1.
Pendahuluan
Toxoplasma gondii menyebabkan penyakit toksoplasmosis yang sudah tersebar di seluruh dunia(Tenter et al.,2000)[1]. Kasus toksoplasmosis pada hewan dan manusia, baik di dunia maupun
di Indonesia sangat tinggi. Kasus pada manusia berkisar 40-85%, sedangkan pada hewan berkisar antara 5-80% (Subekti et al.,2005)[3]. Tingginya kasus toksoplasmosis pada hewan dan manusia,
maka deteksi T. gondii pada hewan maupun manusia merupakan hal yang sangat penting dilakukan. Metode Inhibitor haemagglutination (IHA) digunakan untuk mendeteksi antibodi T.gondii pada ayam kampung di Jakarta dengan hasil 52,5% (Priyana, 2000)[1]. Mufasirin et al. (2002) mendeteksi
antigen T. gondii dengan metode Elisa Dot Blot terdeteksi 100% telur ayam kampung mengandung antigen T. gondii[1]. Suwanti et al.(2006) di Surabaya dengan metode digesti mendeteksi 30%
jantung dan otak ayam mengandung sista T. gondii[1]. Metode PCR sensitif dapat mendeteksi T.
gondii pada serum mencit 3 hari setelah diinfeksi dengan takizoit strain RH T. gondii dan pada urine 5 hari setelah infeksi (Shojaee et al., 2007a)[1].
Mencit sebagai hewan model untuk infeksi T. gondii diinokulasi melalui intra peritonial. Inokulat yang diinokulasikan ke mencit dapat berupa stadium takizoit atau stadium bradizoit (Janitschke, 1999)[2]. Mencit dipilih sebagai hewan model, karena mencit demikian peka terhadap
T. gondii (Nguyen et al.,1996; Jensen et al.,1998; Dubey et al.,1999; Shojaee et al.,2007a; Shojaee et al.,2007b dan Peterico et al.,2009)[1]. Diagnosis toksoplasmosis secara molekuler
dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) sudah banyak dilakukan (Berg et al.,1989; Savva et al., 1990; Hohlfeld et al., 1994; Owen et al., 1998; Susanto et al., 2002, dan Priyowidodo, 2003) memberi hasil yang sangat spesiik dan sensitif[1,6]. Polymerase Chain
Reaction (PCR) sebagai suatu metode diagnosis terutama untuk toksoplasmosis keberhasilannya sangat ditentukan oleh salah satu syarat yaitu primer. Urutan sekuen oligonuleotida primer berupa urutan yang dapat berhibridisasi secara spesiik dengan molekul DNA cetakan (Yuwono, 2006)[2].
Sarva and Holliman (1989) melaporkan dapat melacak satu T.gondii dalam 106 sel inang dengan
melaporkankan bahwa metode PCR mempunyai sensitiitas 10 takizoit / 105 sel leukosit[1]. Deteksi
T gondii dengan metode PCR pada cairan amnion dapat memberi angka sensitivitas 97,4% dan spesiisitas 99,7% (Hohlfeld et al.,1994)[1]. Primer gen B1 pada metode PCR dapat mendeteksi 10
takizoit, metode ini lebih akurat dibanding dengan uji bioassay. Peneliti yang menggunakan gen B1 sebagai primer memberikan hasil yang sangat sensitif untuk mendeteksi T.gondii di jaringan maupun cairan amnion (Owen et al.,1998; Susanto et al.,2002 dan Priyowidodo, 2003)[1,6]. Dibandingkan
dengan capture ELISA dan immunobloting, deteksi T. gondii pada mencit menggunakan metode PCR paling sensitif, yaitu 18 jam setelah infeksi sudah dapat dideteksi (Haid et al., 2001)[1]. Tujuan
penelitian untuk mendeteksi T. gondii pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras secara molekuler dengan metode PCR.
2. Bahan dan Metode
Bahan penelitian yaitu organ (jantung, hati, otak) yang berasal dari mencit yang telah diinfeksi dengan inokulat jantung dan otak ayam buras. Mencit yang mengalami peningkatan titer serum dari preinokulasi, 2 minggu I inokulasi sampai 2 minggu II inokulasi. Sepuluh mencit yang dipilih yaitu: mencit yang diinokulasi dengan organ ayam buras berasal dari Badung (DJ.I.2 dan DJ.II.1), Denpasar (DJ.I.1), Tabanan (DO.I.2 dan DO.II.1), Buleleng (DJ.II.1), Gianyar (DO.II.1), Klungkung (DJ.I.2 dan DJ.II.1), Bangli (DJ.II.1) dan darah mencit yang positif terinfeksi T. gondii. Primer yang digunakan adalah primer Sag-1 yaitu: Forward: 5′-CACCTGTAGGAAGCTGTAGTCACT-3′ Reverse: 5′-TCACTGTGACCATACAACTCTGTG - 3′ Isolasi DNA dilakukan dengan cara yaitu sekitar 50 mg organ mencit dicacah dengan scalpel. Dimasukkan kedalam tabung ependorf 1,5 ml. Jaringan yang telah tercacah dihomogenkan dengan menggunakan pastel. Selanjutnya jaringan yang telah homogen, DNA nya diisolasi sesuai prosedur “pure-link genomic isolation kit” (Invitrogen). Hasil isolasi DNA ini disimpan pada -200C sampai digunakan.
Metode PCR komponen utama yang diperlukan adalah DNA cetakan; oligonukleotida primer yaitu sekuen oligonukleotida pendek 15–25 bp yang untuk mengawali sintesis rantai DNA; deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP; enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA dan senyawa buffer yang mengandung MgCl2 (Purwanto et al., 1997; Yuwono, 2006; Sudjadi, 2008)[2,4]. Polymerase
Chain Reaction dilakukan dengan R-reaction mix 2xPCR (Invitrogen) yang telah mengandung 0,2 mM dNTP, 1,6 mM MgSO4 dan buffer. Formulasi PCR pada penelitian ini diatur sebagai berikut : tabung ependorf mini ke dalamnya dimasukkan sebanyak 1 µl DNA (5µg/µl) yang telah diisolasi dari jantung dan otak ayam kampung dan ditambahkan primer forward (1 pmol) 0,6µl dan reverse (1 pmol) 0,6µl, ditambahkan R-mix (10xbuffer dan 0,2 mM dNTP) 5 µl. Setelah penambahan enzim Taq polymerase (1 unit) 0,25 µl dan terakhir ditambahkan aquabidest sehingga volume akhir menjadi 10 µl, tabung PCR dimasukkan ke dalam Thermocycler eppendorf mastercycler personal atau PTC-100TM. Mesin penyiklus panas diprogram sesuai metode PCR Yuwono (2006) dan Sudjadi
(2008) dengan kondisi 950C selama 1 menit (denaturasi), kemudian diturunkan 940C selama 45
detik, selanjutnya pengaturan suhu annealing diatur sesuai hasil optimasi pengaturan suhu annealing primer yang digunakan[2]. Untuk primer Sag-1 digunakan suhu annealing 550C. Elongasi dengan
suhu 720C selama 1 menit. Siklus dengan kondisi ini diulang 35 kali. Pada bagian akhir diinkubasi
pada suhu 720C selama 5 menit sampai selesai mencapai 220C. Langkah selanjutnya dilakukan
elektroforesis pada gel agarose 1% yang telah diisi ethidium bromide dengan konsentrasi 25 µg/ml dengan tegangan 100 Volt selama 30 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan ultraviolet (UV) dan didokumentasi dengan kamera digital.
3. Hasil dan Pembahasan
Hasil isolasi DNA organ mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras diperoleh kualitas DNA seperti tersaji pada gambar 1.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA Toxoplasma gondii dari organ mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras. Keterangan: M. Marker (1200 bp), 1.DNA Tbn.DO.II.1, 2.DNA Klk.DJ.II.1, 3.DNA Dps.DJ.I.1., 4.DNA Bdg.DJ.II.1., 5.DNA Gyr.DO.II.1., 6. DNA Bgl.DJ.II.1., 7. DNA Bll.DJ.II.1., 8. DNA darah mencit terinfeksi T. gondii, 9. DNA Bdg.DJ.I.2., 10. DNA Klk.DJ.I.1., 11. DNA Tbn.DO.I.2
Analisis kualitas DNA hasil isolasi berasal dari organ mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras seperti tersaji pada Gambar 1, dapat dijelaskan bahwa DNA terlihat fragmennya pendek. Deoxyribonucleic acid Gyr.DO.II.1., Bgl.DJ.II.1., Bll.DJ.II.1., DNA darah mencit terinfeksi T. gondii dan DNA Klk.DJ.I.1 tidak terlihat pita DNA. Kemungkinan DNA tersebut mempunyai panjang basa yang rendah (dibawah 100 bp) sehingga tidak nampak pita pada elektroforesis. Hasil ampliikasi DNA berasal dari mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras dengan primer sag-1, seperti tersaji pada Gambar 2.
Gambar 2. Hasil ampliikasi DNA Toxolasma gondii dengan primer sag-1 pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras. Keterangan: M. Marker (1200 bp), 1.DNA Tbn.DO.II.1, 2.DNA Klk.DJ.II.1, 3.DNA Dps.DJ.I.1., 4.DNA Bdg.DJ.II.1., 5.DNA Gyr.DO.II.1., 6. DNA Bgl.DJ.II.1., 7. DNA Bll.DJ.II.1., 8. DNA darah mencit terinfeksi T. gondii, 9. DNA Bdg.DJ.I.2., 10. DNA Klk.DJ.I.1., 11. DNA Tbn.DO.I.2., 12. DNA takizoit T. gondii (kontrol positif), 13. Kontrol negatif.
Hasil ampliikasi DNA T. gondii pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras tidak terlihat pita DNA dari hasil elektroforesis. Hasil ini mengindikasikan bahwa DNA T. gondii berasal dari mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras dengan primer sag-1 tidak berhasil diampliikasi menggunakan metode PCR. Hasil elektroforesis dari produk PCR ternyata tidak muncul pita DNA (Gambar 2), hal ini kemungkinan karena DNA yang diampliikasi kuantitasnya terlalu rendah tidak mencukupi untuk ampliikasi secara PCR atau kemurnian DNA yang kurang sehingga terganggu oleh kehadiran protein atau fenol yang dapat mengganggu PCR. Kemurnian DNA 1,5 – 1,8 masih memenuhi standar murni (Sambrook and Russell, 2001), demikian pula konsentrasi minimal 1 µg/µl DNA template diperlukan untuk PCR (Brown, 2006)[2].
Sampel organ untuk isolasi DNA berasal dari mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras dan sudah ditera titer serumnya. Mencit yang dipilih untuk sampel deteksi molekuler T. gondii adalah yang mengalami peningkatan titer serum dari preinokulasi, 2 minggu I inokulasi dan 2 minggu II inokulasi, hal ini dimaksudkan untuk memastikan bahwa terjadi respon antibodi IgG yang terus meningkat selama infeksi. Sesuai pendapat Jacobs et al.(1960) bahwa hewan dengan titer antibodi 1:2048, pada ototnya kemungkinan mengandung T. gondii sehingga dapat diproses untuk ekstraksi sistanya[1]. Pada penelitian ini organ yang dipilih untuk pemeriksaan molekuler dengan
PCR berasal dari mencit yang mempunyai titer serum 512 – 1024 EU. Hasil ini mengindikasikan bahwa titer serum pada mencit 1024 EU tidak disertai dengan kehadiran sista T. gondii pada organnya, sehingga tidak dapat dideteksi secara molekuler.
4. Kesimpulan dan Saran
Pemeriksaan molekuler T. gondii pada mencit yang diinfeksi inokulat jantung dan otak ayam buras, tidak berhasil dideteksi. Disarankan untuk melakukan uji kualitas (kemurnian) dan kuantitas (konsentrasi) DNA untuk mendapatkan hasil PCR yang maksimal.
5. Ucapan Terima Kasih
Kepada DP2M DIKTI terimakasih atas bantuan dana penelitian melalui Hibah Penelitian Fundamental dan kepada semua pihak yang ikut terlibat dalam penelitian ini, terimakasih atas bantuan tenaga serta dukungannya.
6. Daftar Pustaka
[1] Tenter, A.M.; Heckeroth, A.R.; Weiss, L.M. 2000. Toxoplasma gondii : From Animals to humans. Int.J.of Parasitol. 30 : 1217-1258.
[2] Subekti, D.T.; Artama, W.T. dan Iskandar, T. 2005. Perkembangan kasus dan Teknologi diagnosis Toksoplasmosis. Lokakarya Nasional Penyakit Zoonosis. Bogor.
[3] Priyana, A.(2000). Antibodi Anti Toxoplasma pada Ayam Kampung (Gallus domesticus) di Jakarta. Majalah Kedokteran Indonesia. 50(11): 504-507.
[4] Mufasirin; Suprihati, E dan Suwanti, L.T. (2003). Studi Toksoplasmosis pada Telur Ayam yang dijual sebagai campuran jamu di kota Surabaya dan Kabupaten Sidoarjo menggunakan uji Dot Blot. Jurnal Penelitian Medika Eksakta. 4(2): 113-119
[5] Suwanti, LT.; Suprihati, E.; Mufasirin. (2006). Prevalensi Toxoplasmosis pada Ayam di beberapa Pasar di kota Surabaya. Media Kedokteran Hewan. 22(1): 32-35.
[6] Shojaee, S.; Rezaei, S. and Keshavarz. 2007a. Detection of Toxoplasma gondii from sera and urine of experimentally infected mice by PCR. Pak J Biol Sci. 10(1): 193-195.
[7] Janitschke, K. 1999. Animal Models of Toxoplasma Infection.Handbook of Animal Models of Infection. Academic Press : 811-820.
[8] Nguyen, T.D.; De Kesel, M.; Bigaignon, G.; Hoet, P.; Pazzaglia, G.; Lammens, M. And
Delmee, M. 1996. Detection of Toxoplasma gondii Tachyzoites and Bradyzoites in Blood, Urine and Brain of Infected Mice. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 3(6) : 635 – 639.
[9] Jensen, I.; Heegaard, P.M.H. and Lind, P. 1998. A Study of virulence parameter for Toxoplasma gondii infection in mice. Parasitol Res. 84 : 382 – 387.
[10] Dubey, J.P.; Shen, S.K.; Kwok, O.C.H.and Frenkel, J.K. 1999.Infection and Immunity with the strain of Toxoplasma gondii in Rats and Mice. J.Parasitol. 85(4) : 657-662.
[11] Shojaee, S.; Keshavarz, H. Rezaian, M. And Mohebali, M. 2007b. Detection of Toxoplasma gondii antigens in sera from experimentally infected mice. Pak J Med Sci. 23(1) : 100 – 102. [12] Peterico, S.B.; Langoni, H.; Da Sila, A.V. and Da Silva, R.C. 2009. Evaluation of Toxoplasma
gondii placental transmission in BALB/c mice model. Exp.Parasitol. 123 : 168 – 172. [13] Burg JL, Grover CM., Poeletty P, Boothroyd JC. 1989. Direct and Sensitive Detection of a
pathogenic protozoa Toxoplasma gondii by Polymerase chain Reaction. J of Clin Microbiol. 27: 1787–1792
[14] Savva D, Morris JC, Johnson JD, Holliman RE. 1990. Polymerase Chain Reaction from detection of Toxoplasma gondii.J Med Microbiol. 32: 25-31
[15] Hohlield P, Daffos F, Costa JM, Thulliez P, Forestier F, Vidaud M. 1994. Prenatal diagnosis of congenital Toxoplasmosis with Polymerase Chain Reaction test on amniotic luid. The New England J of Med. 331 (11) : 695-699.
[16] Owen MR, Clarkson MJ, Trees AJ. 1998. Diagnosis of Toxoplasma abortion in ewes by polymerase chain reaction. The Vet Record. 142: 445-448.
[17] Susanto L, Supali T, Gandahusada S. 2002. Penentuan konsentrasi minimal Gen B1 dan Gen P30 Toxoplasma gondii yang masih terdeteksi dengan reaksi Rantai Polimerase. Makara Kesehatan 6(2) : 64-70.
[18] Priyowidodo. 2003. Kajian Metoda Diagnosis Toksoplasmosis secara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Pemeriksaan Hstologis. Tesis. Yogyakarta. UniversitasGadjah Mada. [19] Yuwono T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Edisi pertama. Yogyakarta.
Penerbit Andi. Pp.1-237
[20] Sarva U. and Holliman RE. 1989. Diagnosis of Ovine Toxoplasmosis: an alternative to Serology. Vet Record 125: 212-213.
[21] Haid, J.; Flori, P.; Raberin, H. And Tran Manh Sung, R. 2001. Comparison of PCR, Capture ELISA and Immunoblotting for Detection of Toxoplasma gondii in Infected mice. J.Med. Micobiol. 50: 1100-1104.
[22] Purwanto, M.; Lusida, M.I. dan Handayani, R. 1997. Polymerase chain reaction. Dalam Biologi Molekuler Kedokteran. Editor Suhartono Taat Putra. Edisi pertama. Erlangga Universiy Press.: 150-16
[23] Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Cetakan pertama. Penerbit Kanisius. Pp.21-279. [24] Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001. The Basic Polymerase Chain Reaction. In Molecular
cloning. A Laboratory manual. Third Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork. Vol 2: 8.18 – 8.24.
[25] Brown, T.A. 2006. The Basic Principles of Gene Cloning and DNA Analysis. In GeneCloning and DNA Analysis. An Introduction. Fifth Ed. Blackwell Publishing: 1 – 84
[26] Jacobs, I; Remington, JS. And Milton, MI. 1960. A Survey of meat samples from swine, cattle and sheep for the presence of encysted Toxoplasma. J.Parasitol. 46: 23-26