. Medical
Microbiology. Third edition. Mosby. London.
Nair MKM, Aboelezz H, Hoagland T, Venkitanarayanan K. 2005. Antibacterial effect of monocaprylin on Escherichia coli O157:H7 in apple juice. J. of
Food Protec. Vol. 69. No. 9: 1895-1899.
Oh DH, Marshall DL. 1994. Enhanced inhibition of Listeria Monocytogenes by glycerol monolaurat with organic acid. J. Food Science 59 (6): 1258-1261. Ouattara B, Ronald ES, Richard AH, Gabriel JP, Andre B. 1997. Antibacterial
activity of fatty acids and essential oil against six meat spoilage organisms. Int. J. of Food Microbiol 37: 155-162.
Pitt WM, Terence JH, Ron RH. 2000. Behavior of Listeria monocytogenes in pasteurized milk during fermentation with lactic acid bacteria. J. of Food
Protec. Vol. 63. No. 7: 916-920.
Pitt JT, Hocking AD. 1996. Current knowledge if fungi and mycotoxins associated with food commodities in Southeast Asia. Canberra: The Australian Centre for International Agricultural Research.
Portillo FGD. 2000. Molecular and Celuler Biology of Salmonella Pathogenesis. Di dalam Cary JW, John El., deppak B. Microbial Foodborne Disease. Technomic Publishing Co., Pennsylvania.
Rahayu WP. 1999. Kajian aktivitas antimikroba ekstrak dan fraksi rimpang lengkuas (Alpina galanga L. Swarts) terhadap mikroba patogen dan perusak makanan. Disertasi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor. Ryu JH, Kim H, Beuchat LR. 2005. Spore formation by Bacillus cereus in broth
as affected by temperatur, nutrien availability, and manganese. J. of Food
Salminen S, von Wright A. 2004. Lactic Acid Bacteria. Mercel Dekker Inc. New York.
Siswohutomo G. 2002. Upaya peningkatan kualitas dan daya guna limbah dedak padi melalui penerapan bioteknolgi. Laporan Hasil Penelitian Hibah Bersaing IX/2 Tahun Anggaran 2001/2002. Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, Palu.
Stratford M. 2000. Traditional preservatives-organic acids. Di dalam: Robinson RK, Batt CA, Patel PD, editor. Encyclopedia of Food Microbiology.
Volume 1. Academic Press , London.
Stiles ME, Wilhelm H. 1997. Lactic acid bacteria of food and their current taxonomy. Int. J. of Food Microbiol. 36 : 1-19.
Sudirman I. 2002. Biologi Molekular Bakteriosin. Materi kuliah bioteknologi senyawa antimikroba, Program Pascasarjana IPB. Bogor.
Supardi I, Sukamto. 1999. Mikrobiologi Dalam Pengolahan dan Keamanan Pangan. Alumni, Bandung.
Twillman TJ, White PJ. 1988. Influence of monoglycerides on the textural shelf life and dough rheologi of corn tortillas. Cereal Chem. 65 (3) : 253 – 257. Unda JR, Molins RA, Walker HW. 1991. Clostridium sporogenes and Listeria
monocytogenes: Survival and inhibition in microwave-ready beef roasts
containing selected antimicrobials. J. Food Sci. 56:198-205.
Wang LL, Yang BK, Parkin KL, Johnson EA. 1993. Inhibition of Listeria
monocytogenes by monoacyglycerols synthesized from coconut oil and
milk fat by lipase-catalyzed glycerolysis. J. Agric. Food Chem. 41:1000- 1005.
Zamfir. 1999. Purification and characterization of a bacteriocin produced by
Lactobacillus acidophilus IBB 801. J. Appl. Environ. Microbiol. 87: 923-
Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2004 sampai Pebruari 2006, yang dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Laboratorium Kimia dan Biokimia Pangan South East Asian Food and Agricultural Science and Technology Center (SEAFAST CENTER) IPB, Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fateta IPB Bogor, Laboratorium Naval Medicine Research Unit (NAMRU ) Jakarta, Laboratorium Elektron Mikroskop Biomaterial Fakultas MIPA, Universitas Indonesia, Jakarta
Bahan dan Alat Bahan
Bahan dasar yang digunakan dalam penelitian mencakup monoasilgliserol (MAG) minyak kelapa yang diperoleh dari Laboratorium Agroindustri Fakultas Pertanian Universitas Tadulako, dengan karakteristik sebagai berikut: MAG 65%, DAG 27%, FFA 1,5% dan TAG 6,5%. Kultur bakteri asam yang terdiri dari Lb.
plantarum, sa28k (sauerkraut), Lb. plantarum pi28a ( pikel), Lb. plantarum (kecap
ikan), Lb. coryneformis, dan Lb. brevis diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan - Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan dan Gizi, Fateta - IPB, sedangkan Lb. acidophilus diperoleh dari PAU (Pusat Antar Universitas) Pangan dan Gizi - UGM. Mikroba uji yang digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba adalah Escherichia coli (ATCC 25922) yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan SEAFAST Center IPB, sedangkan Bacillus
cereus (FNCC 057), Listeria monocytogenes (FNCC 0156) dan kapang Aspergillus
flavus (FNCC 6109)diperoleh dari PAU (Pusat Antar Universitas) Pangan dan Gizi
UGM.
Media pertumbuhan mikroba yang digunakan adalah medium PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrien Agar) dan medium PDB (Potato Dextrose Broth) (semuanya diperoleh dari Difco). Media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri asam laktat adalah MRS (de Mann Ragosa Agar,Oxoid), MRS modifikasi
(MRS + glukosa 2%, ekstrak khamir 2%, 1% tripton dan 1% tween). Bahan – bahan kimia yang digunakan adalah garam fisiologis (NaCl 0,85%), aquades, spiritus, alkohol 70% dan 98%, kristal violet dan minyak emersi serta buffer pH 4, 5, 6, dan 7.
Alat
Peralatan yang digunakan mencakup pompa vakum, oven analitik, vortex, autoklav, pH meter, neraca analitik, spektrofotometer, HPLC, GC, Scanning Elektron Mikroskop, sentrifus, cawan petri, coloni counter (alat hitung ), jarum ose, bunsen, pipet mikro, refrigerator, jangka sorong, inkubator, mikroskop, dan alat – alat gelas.
Metodologi Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap (Gambar 3.1), meliputi (1) seleksi bakteri asam laktat (BAL) yang memiliki efek sinergis terhadap MAG minyak kelapa, penentuan komposisi metabolit BAL-MAG pada berbagai rasio metabolit BAL-MAG minyak kelapa yang memberikan penghambatan tertinggi terhadap bakteri uji, (2) penentuan aktivitas antimikroba dari metabolit BAL-MAG minyak kelapa, (3) penentuan mekanisme kerja senyawa antimikroba metabolit BAL-MAG minyak kelapa, serta (4) penentuan stabilitas senyawa antimikroba pada pH dan suhu dan lama pemanasan yang berbeda serta (5) aplikasi metabolit BAL-MAG terhadap sistem pangan (tahu).
Seleksi BAL yang Bersifat Sinergi dengan MAG Minyak Kelapa Persiapan kultur stok BAL (Jenie et al. 2000)
Isolat BAL yang terdiri dari: Lb. plantarum sa28k (isolat saur kraut), Lb.
plantarum pi28a (isolat pikel), Lb. Plantarum (isolat kecap ikan), Lb.
Coryneformis, Lb. acidophilus, Lb. brevis masing- masing dipindahkan ke dalam
MRS Broth lalu diinkubasi selama 2 hari. Selanjutnya satu ose kultur diinokulasikan ke media agar tegak semisolid MRSA yang ditambah 1% CaCO3
lalu diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37 oC (kultur stok). Kultur stok disimpan dalam refrigerator bersuhu 4 oC.
dicampur
Jenis BAL terbaik
Rasio BAL-MAG terbaik
Gambar 3.1. Bagan Alir Pelaksanaan Penelitian
Isolat BAL: 1. Lb.plantarum sa28k 2. Lb.plantarum pi28a 3. Lb.plantarum kik 4. Lb.plantarum brevis 5. Lb.acidophilus 6. Lb.coryneformis
MAG minyak kelapa
Seleksi BAL yang bersinergi dengan MAG
Bakteri uji Listeria monocytogenes
Penentuan rasio BAL-MAG:
A) 40:1;B) 20:1;C)10:1;D) 5:1;E) 5:2; F) 5:2 G)5:3;H)5:4 dan I)5:5
Bakteri uji : Listeria monocytogenes
Aktivitas antimikroba:
Mikroba Uji :
L.monocytogenes; E.coli; S.Typhimurium; B.cereus; Aspergillus flavus.
Mekanisme kerja antibakteri:
-kebocoran protein, asam nukleat,
kebocoran ion (Ca2+ dan K+) serta perubahan morfologi sel (SEM)
Stabilitas BAL - MAG : terhadap pH, suhu dan lama pemanasan
pH: 4,5,6 dan 7
Suhu : 75,100 dan 121oC selama 10,20 dan 30 menit.
Aplikasi BAL-MAG pada sistem pangan (tahu):
- TPC
- Masa simpan pada suhu ruang
Penentuan nilai MIC :
Bakteri uji : S.Typhimurium; E.coli; L.monocytogenes, B.cereus
Persiapan kultur mikroorganisme uji
Pengujian aktivitas antimikroba dari metabolit BAL-MAG minyak kelapa dilakukan terhadap 4 jenis bakteri dan 1 jenis kapang. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Gram positif Listeria monocytogenes, bakteri pembentuk spora
Bacillus cereus, dan bakteri Gram negatif Salmonella Typhimurium, Eschericia
coli, dan kapang perusak pangan (A. flavus). Isolat bakteri dan kapang uji dibuka dari ampul secara aseptis kemudian ditambahkan NB untuk bakteri dan PDB untuk kapang sebanyak 1 ml sampai larut. Suspensi bakteri dan kapang dipipet dan dipindahkan dalam tabung lain yang berisi 5 ml NB dan 5 ml PDB selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC (bakteri) dan 25 oC (kapang) sampai terlihat adanya pertumbuhan. Setelah diamati adanya pertumbuhan, kultur digores dengan menggunakan ose pada NA untuk bakteri dan PDA untuk kapang (Fardiaz 1989). Kultur disimpan dalam NA dan PDA miring pada suhu 6 oC. Satu ose dari biakan agar miring diambil dan diinokulasikan ke dalam 10 ml NB dan 10 ml PDB kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37 oC (bakteri) dan 25 oC (kapang). Kultur ini yang selanjutnya digunakan pengujian antibakteri (Fardiaz 1989).
Persiapan kultur spora dilakukan sebagai berikut, kultur yang berumur 24 jam diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 10 ml NB, setelah itu diinkubasi selama 48 jam. Sebelum pengujian, dilakukan pemanasan spora pada suhu 80 oC selama 5 menit untuk menginaktivasi sel vegetatif. Konsentrasi spora yang digunakan sebanyak 106 CFU/ml (Fardiaz 1989).
Produksi metabolit BAL
Fermentasi untuk menghasilkan metabolit BAL berlangsung pada kondisi optimum, dan mengikuti cara Jenie et al. (2000) sebanyak 1-2 ose kultur BAL dari kultur stok masing- masing diinokulasikan ke dalam 10 ml MRS Broth, dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 hari (kultur induk). Sebanyak 4% (v/v) kultur induk tersebut dipindahkan ke dalam media MRS modifikasi (MRS ditambah 2% glukosa, 2% tripton dan 1% Tween 800) dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu 37
o
C (kultur kerja). Sebelum digunakan, media MRS modifikasi disterilisasi pada suhu 121 oC selama 20 menit.
Produk fermentasi dipisahkan dari massa sel dengan pemusingan yang berlangsung pada 10.000 ppm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipisahkan dari endapan, melalui penyaringan yang menggunakan membran milipore 0,22 µm secara aseptik sehingga diperoleh supernatan bebas sel.
Supernatan yang dihasilkan juga ditentukan pHnya, serta komposisi asam- asam organik dalam metabolit BAL dengan HPLC.
Penentuan aktivitas antibakteri campuran BAL-MAG dengan metode sumur (Carson dan Riley 1995)
Dari seleksi BAL akan diperoleh satu jenis isolat BAL yang bersinergi terbaik dengan MAG minyak kelapa. Supernatan BAL dicampur dengan MAG minyak kelapa dengan volume yang sama (1:1). Campuran yang dihasilkan selanjutnya diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995).
Penentuan Rasio Metabolit BAL-MAG Minyak Kelapa.
Untuk mengetahui metabolit BAL-MAG minyak kelapa yang optimum dalam menghambat pertumbuhan bakteri, dilakukan uji pada berbagai rasio metabolit BAL-MAG terhadap L. monocytogenes. Rasio metabolit BAL-MAG yang diujikan terdiri atas: 40:1 (A); 20:1 (B); 10:1 (C); 5:1 (D); 5:2 (E); 5: (F); 5:4 (G), dan 5:5 (H). Aktivitas penghambatan masing- masing terhadap bakteri uji diamati menggunakan metode difusi sumur (Carson dan Riley 1995). Rasio campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa yang memberikan daya penghambatan maksimum, akan digunakan untuk penelitian tahap selanjutnya.
Aktivitas Antimikroba Rasio Metabolit BAL-MAG Terpilih
Pengujian aktivitas antimikroba dari rasio BAL-MAG terbaik dari hasil penelitian sebelumnya dilakukan terhadap 4 jenis bakteri, yaitu E. coli (bakteri Gram negatif), S. Typhimurium (bakteri Gram negatif), L.monocytogenes (bakteri Gram positif), B. cereus (bakteri pembentuk spora) dan kapang A. flavus (kapang perusak pangan). Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode sumur (Carson dan Riley, 1995), sedangkan terhadap kapang dilakukan denganmetode uji kontak melalui pengukuran berat miselia (Parish dan Davidson, 1993).
Penentuan aktivitas antibakteri dari rasio BAL-MAG terpilih (Carson dan Riley, 1995)
Sebanyak 25 ml Nutrien agar (NA) yang mengandung bakteri uji dari akhir fase pertumbuhan yang berjumlah 106 CFU/ml dituang ke cawan petri, kemudian dibiarkan memadat. Setelah agak keras dibuat sumur dengan diameter 6 mm. Selanjutnya ke dalam sumur dimasukkan 60 µ l campuran metabolit BAL-MAG minyak kelapa dan diinkubasi selama 24 jam. Aktivitas antibakteri diukur berdasarkan diameter zona bening di sekitar sumur.
Pengujian aktivitas antikapang metabolit BAL-MAG (Parish dan Davidson, 1993)
Uji aktivitas antikapang metabolit BAL-MAG terhadap kapang penguji A.
flavus menggunakan metode kontak. Suspensi spora kapang dengan konsentrasi
106 CFU/ml diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 25 ml media PDB steril secara aseptik. Metabolit BAL-MAG pada berbagai konsentrasi (0, 5, 10, 15 dan 20%) dimasukkan ke dalam media, dan diinkubasi pada inkubator bergoyang agitasi 100 rpm pada suhu ruang selama 48 jam. Massa sel kapang yang tumbuh setelah 48 jam dipisahkan dengan penyaringan vakum menggunakan corong Buchner, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 100 oC sampai beratnya tetap. Sebagai kontrol adalah perlakuan tanpa penambahan metabolit BAL-MAG minyak kelapa. Jumlah reduksi masa sel kapang dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Masa sel kontrol – Masa sel metabolit BAL-MAG Reduksi masa sel =
Masa sel kontrol
Penentuan nilai MIC
Penentuan nilai MIC dimaksudkan untuk mengetahui konsentrasi terendah antimikroba metabolit BAL-MAG yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Penentuan nilai MIC dilakukan menggunakan metode Bloomfield (1991) dengan memplotkan antara ln konsentrasi antimikroba pada sumbu X dengan nilai kuadrat zona penghambatan (Z2) pada sumbu Y.
Perpotongan dari regresi linier Y = a + bX dengan sumbu X merupakan nilai Mt. Nilai MIC adalah 0,25 x Mt. Hasil perhitungan tersebut dikonfirmasi dengan metode Kubo et al. (1995) pada selang waktu kontak dan konsentrasi yang beragam. Metabolit BAL-MAG dicampur dengan kultur bakteri uji, yaitu L.
monocytogenes, B. cereus, E. coli dan S. Typhimurium dalam inkubator goyang
dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC selama 24 jam. Selanjutnya setelah inkubasi, jumlah mikroba dihitung dengan metode pemupukan (plating).
Mekanisme Kerja Antibakteri Metabolit BAL-MAG
Mekanisme kerja antibakteri dari campuran BAL-MAG terbaik dilakukan terhadap kebocoran protein dan asam nukleat, kebocoran ion- ion (Ca2+, K+) serta perubahan morfologi dan struktur sel L. monocytogenes, B. cereus dan S. Typhimurium.
Analisis kebocoran sel (Bunduki et al. 1995)
Analisis kebocoran sel dilakukan untuk mengukur derajat kerusakan dinding dan membran sel bakteri uji setelah dipapar dengan campuran BAL-MAG. Kebocoran sel diamati pada konsentrasi 0, 1 dan 2 MIC, dengan bakteri uji L.
monocytogenes, S. Typhimurium dan B. cereus. Kebocoran diamati dalam bentuk
kebocoran protein dan asam nukleat menggunakan alat Double Beam Spektrophotometer (Model U-2000 Hitachi Instruments, Inc, Westone, MA) masing- masing pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm. Panjang gelombang 280 nm digunakan untuk mengukur kadar nitrogen dari protein sel, sedangkan panjang gelombang 260 nm untuk mengukur kadar nitrogen asam nukleat.
Suspensi bakteri dari kultur murni yang telah ditumbuhkan selama 24 jam di dalam media NB, diambil 10 ml dan disentrifus dengan kecepatan putar 3500 rpm selama 20 menit. Filtrat dibuang dan endapan sel dicuci dengan buffer fosfat dalam tabung reaksi sebanyak 2 kali. Setelah itu ditambahkan metabolit BAL- MAG pada tingkat 0,1 dan 2 MIC, dishaker selama 24 jam pada suhu 37 oC untuk
S. Typhimurium dan B. cereus dan pada suhu ruang untuk L. monocytogenes. Suspensi disentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 20 menit, kemudian disaring dan supernatan yang diperoleh diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Kebocoran ion-ion diukur dalam bentuk ion Ca2+ dan K+ yang dilepaskan oleh sel bakteri akibat pemberian metabolit BAL-MAG minyak kelapa. Pengukuran kebocoran ion dilakukan pada berbagai dosis MIC. Kebocoran ion- ion K+ dan Ca2+ dideteksi dengan menggunakan AAS (Atomic Absorption
Spectrophotometer). Pelet sel hasil kontak dengan metabolit BAL-MAG minyak
kelapa dicuci dengan air bebas ion steril sebanyak 3 kali. Pelet yang telah bersih ditimbang, diabukan dengan cara pengabuan basah denga n menggunakan metode Park (1996).
Perubahan morfologi sel dengan SEM (JEOL 1995 ; Noer 2001)
Tujuan penelitian tahapan ini adalah untuk mengetahui perubahan morfologi dan struktur sel bakteri L. monocytogenes dan S. Thypymurium. Perubahan – perubahan yang diamati diantaranya perubahan penampakan sel secara umum, ketebalan dinding sel, ukuran sel dan lainnya yang dapat diamati menggunakan alat Scanning Electron Microscopy (SEM).
Metode SEM dilakukan dengan cara suspensi sel bakteri uji yang telah diberi perlakuan 0 MIC, 1 MIC dan 2 MIC diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC untuk S.
typhimurium dan suhu ruang untuk L. monocytogenes. Setelah itu disentrifus pada 3500 rpm selama 15 menit, supernatan dibuang dan diambil peletnya untuk kemudian dicuci dengan buffer fosfat sebanyak 2 kali. Pelet selanjutnya difiksasi dengan glutaraldehid 2,5% dalam (0,1 M buffer sodium cacodilat pH 7.2) dibiarkan selama 1,5 jam, dicuci dua kali dengan buffer cacodilat 0,05M pH 7,2 selama 20 menit untuk masing- masing perlakuan. Selanjutnya difiksasi dengan osmium tetraoxide 1% dalam buffer cacodilat 0,05%, pH 7,2 selama 1-2 menit lalu dicuci dengan akuabides (DDH2O) 3 kali masing- masing selama 2 menit, dikeringkan
dengan etanol pada berbagai konsentrasi yang dimulai dari konsentrasi 25, 50, 75 kemudian 100% sebanyak tiga kali masing- masing selama 10 menit. Spesimen diambil dan dilewatkan pada membran 0,2 µm untuk selanjutnya direkatkan pada stub alumunium dan dilapisi dengan emas melalui proses vakum (6-7 Pa) selama 20 menit. Sampel diamati di bawah Scanning Electron Microscopy tipe JEOL 5310.
Penentuan Stabilitas Aktivitas Metabolit BAL-MAG serta Aplikasi ke Sistem Pangan (Carson dan Riley, 1995)
Pada tahapan ini dilakukan penentuan stabilitas aktivitas antimikroba metabolit BAL-MAG terhadap berbagai pH medium, yaitu pada pH 4, 5, 6,dan 7 dengan menggunakan HCl 0,01 N atau NaOH 0,1 N dan suhu 75, 100 dan 121 oC