METODE PENELITIAN
3.7. Definisi Operasional
1. Data rekam medis adalah data yang mencakup keterangan klinis berupa usia, ukuran tumor, status KGB (ada/tidak metastasis ke KGB).
2. Status menstruasi pada penelitian ini diklasifikasi menjadi:
1. Pre-menopause, merupakan rentang usia reproduksi dari sejak menarche hingga terdapat efek gangguan hormonal (Harlow, et al., 2012).
2. Post-menopause, masa dimana seorang wanita tidak mendapatkan siklus menstruasi minimal 12 bulan, dengan asumsi masih memiliki organ uterus, dan tidak dalam keadaan hamil maupun menyusui (Harlow, et al., 2012).
3. Clinical staging adalah penentuan staging berdasarkan data rekam medik penderita kanker payudara, yang diklasifikasikan berdasarkan system staging AJCC yaitu sistem staging TNM (T = tumor; N = Nodul, M = metastasis).
4. Pemeriksaan mikroskopis adalah pemeriksaan terhadap sediaan slaid yang berasal dari blok parafin dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin untuk menentukan diagnosa histopatologi kanker payudara berdasarkan klasifikasi WHO (2012), berupa sub-tipe (karsinoma duktal, lobular, atau medulari, in- situ atau invasif), serta ada atau tidak metastasis ke KGB. Kemudian dievaluasi sistem penggradingan histopatologi berdasarkan sistem penggradingan Modified Scarf - Bloom and Richardson yang diperkenalkan oleh Elston (Rosai, 2011).
5. Invasive carcinoma of no special type (IC-NST), merupakan jenis keganasan payudara yang terbanyak (70-80%) dari semua kanker payudara primer.
Gambaran histopatologi Invasive carcinoma of no special type (IC-NST)
beragam. Arsitektur sel tumor IC-NST dapat berupa sel-sel tumor yang berkelompok, berupa cords, atau trabekula (Tavassoli and Devilee, 2003).
6. Invasive lobular carcinoma (ILC) merupakan 5-15% dari karsinoma payudara invasive. Insiden ILC pada wanita berumur di atas 50 tahun meningkat dalam waktu 20 tahun terakhir ini. Umur rata-rata penderita ILC berkisar 1-3 tahun lebih tua dibandingkan umur penderita IDC (Tavassoli and Devilee, 2003).
7. Histologic grading adalah sistem penggradingan Modified Scarf - Bloom and Richardson/Ellis-Elston Nottingham grading system (Nottingham grading system/NGS) Sistem penggradingan ini berdasarkan gambaran pembentukan tubular, gambaran inti (pleomorfik), dan jumlah mitotik, yang masing-masing diberi angka 1, 2, dan 3. Hasil penjumlahan skor bernilai 3 sampai 9, dan diberi tiga tingkatan sebagai berikut: grade I (well differentiated) 3-5 poin;
grade II (intermediate) 6-7 poin; dan grade III (poorly differentiated) 8-9 poin (Elston and Ellis, 1991).
8. TILs (IC-NSTIC-NSTTumor infiltrating leucocytes) mencerminkan respon imun lokal (anti-tumor immune response) dan merupakan kunci mekanisme pengontrolan progresif kanker. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Kreike, et al. (2007) yang diberi skor sbb.: skor 0 bila tidak terdapat sebukan sel radang, skor 1 bila sebukan sel radang minimal, kurang dari 10 leukosit/LPB (pembesaran 40X), skor 2 bila sebukan sel radang leukosit mudah ditemukan, namun tidak berkelompok, dan skor 3 bila sebukan sel radang leukosit massif, berkelompok dan terdapat pada lebih dari 50% luas tumor. TILs dapat dibedakan menjadi: (1). Leukosit yang menginfiltrasi stroma tumor (TILs stromal) dan (2). Leukosit yang menginfiltrasi
pulau-pulau sel tumor (TILs intra-tumor) (Melichar, et al., 2014). Untuk menilai sebukan sel radang leukosit (TILs) (pembesaran 40X) yang diberi skor sebagai berikut: skor 1 bila terdapat sebukan sel radang leukosit intra-tumoral, dan skor 2 bila sebukan sel radang leukosit ekstra tumoral.
9. Kanker payudara triple negative (TNBC) pada penelitian ini adalah sub-tipe molekuler kanker payudara berdasarkan pemeriksaan imunohistokimia yang tidak menampilkan ER, PR maupun HER2/Neu. Klasifikasi molekuler TNBC berdasarkan pemeriksaan imunohistokimia di bagi atas:
9.1 Sub-tipe Claudinlow (stem cells-like), ditandai penurunan tampilan protein tight junction dan adhesi interseluler seperti claudin-4, claudin-7 dan claudin-3, occludins, E-cadherin (semuanya berupa petanda diferensiasi sel epitel luminal), namun terdapat tampilan positif untuk petanda EMT (epithelial-mesencymal transition), gen respon imun serta gambaran CSC (CD44+/CD24–/low, CD49f+/EpCAM–/low; ALDH-1) (Creighton, et al., 2009; Prat, et al., 2010; Lim, et al., 2010). Walaupun sub-tipe claudin low dan basal-like mirip (contohnya: tampilan HER2 rendah), namun kedua sub-tipe ini jelas sangat berbeda. Claudin low kurang menampilkan gen untuk proliferasi dan siklus pertumbuhan tumor cendrung lebih lambat dibandingkan sub-tipe basal-like (Prat, et al., 2010). Pada penelitian ini digunakan CD44, CD24, Claudin-7, Twist-1 sebagai petanda sub-tipe stem cell-like (Zhao, et al., 2013; Collinn, et al., 201]5).
9.2 Karsinoma basal-like, ditandai dengan tampilan ER–, HER2–, Ck5, Ck5/6 dan/atau EGFR+ (Sorlie, et al., 2003; Nielsen, et al., 2004; Shiu, et al., 2008). CK5 lebih sensitif untuk menampilkan phenotype basal-like tumor
dibandingkan CK5/6 (Bhargava, et al., 2008). Pada disertasi ini, untuk menentukan sub-tipe karsinoma basal-like, digunakan pewarnaan imunohistokimia Ck5, EMA dan E-Cadherin (Nielsen, et al., 2004).
9.3 Sub-tipe luminal digunakan pewarnaan immunohistokimia Ck8/18 (Wang, et al., 2013).
9.4 Sub-tipe IFNRich ditandai dengan tampilan imunohistokimia IFN-αR(II) (Saidi, et al., 2007).
9.5 Sub-tipe IGFHigh ditandai dengan tampilan imunohistokimia IGF-1R (Mancini, et al., 2014).
10. Petanda kanker payudara ditampilkan dengan menggunakan antibodi sbb.:
No. Antibodi Clone Dilution Tertampil pada
1 ER 6F11, Dako 1:100 Inti
2 PR PgR 636, polyclonal Ab, Dako 1:200 Inti
3 HER2 A0435, polyclonal Ab, Dako 1:200 Membran sel 4 TWIST-1 H-81, Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz CA
1:100 Membran sel 5 CK5 XM26, Novocastra-Vision
Biosystems, Norwell, MA
1 : 25 Sitoplasma sel 6 CK8/18 5D3, Lab Vision, USA 1:300 Sitoplasma sel 7 Claudin-7 NBPI-35677, Rabbit polyclonal
antibody,Novus Biological
1:100 Membran sel 8 E-Cadherin NCH-38; M3612, monoclonal
primary antibody,
DakoCytomation, Denmark
1:50 Membran sel
9 EMA E29, mononclonal antibody, DAKO
antibody Cat# sc-713, lot C3005
1:100 Membran sel /sitoplasma
11. Petanda imunohistokimia CSC digunakan antibodi monoklonal:
No. Antibodi Clone Dilution Tertampil
pada 1 CD44 DF1485, Novocastra Laboratories
Ltd., Newcastle upon Tyne, UK
1:100 Membran sel 2 CD24 C-20, Santa Cruz Biotechnology,
Palo Alto, CA, USA
1:100 Membran sel
12. Untuk menilai indeks proliferasi digunakan Ki-67 (clone SP6, neomarkers, dilution 1:100) yang tertampil positif pada inti sel.
10. Pemeriksaan imunohistokimia adalah suatu teknik pemeriksaan di laboratorium Patologi Anatomi yang dilakukan untuk mendeteksi antigen (contohnya protein) pada sel maupun jaringan dengan menggunakan prinsip antibodi yang mengikat secara khusus terhadap antigen pada jaringan.
Pemeriksaan dilakukan menggunakan mikroskop cahaya Olympus CX21 dengan pembesaran 40 X dan 400X.
Antibodi primer dideteksi dengan menggunakan antibodi sekunder horseradish peroxidase polymer (Cytomation Envision System HRP; DAKO, Carpinteria, California, USA), atau biotinylated goat anti-polyvalent dan streptavidin-peroxidase complex (Thermo Fisher Scientific, Fremont, California, USA), berdasarkan petunjuk dari perusahaan. Kedua metode tersebut menggunakan diaminobenzidine sebagai chromogen.
11. Penilaian hasil perwarnaan imunohistokimia dinilai secara semikuantittif.
11.1 Estrogen receptor (ER) dan Progesteron receptor (PR) merupakan reseptor hormonal. Penilaian hasil perwarnaan imunohistokimia untuk ER dan PR pada kanker payudara, berdasarkan ASCO/CAP guidelines tahun 2010,
dimana hasil perwarnaan dianggap positif jika paling sedikit 1% dari sel tumor terwarnai positif pada inti sel (Hammond, et al., 2010).
11.2 Pewarnaan HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor-2) diberi skor sesuai dengan guidelines the American Society of Clinical Oncologists (ASCO) and College of American Pathologists (CAP) tahun 2006, untuk penilaian status HER2 secara semi-kuantitatif, dimana skor: 0 bila tidak terwarnai, 1+ bila > 10% sel tumor yang terwarnai lemah pada sebagian membran sel, 2+ terwarnai sedang (moderately strong) pada > 10%
membran sel tumor, dan 3+ bila terwarnai kuat pada >10% membran sel tumor (Hicks and Schiffhauer, 2011).
11.3 Claudin-7 merupakan salah satu protein tetraspanin membran, yang secara normal dikaitkan dengan tight junctions sel epitel yang mengatur permeabilitas barier trans-epitel. Claudin-7, tertampil pada sel epitel payudara manusia dan juga pada sebagian sel tumor payudara (Blackman, et al., 2005). Tampilan pewarnaan imunohistokimia claudin-7 tertampil positif pada membrane sel tumor. Penilaian tampilan imunohistokimia dinilai berdasarkan skor : 0 bila tidak menampilkan warna kecoklatan pada membran sel; 1+ bila 1-10% sel tumor yang terwarnai positif; 2+ bila 10-30% sel tumor yang terwarnai positif; dan 3+ bila > 10-30% sel tumor yang bereaksi positif kuat (Bernardi, et al., 2012).
11.4 Twist merupakan suatu faktor transkripsi basic helix-loop-helix class, yang pada dasarnya Twist berperan penting dalam pengaturan morfogenesis pada masa embrionik, pada kanker payudara Twist juga berperan sebagai onkogenik. Pewarnaan imunohistokimia Twist tertampil positif pada
membran sel tumor. Penilaian hasil perwarnaan didapat dari perkalian antara skor luas tampilan dengan intensitas tampilan. Dimana luas tampilan perwarnaan Twist diberi skor 0 – 3. Skor 0 bila tidak terwarnai; skor 1 bila <
25% sel tumor yang terwarnai positif; skor 2 bila 25 - 50% sel tumor yang terwarnai positif; skor 3 bila > 50% sel tumor terwarnai positif. Intensitas perwarnaan diberi skor 0 bila sel tumor tidak terwarnai; skor 1 bila terwarnai lemah; skor 2 bila terwarnai sedang; dan skor 3 bila terwarnai kuat. Evaluasi tampilan Twist bila jumlah skor <6 artinya tampilan pewarnaan imunohistokimia Twist lemah dan bila jumlah skor >6 menunjukkan tampilan pewarnaan imunohistokimia Twist kuat (Kyo, et al., 2006).
11.5 Ck5 adalah basic (type II) keratin polypeptides dengan berat molekul 58 kDa.
Ck5 merupakan petanda untuk sel basal yang digunakan dalam panel karsinoma payudara dengan phenotype basal-like (Bhargava, et al., 2008).
Penilaian pewarnaan imunohistokimia Ck5 positif bila ≥ 10% sel tumor menampilkan warna coklat.
11.6 Ck8/18 adalah keratin filamen intermediate tipe II yang dijumpai pada sel epitel sebagian besar karsinoma termasuk jaringan payudara. Hasil pewarnaan imunohistokimia CK8/18 tertampil pada sitoplasma sel.
Penilaian pewarnaan imunohistokimia Ck8/18 positif bila ≥ 10% sel tumor menampilkan warna coklat.
11.7 Penilaian E-cadherin menggunakan 4 skala pengukuran untuk intensitas pewarnaan (dibandingkan dengan kontrol penilaian dari pabrikan) yaitu : 0 = jika pewarnaan tidak tertampil; +1 jika tertampil lemah dan heterogen; +2 jika tertampil lemah namun homogen; +3 jika tampilan sedang, atau jika
tertampil kuat namun heterogen; dan +4 jika tertampil kuat dan homogen.
Persentase luas tampilan diberi skor 0 – 3. Dimana skor 0 jika tidak tertampil; skor 1 jika tampilan pada membran < 10%; skor 2 jika tampilan pada membran seluas 10-50%; dan skor 3 jika tampilan pada membran >
50% (Singhai, et al., 2011).
Hasil perwarnaan E-cadherin dinilai dari perkalian intensitas pewarnaan dengan persentase luas tampilan yaitu: negatif adalah skor 0; tampilan lemah bila total skor 1-4; tampilan sedang bila total skor 5-8; dan tampilan kuat jika total skor 9-12 (Singhai, et al., 2011).
11.8 Epithelial membrane antigen (EMA). Dikenal juga sebagai MUC1. EMA merupakan salah satu glycoproteins yang dijumpai pada human milk fat globule membranes (HMFGP). Penilaian tampilan imunohistokimia EMA dilakukan secara dikotomik yaitu tertampil positif atau tertampil negatif.
Pewarnaan imunohistokimia EMA tertampil positif pada sitoplasma sel epitel sekretori tumor payudara.
11.9 Interferons (IFNs) bersifat anti-proliferatif dan immunoregulatory yang berperan berperan sebagai anti-tumoral dan apoptotik, aktifitasnya dimodulasi melalui ligand permukaan sel yang spesifik berupa reseptor IFN-α, -β, and -γ. Hasil pewarnaan imunohistokimia tertampil positif pada membran sel tumor. Intensitas pewarnaan di-grading dengan skala 0-2, dimana: skor 0 bila tertampil pada < 25% sel tumor, skor 1 bila tertampil pada 26-50% sel tumor, dan skor 2 bila tertampil pada 51-100%. Skor 0 dan 1 dianggap sebagai tampilan lemah (low) dan skala 2 adalah tampilan kuat (high) (Saidi, et al., 2007).
11.10 Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) merupakan transmembrane tyrosine kinase yang terlibat dalam pertumbuhan dan proliferasi sel tumor serta resistensi terapi. Sub-tipe IGF high TNBC pada penelitian ini dikenali dengan pemeriksaan imunohistokimia IGF-1R (Type 1 insuline-like growth factors receptor). Ekspresi IGF-1R dapat tertampil pada membran, sitoplasma maupun inti. Intensitas pewarnaan di-grading dengan: skor 0 bila negatif, skor 1 bila tertampil lemah, dan skor 2 bila tertampil sedang, dan skor 3 bila tertampil kuat. Luas tampilan diberi skor: skor 0 bila negatif, skor 1 bila tertampil positif pada < 25%, skor 2 bila tertampil 25-50%, skor 3 bila tertampil 51-75%, dan skor 4 bila tertampil > 75%. Ekspresi IGF-1R dinilai berdasarkan skor imunoreaktif hasil perkalian antara intensitas (skor 0-3) dan persentase luas tampilannya (skor 0-4), dengan range 0-12. Internalised IGF-1R (skor 0-24) di skor dengan penjumlahan ekspresi IGF-1R pada sitoplasma dan inti, dan total IGF-1R (skor 0-36) merupakan penjumlahan ekspresi IGF-1R pada membran, sitoplasma dan inti.
11.11 Ki-67 merupakan protein dalam inti sel yang akan meningkat pada saat pembelahan sel. Antibodi Ki67 yang digunakan dari Dako (clone MIB-1, code M7240, monoclonal mouse anti-human, dilution 1:150). Indeks proliferasi Ki-67 dinilai pada daerah yang paling banyak menampilkan Ki-67 pada inti sel. Jumlah sel yang dihitung sejumlah 100 sel (termasuk baik sel yang berproliferasi maupun yang non-proliferasi), dan persentase proliferasi sel dihitung dan dilaporkan dalam persen proliferasi sel (Ferguson, et al., 2013). Penilaian hasil perwarnaan imunohistokimia Ki-67 dinilai sebagai variabel kategorik dengan nilai cut-off point ≥ 10% sel yang terwarnai pada
inti sel (Cheang, et al., 2009; Yerushalmi, et al., 2010). Penilaian tampilan imunohistokimia Ki-67 sebagai varibel kontinu juga dilakukan berdasarkan proporsi sel tumor yang terwarnai positif (nilai 0-100%) tanpa memperhatikan intensitas perwarnaan (Rakovitch, et al., 2010).
11.12 Penilaian pewarnaan imunohistokimia CD44 dan CD24 berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ricardo, et al. (2011). Pewarnaan imunohistokimia CD44 dan CD24 tertampil pada membran sel tumor, dengan pemberian skor sebagai berikut: skor 0 bila tidak tertampil warna coklat atau hanya < 10% sel tumor yang tertampil positif, skor 1 bila 10-25% sel tumor yang tertampil positif, skor 2 bila 25-50% sel tumor yang tertampil positif, dan skor 3 bila > 50% sel tumor yang tertampil positif.
Intensitas pewarnaan diberi skor 0 bila tidak terwarnai, skor 1 bila tertampil coklat lemah, skor 2 bila menampilkan warna coklat sedang, dan skor 3 bila terwarnai coklat kuat. Penilaian hasil perwarnaan dinilai berdasarkan perkalian antara persentase luas tampilan sel yang terwarnai positif dan intensitas pewarnaan (Benardi, et al., 2011). Hasil perwarnaan adalah sbb.:
skor 0 adalah negatif (bila tidak tertampil warna coklat), skor 1-3 adalah positif 1 dengan tampilan yang lemah, skor 4-6 adalah positif 2 tampilan sedang, dan skor 7-9 adalah positif 3 tampilan kuat.
Gambar 3.2 Pewarnaan imunohistokimia positif untuk CD24, dan
3.8 Keandalan
Pemeriksaan imunohistokimia untuk petanda kanker payudara (ER, PgR, HER2, claudin-7, Twist, CK5, CK8/18, E-cadherin, Vimentin, EMA, IFNR-α(II), IGF-1R), indeks proliferasi Ki-67, serta petanda CSC (CD44 dan CD24) dilakukan oleh dua ahli patologi dan peneliti secara tersamar.