TINJAUAN PUSTAKA
5. Unclassified breast carcinoma
2.4 Sel Punca Payudara (Mammary Stem Cells/MaSCs) .1 Mammopoeisis
2.4.3 Tingkat perkembangan diferensiasi epitel payudara
Penelitian dengan mengimplantasikan sel epitel dan fibroblast immortal pada bantalan lemak payudara tikus resipien NOD/SCID/IL2Rγ-/-, menunjukkan bahwa hanya sub-populasi CD49fhiEpCAM+ yang mampu beregenerasi dan mengalami self-renewal, walaupun kemampuan self-renewal minimal (Lim, et al., 2009).
Pada penelitian in-vitro, phenotype CD49fhiEpCAM- beregenerasi membentuk struktur tunas mirip TDLU (Villadsen, 2007). Penggunaan petanda permukaan sel secara kombinasi diterapkan untuk mengisolasi sub-populasi epitel pada tikus percobaan maupun manusia untuk mengenal tahap perkembangan sel pada jaringan payudara (Gambar 2.31) (Visvader, 2009).
Gambar 2.31 Model hirarki diferensiasi pada epitel payudara. Petanda permukaan sel primer digunakan untuk mengisolasi sel epitel pada tikus percobaan (warna biru) dan manusia (warna merah). Pada umumnya progenitor disebut juga sebagai sel progenitor yang bipoten dengan hirarki sel punca dan sel progenitor bipoten. Pada saat hamil, sel progenitor alveolar menunjukkan kemampuan yang bipotensial (Visvadar, 2009)
ITGA6 (Alpha-6 intergrin) yang identik dengan CD49f α6β1 (VLA-6) merupakan protein permukaan sel yang teridentifikasi pada sel punca payudara tikus dewasa (Stingl, et al., 2006), dan sub-populasi tumorigenik pada cell line MCF-7 kanker payudara (Cariati, et al., 2008), sama seperti CSC yang mengatur glioblastoma (Lathia, et al., 2010).
Sel punca payudara (MaSCs) dipercaya sebagai sel progenitor untuk cell lines mioepitel maupun epitel luminal (duktus dan alveolar), namun jumlah pasti maupun peralihan alaminya masih belum jelas diketahui. Sub-populasi progenitor luminal yang menjadi sel duktus maupun alveoli, tergantung pada stage perkembangannya (masa pubertas atau kehamilan). Populasi MaSCs pada manusia tidak mengekspresikan ER maupun PR, meskipun hormon estrogen dan
2006; Lim, et al., 2009). MaSCs juga tidak mengekspresikan ErbB2/HER2 (Carey, et al., 2007).
2.4.3.1 CD44
CD44 adalah glikoprotein transmembran multifungsional kelas satu (Naor, et al., 2008) yang berfungsi sebagai reseptor asam hialuronik, mempromosi migrasi sel normal, serta tertampil pada hampir seluruh sel kanker dalam bentuk standar maupun varian-nya (Ponta, et al., 2003), berupa protein yang memonitor perubahan ekstraseluler dan pengaturan adhesi sel, proliferasi, pertumbuhan, keselamatan (survival), pergerakan, migrasi, angiogenesis, dan diferensiasi sel (Du, et al, 2008; Naor, et al., 2008). CD44 juga mempresentasikan sitokin dan kemokin ke reseptor membran sel (Naor, et al., 2008). CD44 berinteraksi dengan osteopontin, dan mengatur fungsi seluler yang mengawali pembentukan tumor (Rangaswami, et al., 2006). Bila berinteraksi dengan P-selectin atau L-selectin, CD44 yang tertampil pada permukaan sel kanker membantu penyebaran secara hematogen (Napier, et al., 2007).
CD44 mempunyai fungsi aktifitas fisiologi pada sel normal dan sel punca.
Gen CD44 sering mengalami pemotongan dan penyambungan alternatif membentuk kode protein yang berlainan untuk sub-tipe kanker yang berbeda (Rangaswami, et al., 2006). Oleh karena itu, CD44 digunakan sebagai petanda permukaan untuk mengisolasi CSC pada sebagian besar kanker seperti kanker payudara, prostat, pankreas, ovarium, dan kolorektal (Du, et al., 2008; Bapat, 2010). Namun demikian, masih terdapat perdebatan dalam validasi kadar tampilan CD44 dan hubungannya terhadap prognosis penyakit. Kegunaan CD44 sebagai
petanda CSC masih belum jelas (Slomiany, et al., 2009). Pada beberapa kanker CD44 berperan dalam mengawali dan mempromosi tumorigenesis (Godar, et al., 2008; Leung, et al., 2010), metastasis (Visvader and Lindeman, 2008; Weber, et al., 2002; Gunthert, et al., 1991).
Protein CD44 adalah molekul rantai tunggal yang terdiri dari domain ekstraseluler terminal-N, suatu bagian proksimal membran, domain transmembran, dan satu bagian ekor di sitoplasma. Ligand utama CD44 adalah asam hialuronik, yang merupakan suatu komponen ekstraseluler. Ligand CD44 lainnya selain asam hialuronik, yaitu osteopontin, serglycin, kolagen, fibronektin, dan laminin. Peran fisiologis CD44 yang utama adalah untuk mempertahankan struktur organ dan jaringan melalui adhesi sel ke sel, dan sel terhadap matriks, namun pada isoform tertentu CD44 juga berperan dalam memperantarai aktifasi leukosit dan homing, serta mengikat faktor kimia dan hormon. Berbagai isoform CD44 dapat tertampil pada neoplasma (Goodison, et al., 1999).
Gen CD44 pada manusia terdapat pada kromosom lokus 11p13 yang terdiri dari dua kelompok exons (Gambar 2.32) (Goodfellow, et al., 1998). Satu kelompok terdiri dari exon 1-5 dan exon 16-20, yang terpisah membentuk suatu transkripst yang mengkode tampilan isoform standard (disingkat sebagai CD44s).
Sepuluh variant exon 6-15 (disebut juga sebagai v1-10) secara alternatif splicing dapat terinsersi di antara exon 5 dan exon 16 (Tolg, et al., 1993). Molekul yang mengandung berbagai variant exon maupun produk peptide-nya dikenal sebagai CD44v. Secara teori dapat terjadi sejumlah pemotongan (splicing) alternatif sehingga dapat dijumpai lebih dari 1000 variant CD44 yang berbeda-beda (Screaton, et al., 1992; Ermak, et al., 1996). Pada manusia, exon 6 (v1) terdiri dari
stop codon pada asam amino ke-17, yang berbeda dengan tikus (Screaton, et al., 1993).
Gambar 2.32 Skematik struktur gen CD44. Exons standard (s1-10) mengkode tampilan isoform standard protein CD44. Kombinasi varian exons (v1-10) secara alternative dapat dipisahkan di antara s5 dan s6 yang mengkode isoform protein varian CD44v. (Goodison, et al., 1999)
Isoform standard protein CD44 pada manusia yang paling banyak mengandung asam amino yaitu terdiri dari 363 asam amino dengan berat molekul 37 kDa. Protein terdiri dari tiga daerah yaitu: 72 asam amino (aa) domain sitoplasmik terminal-C, 21 asam amino domain transmembran, dan 270 asam amino domain ekstra seluler (Gambar 2.33). Daerah sitoplasma dikode oleh exon 18, exon 19 dan exon 20. Domain transmembran hidrofobik dikode oleh exon 18.
Domain ekstra seluler terdiri atas dua bagian yaitu daerah yang conserved dan non-conserved. Domain ekto terminal-N dikode oleh exon 1-5 yang berlekuk ke dalam struktur globular tertiar membentuk ikatan disulfida di antara tiga pasangan sistein. Bagian proksimal membran domain ekstra seluler dikode oleh exon 16 dan exon 17 (Goodison, et al., 1999).
Gambar 2.33 Struktur protein CD44. Isoform standard yang mengikat ligand utamanya (asam hialuronik) pada ujung-N (domain distal ekstraseluler). Varian kombinasi exon (v1-10) di antara domain ekstraseluler dapat mengganggu afinitas ikatan asam hialuronik dan interaksinya terhadap ligand alternatif. Interaksi molekul terhadap sitoskeleton melalui ikatan ankirin dan famili ERM (ezrin, radixin, moesin) dengan domain sitoplasmik (Goodison, et al., 1999)
Ligand utama CD44 adalah asam hialuronik yang merupakan komponen utama ECM. Asam hialuronik merupakan suatu glikosaminoglikan polimerik, linear, dan paling sedikit tiga tempat yang mengikat molekul CD44 yaitu satu pada domain ‘link’ yang dikode oleh exon 2 (Yang, et al., 1994) dan dua lainnya tumpang tindih pada daerah yang dikode oleh exon 5 (Liao, et al., 1995). Tempat ikatan asam hialuronik terdiri dari kelompokan asam amino basa, dengan residu arginin spesifik. Walaupun semua CD44 mengandung tempat pengenalan asam hialuronik, namun tidak semua sel yang menampilkan CD44 mengikat asam hialuronik secara konstitutif. Sel dapat menampilkan CD44 dalam keadaan aktif dan terangsang, atau dalam keadaan tidak aktif namun berikatan dengan asam hialuronik. Perbedaan tempat ikatan asam hialuronik pada CD44 menunjukkan kespesifikan sel, dan dihubungkan dengan pola modifikasi post translasi.
Hambatan terhadap glikosilasi meningkatkan ikatan asam hialuronik (Lesley, et al., 1995). Pada jenis sel tertentu, protein permukaan CD44 yang tidak aktif dapat terangsang segera berikatan dengan asam hialuronik melalui interaksi terhadap antibodi spesifik.
Sel tubuh manusia pada umumnya menampilkan isoform CD44s, terutama CD44E, yang diproduksi exons v8-10 (Gambar 2.5) (Iida and Bourguignon, 1995). Tampilan isoform CD44 terdiri dari kombinasi variant exons yang lebih terbatas pada jaringan normal. Tampilan variant isoform ini terdeteksi pada sel hematopoetik (Stauder, et al., 1995), terutama pada sel mononukleus di darah perifer (Salles, et al., 1993). Tampilan v6 mengandung isoform yang terdapat pada duktus payudara (Terpe, et al., 1994) dan pankreas (Gansauge, et al., 1995; Hong, et al., 1995), sedangkan isoform v4 tertampil pada sel urothelial normal (Southgate, et al., 1995). Sel tubuh manusia yang tidak menampilkan isoform CD44 adalah sel hepatosit, sel asiner pankreas, dan sel pada tubulus ginjal (Terpe, et al., 1994; Mackay, et al., 1994).
Famili protein CD44 mempunyai berbagai fungsi di sekitar ikatan asam hialuronik dan molekul ekstra seluler lainnya. Keragaman fungsi ini diawali oleh pemotongan (splicing) alternatif pre-mRNA dan ikatan ligand yang menyebabkan modifikasi post-translasi serta interaksi dengan berbagai faktor lainnya.
Keseimbangan interaksi di antara molekul sel permukaan terhadap molekul lainnya dan ECM menentukan tempat dan status migrasi jenis sel yang spesifik (Goodison, et al., 1999).
Protein CD44 berperan dalam mempertahankan struktur tiga dimensi organ maupun jaringan. Proliferasi dan repair sel dipengaruhi oleh CD44 dan
produksi asam hialuronik, yang selanjutnya melekat pada struktur scaffold selama proses perluasan (Jain, et al., 1996). Asam hialuronik tertimbun pada proses angiogenesis, penyembuhan luka, dan migrasi sel embrionik (Sherman, et al., 1996), yang menyebabkan migrasi sel melewati bahan asam hialuronik (Thomas, et al., 1992). Asam hialuronik mendukung CD44 memperantarai pergerakan sel (Goodison, et al., 1999).
Molekul CD44 dapat juga memperantarai agregasi sel, yang dapat terjadi melalui ikatan asam hialuronik yang multivalent dengan CD44 pada sel di sekitarnya atau melalui ikatan inter-CD44 yang melekat pada glikosil moieties (Cooper and Dougherty, 1995). Ikatan asam hialuronik juga dapat merangsang tampilan gen, seperti gen peradangan pada makrofag termasuk NOS (nitric oxide synthase). Fragmen asam hialuronik sebagai heksamer kecil dan antibodi monoklonal terhadap asam hialuronik menghambat tampilan gen yang dirangsang asam hialuronik (McKee, et al., 1996).
Sebagian besar fungsi leukosit tergantung pada tampilan CD44.
Meningkatnya kadar protein CD44 pada permukaan menandai leukosit-T yang teraktifasi. Sel permukaan CD44 pada leukosit dapat memperantarai perlekatan leukosit pada sel endotel pembuluh darah melalui ikatan asam hialuronik, interaksi ini digunakan untuk ekstravasasi sel T yang teraktifasi pada daerah peradangan pada tikus percobaan maupun manusia (Estess, et al., 1998).
Targeting leukosit ke tempat efektor melalui ikatan CD44-asam hialuronik ditingkatkan oleh induksi sintesa asam hialuronik pada endotel pembuluh darah akibat sitokin pro-inflamatori, TNF-α, dan IL-1β (Mohamadzadeh, 1998).
Tampilan berbagai isoform CD44 dan hasil dari profil ikatan asam hialuronik dapat meningkatkan pertumbuhan dan perkembangan tumor. Jaringan tumor mengandung transkrip CD44, yang biasanya tidak dijumpai pada jaringan normal (Stamenkovic, et al., 1991). Garis keturunan sel tumor yang mengandung protein CD44 memnunjukkan kemampuan untuk membentuk tumor yang lebih agresif (Birch, et al., 1991). Perubahan tampilan molekul perlekatan sel pada jaringan merusak interaksi epitel-mesenkim normal, menyebabkan disorganisasi struktural maupun fungsional yang merupakan ciri khas kanker (Goodison, et al., 1999).
Ikatan CD44s-asam hialuronik pada perkembangan tumor menghambat pembentukan tumor. Protein CD44 mutant tidak mampu mengikat asam hialuronik sehingga tumor dapat bertumbuh. Tingkat kesalahan prosesing transkrip CD44 meningkat pada sel tumor. Transkripsi CD44 yang dihasilkan sel tumor diproses secara aberrant menggunakan daerah sambungan yang tersamar.
Tampilan CD44 abberant merangsang tumorigenesis, gangguan ikatan asam hialuronik, dan mikrometastasis ke berbagai organ. Pada sebagian tumor primer dan metastasis terjadi kehilangan tampilan CD44 dan ikatan asam hialuronik, oleh karena mengalami hipermetilasi gen CD44 (Goodison, et al., 1999).
2.4.3.2 CD24
CD24 merupakan molekul kecil protein permukaan sel yang berlabuh melalui glycosyl-phosphotidyl-inositol pada membrane berbagai sel kanker.
Sangat banyak glycosylated dan fungsinya di dalam interaksi sel dan
sel-matriks (Lee, et al., 2010; Kristiansen, et al., 2003; Pierres, et al., 1987). CD24 merupakan antigen yang tidak stabil dalam suasana panas dan digunakan sebagai petanda diferensiasi sel hemtopoeitik dan neuronal (Springer, et al., 1978; Fang, et al., 2010). Glycosylation CD24 bervariasi digunakan untuk membedakan fungsi berbagai sel, namun pada sebagian sel masih belum jelas (Fang, et al., 2010).
CD24 tertampil pada stadium awal perkembangan sel B dan tertampil kuat pada sel neutrofil, namun CD24 tidak tertampil pada sel T yang normal dan monosit (Creighton, et al., 2009). CD24 tidak tertampil pada jaringan tubuh manusia normal, namun tertampil pada karsinoma (Kristiansen, et al., 2003).
Tampilan CD24 dapat dijumpai pada kanker ovarium, payudara, prostat, kantong kemih, ginjal, karsinoma paru non-small cell, dan metastasis (Kristiansen, et al., 2003; Zheng, et al., 2011). CD24 pada manusia, teridentifikasi sebagai petanda molekuler yang digunakan untuk membedakan sel epitel luminal, sel non-epitel dan sel mioepitel (Sleeman, et al., 2006).
CD24 terlibat di dalam adhesi sel dan metastasis (Lee, et al., 2010). Oleh sebab itu CD24 dapat menjadi petanda yang bermakna untuk prognosis dan diagnosa tumor. CD24 memfasilitasi intravasasi sel tumor (Kristiansen, et al., 2004). Secara fungsional, teridentifikasi sebagai ligand alternatif untuk P-selectin, suatu reseptor perlekatan pada platelet dan sel endotel (Aigner, et al., 1998), melalui interaksi yang memfasilitasi perjalanan sel tumor di dalam aliran darah selama proses metastasis. Juga meningkatkan adhesi sel tumor terhadap fibronektin, kolagen, dan laminin (Zheng, et al., 2011). Peningkatan CD24 yang dihubungkan dengan metastasis merupakan hal yang penting untuk faktor prognostik dan petanda CSC yang baru (Lee, et al., 2010).
CD24 tidak tertampil pada sel progenitor akan tetapi tertampil pada sel yang sudah berdiferensiasi. Penelitian selanjutnya masih dibutuhkan untuk menjelaskan mekanisme tampilan CD24 terhadap sel yang berdiferensiasi dan tidak berdiferensiasi (Fang, et al., 2010). Mekanisme pengaturan seperti epigenetic silencing maupun keterlibatan faktor transkripsi lainnya di dalam tampilan CD24 (Kaipparettu, et al., 2010). CD24 menurunkan konsentrasi faktor migrasi -1 yang berasal dari sel stroma, dan mengurangi kemampuan metastasis cell lines kanker payudara melalui signaling CXCR4. Sebaliknya kemampuan migrasi dari sel dengan CD24- akan meningkat karena kurangnya hambatan dari RNA inhibition (Schabath, et al., 2006). Penelitian yang dilakukan oleh Sorbello, et al. (2003), didapatkan bahwa protein CD24 merupakan salah satu dari sembilan gen yang mengatur estrogen pada kanker payudara. Tampilan kuat CD24 dijumpai pada sel tumor yang tidak menampilkan ER.
Shipitsin, et al. (2007), menemukan bahwa tampilan CD24 terdapat pada sel yang sudah lebih berdiferensiasi, sedangkan CD44 tertampil pada sel yang lebih progenitor-like.
Kombinasi petanda CD44+/CD24-/low merupakan karakteristik sel punca kanker payudara (Al-Hajj, et al., 2003). Fungsi yang sebenarnya dari sel punca dan hubungannya terhadap respon terapi pasien masih belum jelas (Hennessy, et al., 2009).
2.4.3.3 ALDH1 (Aldehyde Dehydrogenase-1)
ALDH1 (aldehyde dehydrogenase-1) adalah golongan enzim detoksifikasi yang merupakan salah satu biomarker sel punca payudara, dan berfungsi untuk
mengoksidasi aldehydes intraseluler. ALDH dapat ditemukan pada sel punca payudara normal maupun populasi sel punca kanker. Sub-populasi dengan aktifitas ALDH yang tinggi banyak terdiri dari CSC. Ekspresi ALDH1 dengan pewarnaan imunohistokimia ditemukan pada 481 kasus kanker payudara primer (Ginestier, et al., 2007). ALDH1A3 (Aldehyde dehydrogenase family 1 member A3) berhubungan dengan grading dan metastasis tumor, dan hal ini tidak ditemukan pada ALDH1A1 (Marcato, et al., 2011). Kanker payudara dengan ekspresi ALDH1 positif pada umumnya dihubungkan dengan tampilan HER2 positif, dan ekspresi ER dan PgR negatif. ALDH1 tertampil pada garis keturunan sel tipe basal, namun tidak tertampil pada sel tipe luminal (Charafe-Jauffret, et al., 2009).
Walaupun CD44+/CD24-/low, ALDH1A1, ALDH1A3 dan ITGA6 menunjukkan ciri-ciri CSC, perlu diperhatikan bahwa ekspresi ini tidak selalu dijumpai pada semua kasus. Sebagai contoh fenotipik CD44+/CD24-/low tidak teridentifikasi pada salah satu dari sembilan sediaan yang berasal dari kanker payudara (Al-Hajj, et al., 2003). Demikian juga Hwang-Verslues, et al. (2009) menemukan ekspresi petanda sel punca CD44+/CD24-/low dan ALDH1A1 beragam di antara cell lines kanker payudara dan tumor primer, petanda ini tidak bersifat universal untuk semua CSC (Hwang-Verslues, 2009). Keragaman phenotype CSC dan keberadaan berbagai klone sel yang bertindak sebagai CSC merupakan konsep dasar pada keganasan hematologi (Stingl and Caldas, 2007).
Pada sel tumor, tampilan ALDH1 mengidentifikasi sel punca payudara (MSCs) yang ter-rekrut secara selektif ke daerah pertumbuhan tumor, yang akan
berinteraksi dengan sel punca kanker payudara melalui loops sitokin IL6 dan CXCL7 (Liu, 2011).