Ni Made Suaniti1, Luh Putu Wrasiati2, Ida Ayu Raka Astitiasih1, A.A. Sg. A. Sukmaningsih1 1Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana
2Jurusan Teknologi Pertanian, Badung, Bali, Indonesia E-mail : [email protected]; [email protected]
Abstract
One of the stress oxidative biomarker is 8-Hydroxy-2’-deoxyguanosine (8OHdG) causes early damage on DNA (deoxyribonucleic acid) as a result of ethanol biotransformation. The aim of this research was to ind out the optimal analysis method in order to analyze 8OHdG as a marker of oxidative damage due to ethanol. The research was designed as a true experimental optimized the instrumentation method and applicated the urine samples from rats after treated with ethanol. Before Analysis, standard 8OHdG and the urine samples were cleaned up with solid phase extraction (SPE). The result from the cleaned up were analyzed and optimized by choosing the best derivative, which was igured out from calibration curve coeficient correlation. First derivatization has been done from the result by SPE using N,O-bis(trimethylsilyl)triluroacetamide (BSTFA) and GC-MS with caffeine as internal standard. The result from separations of 8OHdG and caffeine was shown as speciic time retention (tR) at 7.07; 8.27, and 28.47 minutes for 8OHdG, while 19.31 minutes from caffeine. The calibration curve of 8OHdG was corrected at y=2.107x-3.107, with correlation coeficient r2=0.7273. Second derivatization was reacted with dansyl chloride and analyzed with TLC-spectrum photo densitometry, resulted in calibration curve of y=3851.6x-5315.4 with coeficient correlation r2 =0.9079. Fragmentation of speciic ion mass on mass spectrometry was inely shown at 7.07 and 28.47 minutes retention times at m/z 73 as trimethylsilyl. At retention time of 28.47 minutes with m/z 383 was M+ and m/z 368 was M+-CH
3.
Keyword: 8OHdG, biotransformation, oxidative, DNA, dansyl chloride
1. Pendahuluan
Etanol sama halnya dengan obat dapat disebut sebagai zat asing yang tidak diinginkan bagi tubuh, karena etanol yang berlebihan dapat merusak sel dan mengganggu fungsinya. Oleh karena itu, tubuh akan berusaha untuk merombak zat asing ini menjadi metabolit yang tidak aktif lagi dan sekaligus bersifat lebih hidroil agar memudahkan proses ekskresinya oleh ginjal. Dengan demikian reaksi-reaksi metabolisme dalam hati, darah, dan beberapa organ lain (paru-paru, ginjal, dan, dinding usus) disebut biotransformasi.
Dalam reaksi biotransformasi, etanol mengalami dua reaksi yaitu fase I atau Fungsionalisme dan fase II atau konyugasi. Khusus reaksi fase I, etanol mengalami reaksi oksidasi menjadi asetaldehida oleh alkohol dehidrogenase (ADH), kekurangan ADH dapat digantikan oleh enzim Microsomal Ethanol Oxidizing System (MEOS atau P4502E1). Aldehid bersifat reversibel dengan etanol [1; 2] dan kemungkinan menghasilkan radikal hidroksil atau .OH (spesies oksigen reaktif /ROS), dan metabolit toksik seperti fatty acid ethyl esters/FAEEs [3]. Radikal OH bereaksi dengan basa nukleotida DNA (guanin) membentuk 8 hidroksi 2’ deoksiguanosin sebagai marker stres oksidatif. Marker 8OHdG ini telah diterima bukan saja sebagai biomarker karsinogenik tetapi juga aging dan penyakit-penyakit degeneratif [4]. Ketidakseimbangan antara pro-oksidan dan antioksidan ada peluang terbentuknya radikal hidroksil (radikal yang paling reaktif) bereaksi secara kimia sehingga sel akan berlipat ganda (multiplying) secara tidak terkendali [5], sehingga memediasi stres oksidatif dan kerusakan DNA serta mengakibatkan kerusakan jaringan hati [6; 7].
Kerusakan hati telah teramati secara histopatologi disertai dengan peningkatan kadar aldehid dehidrogenase sebagai biomarker awal kerusakan setelah konsumsi alkohol secara berulang [8; 9]. Marker 8OHdG ini dapat didegradasi lewat urin dan analisisnya dengan HPLC-ECD, elektroforesis kapiler, dan GC [10; 11; 12; 13]. Untuk pengembangan pemeriksaan biomarker etanol dan mengetahui kerusakan oksidatif DNA yaitu 8OHdG telah dilakukan penelitian optimasi dengan pereaksi dansil klorida dan analisisnya dengan TLC-Spektrofotodensitometri.
2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan ”True experimental optimized instrumentation method” and applicated the urine samples after ethanol consumption.
3. Metode Penelitian Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik, sentrifuge, Solid Phase Extraction (SPE), GC-MS, TLC-Spektrofotodensitometri, alat-alat gelas yang telah disterilisasi, pipet khusus untuk pemberian alkohol, wadah penampungan urin.
Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tikus Wistar sebanyak 20 ekor, etanol, es batu, dansil klorida, 8-hidroksi-2-deoksiguanosin (8-OHdG) dari Sigma, metanol, KH2PO4, pH 7, Etil asetat, metanol, dan amonia serta semua reagen berderajat pro analisis.
Tempat Penelitian
Penelitian ini dikerjakan di Laboratorium Kimia Universitas Udayana dan analisis 8OHdG dengan GC-MS dan TLC Spektrofotodensitometri di Laboratorium Forensik POLRI cabang Denpasar.
Perlakuan etanol pada tikus Wistar
Dua puluh ekor tikus Wistar dipelihara dan diadaptasikan selama satu bulan dengan standar perawatan hewan percobaan diberikan makan standar dan minum air. Larutan etanol 20% dan pereaksi-pereaksi kimia untuk penenlitian ini dibuat di jurusan kimia F.MIPA UNUD. Tikus Wistar diambil secara random dibagi menjadi 2 kelompok, masing-masing kelompok sebanyak 10 ekor. Po adalah kontrol, P1 adalah perlakuan alkohol 20 % selama 6 minggu. Tikus sebelum perlakuan dipuasakan selama 2 jam dengan tujuan agar analisis tidak terganggu oleh zat atau obat lain selain alkohol. Kemudian tikus kontrol diberikan 1,0 mL akuades, tikus perlakuan diberikan 1,0 mL alkohol 20% secara adlibitum dengan jarum steril di kandang percobaan hewan Universitas Udayana. Penampungan sampel urin dilakukan sehari setelah pemberian etanol terakhir setelah 6 minggu ditempatkan pada wadah steril dan diisi es batu segera disimpan pada suhu -20oC sebelum dianalisis. Masing-masing
sampel disentrifuge 2000 g selama 10 menit kemudian endapan dipindahkan sebelum dibersihkan dengan SPE.
Preparasi sampel urin dengan SPE
Kolom SPE di kalibrasi dengan 10 mL metanol, 10 mL air, dan 10 mL 5 mM KH2PO4, pH 7 (buffer
A). Sebanyak 5 mL urin ditambahkan 2,5 mL 8-OHdG dan dicampur sebelumnya dengan 2,5 mL HCl 2M. Kolom dicuci dengan 3 mL buffer A dan 8OHdG dan dielusi dengan 3 mL metanol 15% dalam buffer A. Eluat kemudian dicampur dengan 6 mL CH3CN dan disentrifuge 2000g selama 5 menit. Eluat diuapkan sampai kering di bawah vakum pada 39-40oC, residu dilarutkan dengan 0,5
mL metanol [10].
Analisis 8OHdG dengan GC-MS
8OHdG standar dan dalam sampel urin hasil clean up dengan SPE diderivatisasi dengan campuran 50 µL BSTFA dan CH3CN (2:1,v/v), kemudian dipanaskan selama 30 menit pada 100oC. Selanjutnya
ditambahkan 250 µg kafein sebagai stándar internal kemudian dilakukan analisis dengan GC-MS (Gambar 3.1) pada kondisi dan sitem optimum. Pemilihan sistem dan kondisi GC-MS sampai diperoleh pemisahan yang baik yang ditunjukkan dengan nilai resolusi atau daya pisah antara 2 komponen > 1,5.
Analisis 8OHdG dengan TLC-Spektrofotodensitometri
8OHdG standar dan dalam sampel urin hasil clean up dengan SPE diderivatisasi dengan pereaksi dansil klorida dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya dilakukan elusi dengan fase gerak sistem TE yaitu campuran etil asetat : metanol : 25% amonia = 17:2:1 dan analisis 8OHdG dengan TLC- spektrofotodensitometri yang ditunjukkan dalam Gambar 3.2.
Gambar 3.1 GC-MS Gambar 3.2 TLC Spektrofotodensitometri
4. Hasil Dan Pembahasan
4.1 Analisis 8OHdG dengan GC-MS
Hasil kromatograi gas BSTFA dan standar kafein ditunjukkan dalam Gambar 4.1 menunjukkan ada perbedaan pemisahan dengan standar 8OHdG yang diderivatisasi dengan BSTFA menggunakan standar internal kafein. Tujuan penambahan BSTFA adalah untuk meningkatkan volatilitas sehingga senyawa tersebut dapat dianalisis dengan kromatograi gas.
Kromatogram pemisahan 8OHdG hasil derivatisasi dengan bis trimetilsilil triluoroasetamida (BSTFA) dan standar internal kafein dengan kromatograi gas dalam Gambar 4.2, menunjukkan bahwa 8OHdG-BSTFA muncul pada waktu retensi (tR/time retention) yang spesiik pada 7,07; 8,27; dan 28,47 menit sedangkan kafein-BSTFA muncul pada waktu retensi 19,31 menit, data lengkapnya ditabulasi dalam Tabel 4.1.
Tabel 4.1. Hasil senyawa-senyawa yang muncul setelah 8OHdG diderivatisasi dengan BSTFA Puncak Waktu retensi
(menit) Senyawa yang diduga
1 4,51 Trimetilsililacetamida
2 5,27 Triluorometilsililmetilketon 3 6,02 1,2-bis(trimetilsiloksi) etana 4 7,07 2-trimetilsililetil ester
5 8,27 Asam propanoat trimetilsilil ester
6 19,31 Kafein 7 8 9 21,10 22,88 28,47
Trimetilsilil asam palmitat
Asam oktadekanoat trimetilsilil ester 1,8-dihidroksi-3-metilantrakuinon
Hal ini menunjukkan bahwa 8OHdG yang tidak volatil berhasil dianalisis dengan kromatograi gas setelah dibuat dalam bentuk senyawa yang mudah menguap (volatil) dengan BSTFA. Puncak 1, 2, 3, 4,5,6,7,8, dan 9 berturut-turut adalah trimetilsililacetamida, triluorometilsililmetilketon, 1,2- bis (trimetilsiloksi) etana, 2-rimetilsililetil ester, asam propanoat trmetilsilil ester, kafein, trimetilsilil asam palmitat, asam oktadekanoat trimetilsilil ester, dan 1,8-dihidroksi-3-metilantrakuinon. Menurut [14] bahwa derivat silil ini digunakan untuk analisis sampel yang bersifat polar yang tidak mudah menguap, sebagai urutan reaktivitas gugus-gugus penerima silil adalah sebagai berikut: alkohol> fenol> asam karboksilat > amina > amida.
Marker kerusakan oksidatif 8OHdG bersifat reversibel dengan 8oxodG atau dengan nama IUPAC 7,8-dihidro-8-oxo-2’-deoksi guanosin dan gugus keton cincin 5 digantikan dengan gugus OH disebut dengan 8OHdG. Hal ini diperlihatkan dalam Gambar 4.3 dan 4.4 menurut [4].
Gambar 4.3 Struktur kimia 8oxodG Gambar 4.4 Struktur kimia 8OHdG
Pemisahan 8OHdG yang diderivatisasi dengan BSTFA dan analisis dengan kromatograi gas menunjukkan pemisahan cukup baik dengan resolusi > 1,5 karena puncak antara 8OHdG dan kafein sebagai standar internal cukup terpisah yaitu dengan perbedaan waktu retensi 12,24 dan 9,16 menit. Walaupun banyak puncak muncul, hal ini disebabkan oleh konsumsi etanol dalam waktu lama dapat menyebabkan etanol mengalami reaksi oksidasi menjadi asam asetat dan terjadi metilasi menjadi asam propanoat (seminar nasional agroindustri, 2012) dan seterusnya sampai asam palmitat/asam heksadekanoat, dan asam oktadekanoat trimetilsilil ester. Hasil ini sesuai dengan penelitian [10] tetapi menggunakan standar internal pyrene.
Fragmentasi massa ion spesiik muncul baik pada waktu retensi 7,07 menit maupun 28,47 menit adalah m/z 73 sebagai trimetil silil (Gambar 4.5). DNA adalah suatu basa guanin yang mengandung gugus NH2 dan keton adalah bersifat reversibel dengan OH yaitu 8oxodG dengan 8OHdG. Pada waktu retensi 28,47 juga muncul m/z 383 sebagai M+, hal ini didukung oleh penelitian [15] Sehingga
(M+-CH
3) muncul pada m/z 368 dalam kromatogram derivatisasi 8OHdG. Fragmen m/z 103 juga
didukung oleh penelitian [10] bahwa hasil fragmen ion yang dilaporkan adalah m/z 103 muncul sebagai massa nukleosida.
Radikal oksigen spesies (ROS) menginduksi kerusakan DNA sebagai konsekuensinya terjadi degradasi genomik dalam urin sukarelawan yang terekpos rokok (nikotin) oleh [16]. Ion karakteristik lainnya sebagai (M+.) dan (M+-CH
3) berturut-turut adalah 643 dan 628. Fragmen (M +-CH
3) muncul
sama tetapi pada m/z yang berbeda, hal ini kemungkinan disebabkan oleh standar internal yang berbeda. Fragmen ion 8OHdG pada m/z 28,47 menit, adalah 1,8 dihidroksi-2 metil antrakuinon dengan fragmentasi massa ion muncul sebagai m/z adalah 73, 311, 368, dan 383.
Spektrum massa 1,8 dihidroksi-3- metilantrakuinon sebagai hasil derivatisasi 8OHdG dengan BSTFA diperlihatkan dalam Tabel 4.2 berikut.
Tabel 4.2. Dugaan interpretasi hasil Fragmentasi massa ion No m/z Kemungkinan fragmen yang hilang
1 383 M.
2 368
M.-15 -CH3
3 311 M+-73 -
4 73 (M.-15)-73-222 -Si (CH3)3
4.2 Analisis 8OHdG dengan TLC-Spektrofotodensitometri
Hasil derivatisasi 8OHdG standar dengan dansil klorida dapat dideteksi dengan TLC- spektrofotodensitometri seperti diperlihatkan dalam Gambar 4.6. Puncak 2 adalah 8OHdG dan puncak 3 adalah dansil klorida. Sampel urin tikus Wistar yang diberikan etanol 20% secara kronis (Gambar 4.7) memberikan puncak spesiik juga sama dengan standar 8OHdG yaitu puncak 2 dan puncak 3 adalah dansil klorida, serta puncak lainnya muncul sebagai puncak 4 dan 5 sebagai pengotor (impurity) yang muncul di dalam sampel urin. Hasil 8OHdG yang diperoleh dalam sampel urin cukup terdeteksi, walaupun masih dalam jumlah sedikit dan muncul sebagai puncak 2 karena 8OHdG sebagai marker awal kerusakan basa guanin pada DNA telah terbukti ada sebagai hasil biotransformasi etanol dalam tikus Wistar. Instrumentasi spektrofotodensitometri dapat dipakai untuk mengukur 8OHdG secara kuantitatif setelah melalui skrening dengan TLC, walaupun batas deteksi yang diperoleh dalam konsentrasi ppm. Untuk meyakinkan lebih lanjut perlu dilakukan penelitian dengan berbagai fase gerak agar dapat meningkatkan kepekaan deteksi dalam sampel cairan biologis akibat stres oksidatif karena penyalahgunaan alkohol.
Gambar 4.6 Kromatogram 8OHdG 500 ppm Gambar 4.7 Kromatogram 8OHdG dalam urin
dengan TLC-spektrofotodensitometri tikus
Wistar yang diberikan alkohol 20% secara kronis
Persamaan kurva kalibrasi 8OHdG terkoreksi yang telah di clean up melalui kolom SPE, derivatisasi dengan BSTFA, serta analisis dengan GC-MS adalah y = 2. 107 x – 3. 107 dengan koeisien
korelasi 0,7273 (Gambar 4.8). Selanjutnya 8OHdG hasil clean up melalui SPE, diderivatisasi dengan dansil klorida, serta analisis dengan TLC-spec (spektrofotodensitometri) diperoleh persamaan garis kalibrasi 8OHdG terkoreksi adalah y = 3851,6 x -5315,4 dengan koeisien korelasi 0,9079 seperti diperlihatkan dalam Gambar 4.9.
Kurva kalibrasi 8OHdG GC-MS
y = 2E+07x - 3E+07 R2 = 0.7273 -20000000 -10000000 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 70000000 1 2 3 4 Konsentrasi A rea T er ko reksi
Kurva kalibrasi 8OHdG Terkoreksi TLC Spec
y = 3851.6x - 5315.4 R2 = 0.9079 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 1 2 3 4 Konsentrasi A r ea t er ko r eksi
Gambar 4.8 Kurva Kalibrasi 8OHdG GCMS Gambar 4.9 Kurva Kalibrasi 8OHdG TLC-Spec 5. Kesimpulan
Analisis 8 Hidroksi-2’Deoksiguanosin dapat dideteksi dengan TLC-spektrofotodensitometri setelah optimasi dengan pereaksi dansil klorida dengan sistem pengembang sistem TE (etil asetat: metanol : 25% amonia = 17:2:1). Kurva kalibrasi 8OHdG dengan GC-MS adalah y = 2.107x – 3.107
dengan koeisien korelasi (r2) adalah 0,7273 dan dengan TLC-Spektrofotodensitometri adalah y =
3851,6x – 5315,4 dengan koeisien korelasi 0,9079. Fragmen ion spesiik adalah m/z 73 sebagai trimetil silil dan fragmen ion pada 28,47 menit adalah m/z 383 sebagai M+ dan m/z 368 sebagai
M+-CH
3. Analisis 8OHdG dengan TLC-spektrofotodensitometri sebagai instrumentasi skrening
(kualitatif) dan konirmasi (kuantitatif) dapat digunakan sama dengan GC-MS. Marker 8OHdG ini layak dikembangkan baik untuk pencarian pengembang yang berbeda-beda maupun pada penelitian eksperimental, setelah alkoholik diberikan ekstrak etanol dari antioksidan alami untuk melihat penurunan stres oksidatif. Selanjutnya hasil penelitian ini dapat sebagai dasar penelitian kimia terapan pada kasus alkoholik untuk deteksi dini penyakit degeneratif.
6. Ucapan Terima Kasih
Penulis menyampaikan terima kasih kepada Rektor Universitas Udayana, Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat yang telah menfasilitasi dalam penyaluran dana sehingga terlaksananya penelitian Hibah Unggulan Udayana 2012. Ucapan terima kasih kepada Lembaga Forensik POLRI atas kerjasamanya, dan berbagai pihak yang telah membantu terlaksananya penelitian ini sehingga berhasil dengan baik.
7. Daftar Pustaka
[1] Deitrich, R., Zimatkin, S., dan Pronko, S. Oxidation of Ethanol in the Brain and its Consequences. J. Alcohol Reaserch and Health. 2006 29: 4.
[2] Pelley JW, Goljan EF. 2007. Rapid review Biochemistry. 2nd Ed. Oklahoma: Elsevier.
[3] Suaniti, NM. , Djelantik, A.A.G.S., Suastika, K., Astawa, IN.M. Validation of analysis fatty acid ethyl esters as biomarkers of ethanol administration. Journal of Medicine and Medical Sciences May 2012. Full Length Research Paper. 2012a (3-5),330-333. http:///www. Interesjournals.org/JMMS.
[4] Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hidroxy-2’deoxyguanosine (8OhdG): A Critical Biomarker of Oxidative Stress and Carcinogenesis. Journal of Enviromental Science and Health, Part C: Environmental Carcinogenesis and Ecotoxicology Reviews. 2009 (27-2), 120-139. http://www.tandfonline.com/loi/lesc20. published 01 May 2009. Taylor & Francis. London WiT 3JH, UK.
[5] Astawan M. 2011. Alkohol dalam brem. Teknologi Pangan dan Gizi. Universitas Udayana [6] Vanlaufen A, Jeremy S, Wilson, Romano c, Pirola, Minoti. Role of Alcohol Metabolism in
Chronic Pancreatitis. Alcohol Research & Health. 2007 (30) 48-52.
[7] Lehninger, 2008. Principles of Biochemistry. David L. Nelson dan Michael M.Cox. Fifth edition.W.H.Freeman and Company. New York. ISBN 13:978-0-7167-7108-1
[8] Suaniti, NM., Djelantik, A.A.G.S., Suastika, K., Astawa, IN.M. Aldehid Dehidrogenase dalam Tikus Wistar sebagai Biomarker Awal Konsumsi Alkohol secara Akut. Jurnal Biologi. 2011 (XV- 1) 6-8. ISSN 1410 5252
[9] Suaniti, NM., Djelantik, A.A.G.S., Suastika, K., Astawa, IN.M. Kerusakan Hati Akibat Keracunan Alkohol Berulang pada Tikus Wistar. Jurnal Veteriner Terakreditasi Dikti, Juni 2012b (13-2) 199-204.ISSN: 1411-8327.
[10] Surong, M., Guowang, X., Jun, X., and Caiying W. Method for analysis of 8-Hidroxy-2’- deoxyguanosine in Urine by Gas Chromatography. Journal Analytical Sciences. June 2001a. 17: 779-781.
[11] Surong, M., Guowang, X., Jun, X., and Caiying W., Analysis of Urinary
8-Hidroxydeoxyguanosine by Capillary Electrophoresis and Solid-Phase Extraction. Journal Analytical Letters. 2011b (34-12) 2063-2076.
[12] Kvasnicova, V., Samcova, E., Jursova, A., Jelinek, I. Determination of 8-hydroxy-2’- deoxyguanosine in untreated urine by capillary electrophoresis with UV detection. Journal of Chromatography A, 2003 (985) 513-517.
[13 ]Inaba, Y., Koide, S., Yokoyama, K., and Karube, I. Development of Urinary 9-Hydroxy- 2’Deoxyguanosine (8-OHdG) Measurement Method Combined with SPE. Journal of Chromatographic Science. 2011 (49) 303-309.
[14] Rohman, A. (Pengantar Sudjadi). Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta. E-mail: [email protected] . 2007. ISBN: 978-979-1277-57-0
[15] Lin, H.S., Jenner, A.M., Ong, C.N., Hijang, S.H., Whiteman, M., and Halliwell, B. A High-throughput and sensitive methodology for the quantiication of urinary 8-hidroxy- 2’deoxyguanosine: measurement with gas chromatography-mass spectrometry after single solid-phase extraction. Journal Biochem. Britain. 2004 (380) 541-548.
[16] Malayappan, B., Garrett, T.J., Segal, M., Leeuwenburgh, C. Urinary analysis of 8-oxoguanine, 8-oxoguanosine, fapy-guanine and 8-oxo-2’-deoxyguanosine by High-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry as a measure of oxidative stress. Journal of Chromatography A, ScienceDirect. Elsevier. 2007 (1167) 54-62.