BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.4. Efek Radiasi Terhadap Sel
Iradiator gamma dimanfaatkan untuk aplikasi iradiasi gamma baik dalam skala laboratorium maupun skala pilot untuk berbagai proses iradiasi seperti polimerisasi, gafting, mutasi tanaman, sterilisasi bahan, pelapisan permukaan bahan (BATAN, 1995). Iradiator Gamma yang digunakan pada penelitian ini adalah iradiator Gamma Chamber-4000 A (Gambar 3). Gamma Chamber-4000 A mampu meradiasi bahan dengan volume maksimum 2 liter per batch. (BATAN, 1995).
2.4 Efek Radiasi Terhadap Sel
Jika radiasi sinar gamma mengenai sel organisme, maka dapat mengionisasi atau mengeksitasi atom. Setiap terjadi proses ionisasi atau eksitasi, radiasi akan kehilangan sebagian energinya. Energi radiasi yang hilang akan menyebabkan peningkatan temperatur (panas) pada bahan (atom) yang berinteraksi dengan radiasi tersebut. Dengan kata lain, semua energi radiasi yang terserap di jaringan biologis akan muncul sebagai panas melalui peningkatan
11
vibrasi (getaran) atom dan struktur molekul. Ini merupakan awal dari perubahan kimiawi yang kemudian dapat mengakibatkan efek biologis yang merugikan.
Efek radiasi terhadap sel meliputi: efek langsung dan efek tidak langsung.
Efek langsung adalah terjadinya pemutusan ikatan senyawa-senyawa penyusun sel. Efek tidak langsung terjadi karena materi sel terbanyak adalah air, yang apabila terkena sinar gamma akan mengalami hidrolisis dan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas inilah yang akan mempengaruhi sistem metabolisme atau penyebab kerusakan materi sel (Alatas dkk., 2005).
Satuan dasar dari jaringan biologis adalah sel. Sel mempunyai inti sel yang merupakan pusat pengontrol sel. Sel terdiri dari 80% air dan 20% senyawa biologis kompleks. Jika radiasi pengion menembus jaringan, maka dapat mengakibatkan terjadinya ionisasi dan menghasilkan radikal bebas, misalnya radikal bebas hidroksil (OH), yang terdiri dari atom oksigen dan atom hidrogen.
Secara kimia, radikal bebas sangat reaktif dan dapat mengubah molekul-molekul penting dalam sel. Salah satu molekul yang terdapat di inti sel, berperan untuk mengontrol struktur dan fungsi sel adalah deoxyribonucleic acid (DNA). Ada dua cara radiasi dapat mengakibatkan kerusakan pada sel. Pertama, radiasi dapat mengionisasi langsung molekul DNA sehingga terjadi perubahan kimiawi pada DNA. Kedua, perubahan kimiawi pada DNA terjadi secara tidak langsung, yaitu jika DNA berinteraksi dengan radikal bebas hidroksil. Terjadinya perubahan kimiawi pada DNA tersebut, baik secara langsung maupun tidak langsung, dapat menyebabkan mutasi.
Iradiasi dengan sinar gamma dapat menyebabkan beberapa mutasi untuk gen sel melalui mekanisme perbaikan DNA dalam sel (Thacker, 1986). Penelitian Chang dkk. (2003) menyatakan bahwa Pleurotus ostreatus diinduksi oleh radiasi sinar gamma mengalami mutasi pada gen MNP Mangan (II) peroksidase. Abo-State dkk. (2011) menambahkan bahwa Pleurotus sajor-cajuI yang diinduksi sinar gamma dosis 0,75 dan 1 KGy mampu memproduksi enzim MnP 0, 165 u/ml atau 4 kali lebih tinggi dibandingkan kontrol. Namun demikian peningkatan dosis radiasi gamma akan menurunkan pertumbuhan miselium P. sajor-caju. Hal ini dapat dijelaskan bahwa iradiasi gamma juga menyebabkan berbagai kerusakan DNA dalam sel apabila dosisnya meningkat.
2.4 Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa
Enzim lignoselulolitik terdiri dari sekumpulan enzim yang terbagi dalam dua kategori yaitu hidrolitik dan oksidatif. Enzim hidrolitik mendegradasi selulosa dan hemiselulosa dan setiap enzim bekerja terhadap substrat yang spesifik. Enzim oksidatif merupakan enzim non spesifik dan bekerja melalui mediator bukan protein yang berperan dalam degradasi lignin.
Enzim pendegradasi lignin termasuk ke dalam enzim oksidatif karena akan mengoksidasi substrat, dalam hal ini lignin, menjadi senyawa yang lebih sederhana. Enzim ini terdiri dari dua kelompok utama yaitu lakase dan peroksidase (Perez dkk., 2002). Enzim peroksidase terdiri dari lignin peroksidase (LiP) dan mangan peroksidase (MnP) (Chahal dan Chahal, 1998). Ketiga enzim tersebut bertanggung jawab terhadap pemecahan awal polimer lignin (Akhtar dkk., 1997).
13
Lignin peroksidase (LiP) merupakan enzim ligninolitik pertama yang berhasil ditemukan (Hammel, 1997) yang diisolasi dari beberapa jamur pelapuk putih (Perez, dkk. 2002) dari kelas Basidiomycetes (Piontek dkk., 2001) seperti P.
chrysosphorium (Tien dan Kirk, 1983). LiP memiliki berat molekul antara 38
sampai 47 kDa. LiP mengoksidasi inti aromatik (fenolik dan non fenolik) melalui pelepasan satu elektron menghasilkan radikal kation dan fenoksi (Akhtar dkk., 1997). LiP adalah enzim peroksidase ekstraseluler yang mengandung heme yang aktivitasnya bergantung pada H2O2, mempunyai potensial redoks yang luar biasa besar dan pH optimum yang rendah (Gold dan Alic, 1993).
Gambar 4. Skema Sistem Degrdasi Lignin oleh Phanerochaete chrysosporium (Sumber: Akhtar dkk., 1977)
Mangan peroksidase (MnP) hanya dihasilkan pada sejumlah jamur basidiomycetes (Steffen, 2003) ditemukan tidak lama setelah ditemukan LiP dari
P. chrysosphorium oleh Kuwahara dkk., (1984). MnP memiliki berat molekul
antara 43 sampai 50 kDa. MnP merupakan heme peroksidase ekstraseluler yang membutuhkan Mn2+ menjadi Mn3+ yang kemudian mengoksidasi struktur fenolik menjadi radikal fenoksil. Mn3+ yang terbentuk sangat reaktif dan membentuk kompleks dengan chelating asam organik seperti asam oksalat atau malat (Cui dan Dolphin, 1999). Dengan bantuan chelator, ion Mn3+ distabilkan dan dapat menembus ke dalam jaringan substrat (Steffen, 2003).
Gambar 5. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase (Sumber: Tomas dkk., 2010)
Degradasi selulosa oleh fungi merupakan hasil kerja sekelompok enzim selulolitik (Howard dkk., 2003) yang bekerja secara sinergis. Sistem enzim selulolitik terdiri dari tiga kelompok utama yaitu endoglukanases atau 1,4-β- D-glucan-4-glukanohydrolases, exoglukanases (1,4-β-D-glukan glukanohydrolases dan 1,4-β-D-glukan cellobiohydrolases), dan β-glukosidases atau β-glukoside
15
glukohydrolases (Perez dkk., 2002). Kapang P. chrysosporium menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas menyerupai endoglukonases (EGs).
Enzim endoglukanases menghidrolisis bagian selulosa serat (Howard dkk., 2003) menghasilkan oligosakarida (Lynd dkk., 2002). Hidrolisis bagian berkristal selulosa hanya dapat dilakukan secara efiesien oleh enzim exoglucanases (Perez dkk., 2002). Hasil kerja sinergis endoglukanases menghasilkan molekul selobiosa.
Hidrolisis selulosa secara efektif memerlukan enzim (β-glucosidases yang memecah selobiosa menjadi 2 molekul glukosa (Perez dkk., 2002).
2.5 Elektroforesis SDS-PAGE
Menurut Yuwono (2005), elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Elektroforesis dapat digunakan untuk keperluan preparatif, selain bersifat analitik, bentuknya ada yang bersifat kolom dan ada pula yang lempengan.
Salah satu jenis elektroforesis adalah elektroforesis SDS-PAGE. Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) terutama
dilakukan untuk menetapkan berat molekul protein. SDS-PAGE adalah suatu teknik biologi molekular yang digunakan untuk memisahkan protein sesuai dengan ukuran berat molekul. Instrument elektroforesis SDS-PAGE dapat dilihat pada gambar 6.
Gambar 6. Alat Elektroforesis SDS-PAGE (Sumber: Dokumen Pribadi)
Mekanisme kerja SDS-PAGE adalah protein bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif.
Protein akan terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini terpisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya (Garfin, 2003). Elektroforesis gel SDS dilakukan pada pH mendekati netral. Adanya SDS menyebabkan protein rantai ganda akan terdisosiasi menjadi rantai-rantai individual yang terdenaturasi oleh detergent ini. Peristiwa ini dibantu oleh adanya merkaptoetanol yang memecah ikatan-ikatan disulfida antar ataupun dalam rantai (mereduksi ikatan disulfida menjadi gugus-gugus sulfihidril) (Hames, 1998). Oleh karena itu protein dapat dipisahkan hanya berdasarkan ukurannya (BM), dimana kompleks SDS protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil (Garfin, 2003).
17 BAB III
METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian berlangsung dari Bulan April sampai dengan Agustus 2013.
Penelitian dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Iradiasi (PATIR) Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) Pasar Jum’at, Lebak Bulus, Jakarta Selatan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat utama yang digunakan adalah Iradiator Gamma Chamber-4000 A dari Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Iradiasi (PATIR) Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) Jakarta, seperangkat alat elektroforesis SDS PAGE Atto®, inkubator Heraeus®, Autoklaf Wish Clave®, Oven Fisher®, pH meter Hanna Instrumen®, shacking incubator Precisssion®, mikroskop Novel®, spektrofotometer Uv-Vis Hitachi®, dan saringan berukuran 100 mesh.
Bahan–bahan yang digunakan adalah serbuk jerami padi dengan ukuran 100 mesh, diambil dari sawah tadah hujan setelah panen (± umur 3 bulan) berasal dari Kabupaten Kebumen, Saboraud Dextrose Agar (SDA) Pronadisa®, larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA), marker protein Broad Range Biorad®, larutan elektroforesis SDS PAGE (Lampiran 3), larutan Lowry I dan II (Lampiran 4), Reagen Nelson (lampiran 5) dan isolat kapang P. chrysosporium yang diperoleh dari hasil isolasi batubara yang berasal dari Sumatra Selatan.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat–alat gelas yang digunakan terlebih dahulu dibersihkan, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC tekanan 1 atm selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% (Waluyo, 2008).
3.3.2 Persiapan Serbuk Jerami Padi
Jerami padi dihancurkan dengan mesin penggiling, kemudian disaring dengan saringan 100 mesh. Sampel jerami padi ditempatkan ke dalam kulkas 4ºC sampai digunakan untuk penelitian selanjutnya.
3.3.3 Pembuatan Media Saboraud Dextrose Agar (SDA)
Ditimbang media SDA sebanyak 39 gr dilarutkan dengan akuades 500 ml pada Erlenmeyer. Media SDA disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Setelah selesai disterilisasi, kemudian segera dituang ke dalam cawan petri steril.
3.3.4 Peremajaan Isolat P. chrysosporium
Sebanyak 5 ml medium SDA dimasukkan ke dalam tabung reaksi (untuk agar miring). Kultur stok atau isolat kapang diinokulasikan pada medium SDA tersebut menggunakan ose. Kultur kapang tersebut diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu ruang sampai kapang menghasilkan spora.
19
3.3.5 Proses Iradiasi Sinar Gamma
Kultur P. chrysosporium yang telah diremajakan, kemudian ditumbuhkan dalam cawan petri dengan media SDA selama 4 hari. Kultur miselium yang tumbuh kemudian dimasukkan ke dalam 4 tabung gelas vial ukuran 5 ml, dan ditambahkan 5 ml akuades. Masing-masing sampel kultur miselium dalam tabung gelas diiradiasi pada Irradiator Gamma Chamber (Co-60) dengan dosis 0 Gy (kontrol), 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy.
3.3.6 Produksi spora P. chrysosporium Pasca Iradiasi
Isolat kapang P. chrysosporium yang telah diiradiasi, kemudian ditumbuhkan pada cawan petri menggunakan media SDA dan diinkubasi selama 4-7 hari pada suhu ruang hingga menghasilkan spora. Sebanyak 10 ml NaCl 0,85% steril dimasukkan ke dalam cawan petri berisi isolat kapang, kemudian spora kapang dilepaskan menggunakan ose hingga tampak larut di dalam larutan.
Selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer 10 ml dan dihitung jumlah sel vegetatif dan spora dari kapang P. chrysosporium dengan Neubauer.
3.3.7 Pembuatan Media Serbuk Jerami
Ditimbang 2 gr serbuk jerami padi dalam 1 liter akuades. Dimasukkan serbuk jerami ke dalam Erlenmeyer 100 ml, ditambahkan dekstrose 0,1 % selanjutnya ditutup dengan alumunium foil dan disterilisasi dengan autoklaf 121oC selama 15 menit.
3.3.8 Produksi Crude Extract Enzim Ekstraseluler Kapang P.
chrysosporium
Isolat kapang P. chrysosporium yang diremajakan di cawan petri, diinkubasi pada suhu ruang sampai menghasilkan spora. Sebanyak 5 ml akuades steril dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi inokulum spora kapang P.
chrysosporium, lalu spora dilepas dengan bantuan ose. Sebanyak 1 ml inokulum
spora kapang P. chrysosporium dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer yang berisi 30 ml media jerami padi dan diinkubasi pada suhu ruang, dan agitasi 150 rpm. Pencuplikan sampel dilakukan pada hari ke-0, 1, 3, 6, 9, dan 13. Parameter yang diukur adalah pH pada substrat dan kolonisasi. Kultur disentrifugasi 3000 rpm untuk memisahkan supernatan dengan miselia dan substrat, dimana supernatan berada di sebelah atas dan substrat yang mengendap di bawah.
Selanjutnya supernatan akan dianalisis kadar protein dan profil protein masing-masing dengan metode Lowry dan elektroforesis SDS-PAGE.
3.3.9 Pengukuran pH
Supernatan dari masing-masing perlakuan diukur nilai pH-nya menggunakan pH meter. Pengukuran dilakukan setiap pencuplikan pada hari ke-0, 1, 3, 6, 9 dan 13.
3.3.10 Analisis Kadar Protein Ekstraseluler Metode Lowry
Sampel supernatan sebanyak 0,5 ml ditambahkan 2,5 ml larutan Lowry 1 (lampiran 4) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 mL larutan Lowry II (lampiran 4), divorteks dan diinkubasi
21
pada suhu ruang selama 30 menit. Kemudian dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 750 nm dan dibandingkan dengan larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA).
3.3.11 Analisis Kadar Glukosa Metode Nelson Somogyi
Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan berdasarkan metode Nelson Somogyi (Sudarmaji dkk., 1984) yaitu 2 gr sampel yang telah dihidrolisis asam maupun hidrolisis enzimatik yang telah diberi perlakuan awal, disaring dengan kertas saring, lalu filtrat yang dihasilkan dilakukan pengujian kadar gula reduksi.
Sebanyak 1 ml filtrat yang telah diencerkan dicampur dengan 1 ml larutan reagen Nelson, dipanaskan selama 20 menit sampai mendidih, didinginkan, ditambahkan 1ml larutan arsen, dilakukan pengadukan dan ditambah dengan 7 ml air destilat.
Selanjutnya dilakukan pengukuran dengan Spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm untuk mendapatkan nilai absorbansi.
3.3.12 Karakterisasi Enzim Ekstraseluler dengan Elektroforesis SDS-PAGE Karakterisasi enzim ekstraseluler dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan SDS-PAGE. Menurut Laemli (1970) tahapan kerja elektroforesis yang dilakukan antara lain:
1. Preparasi sampel
Sebanyak 30 µl supernatan ditambahkan 50 µl buffer sampel lalu dipanaskan pada suhu 95 °C selama 10 menit. Kemudian sampel disentrifugasi 6000 rpm selama 10 menit.
2. Preparasi gel elektroforesis a. Resolving gel (10%)
Sebanyak 3,3 ml Acrylamid 30 % dicampurkan dengan resolving gel buffer (1,5 Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 2,5 ml, kemudian akuabides 4,1 ml, SDS
20 % sebanyak 0,05 ml, amonium persulfate (APS) 10 % sebanyak 0,05 ml dan TEMED 0,005 ml.
b. Stacking gel (4%)
Sebanyak 0,67 ml Acrylamid 30 % dicampurkan dengan separating gel buffer (0,5 Tris-HCl, pH 6,8) sebanyak 1,25 ml kemudian akuabides 3,075 ml,
SDS 0,025 ml, amonium persulfate (APS) 0,025 ml dan TEMED 0,005 ml.
3. Proses Elektroforesis
Setelah resolving gel dibuat, kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan akuades untuk meratakan resolving gel tersebut. Setelah resolving gel membeku, akuades dibuang dan dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu dipasang sisir pembentuk kolom dan dibiarkan hingga stacking gel membeku kemudian sisir diangkat.
Sebanyak 600 ml larutan running buffer dimasukkan dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel dan marker protein masing-masing sebanyak 10 µl dan 5 µl dimasukkan ke dalam kolom gel yang sudah terbentuk lalu dielektroforesis dengan kecepatan 200 Volt dan kuat arus 40 mA selama ± 45 menit atau hingga warna biru (Bromtimol Blue) sebagai penanda pada sampel mencapai batas bawah gel.
23
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining R-250 kurang lebih selama 1 jam. Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250 kurang lebih selama 24 jam. Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan Lab Image 1 D untuk diketahui berat molekulnya.
3.3.13 Analisis Degradasi Hemiselulosa, Lignin, dan Selulosa (Metode Chesson)
a. Kadar Hemiselulosa
Pengukuran kadar hemiselulosa dianalisis dengan metode Chesson (Datta, 1981) yaitu sebanyak 1-2 gr sampel dicampur dengan 150 ml air destilat, dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 2 jam, difiltrasi dengan kertas saring dan terakhir dibilas dengan air destilat, bagian padat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC sampai konstan dan ditimbang beratnya (a). Selanjutnya sampel dicampur dengan 150 ml larutan H2SO4 1 N, dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 1 jam, difiltrasi dengan kertas saring dan terakhir dibilas dengan air destilat.
Kemudian bagian padat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC sampai konstan dan ditimbang beratnya (b).
b. Kadar Selulosa
Pengukuran kadar selulosa dianalisis dengan metode Chesson (Datta, 1981) yaitu sampel yang telah dikeringkan pada analisis hemiselulosa (b) dicampur dengan larutan H2SO4 72 % sebanyak 10 ml, dilakukan perendaman selama 4 jam, lalu dicampur dengan 150 ml larutan H2SO4 1 N, dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 2 jam, difiltrasi dengan kertas saring dan terakhir dibilas
dengan air destilat. Kemudian bagian padat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC sampai konstan dan ditimbang beratnya (c).
Kadar hemiselulosa = X 100 %
c. Kadar Lignin
Pengukuran kadar lignin dianalisis dengan metode Chesson (Datta, 1981), yaitu sampel yang telah dikeringkan pada analisis selulosa (c), selanjutnya dipanaskan pada suhu 600 ºC selama 4-6 jam lalu ditimbang beratnya (d).
Kadar lignin = X 100 %
3.3.14 Analisis Data
Data yang telah didapat dari pengukuran pH medium, kadar protein dan kolonisasi dianalisis secara deskriptif dengan Ms. Excel 2007. Analisis hasil elektroforesis dengan Lab Image 1 D untuk menentukan nilai RF (Retensi Faktor) sebagai representasi dari profil protein yang dihasilkan dan berat molekulnya.
25 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pertumbuhan Kapang Phanerochaete chrysosporium pada Permukaan Media Saboraud Dextrose Agar (SDA)
Pertumbuhan kapang P. chrysosporium hasil iradiasi gamma pada media SDA menunjukkan hasil yang berbeda (Gambar 7). Pertumbuhan kapang hasil iradiasi lebih baik dibandingkan kontrol. Pertumbuhan kapang terbaik terjadi pada dosis 40 Gy, kemudian diikuti oleh dosis 20 Gy, 10 Gy, dan 0 Gy (kontrol). Persentase pertumbuhan miselia kapang dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy masing-masing sebesar 10,5 %, 24,5 %, 48,9 %, dan 70 %. Hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan kapang sebanding dengan meningkatnya dosis iradiasi.
Gambar 7. Pertumbuhan miselia kapang Phanerochaete chrysosporium pasca iradiasi dalam media SDA setelah inkubasi hari ke-7 pada suhu ruang.
Perlakuan dosis 40 Gy menunjukkan miselia kapang P. chrysosporium mampu tumbuh dengan baik, dengan persentase pertumbuhan miselia sebesar 70 %.
Hal ini didukung pengamatan makroskopis (lampiran 8) pertumbuhan miselia kapang hampir menutupi seluruh permukaan media SDA. Menurut Alexopoulus dkk. (1996) kapang P. chrysosporium memiliki tipe pertumbuhan ekstensif selama substrat masih tersedia. Sel-sel hifa pada bagian ujung miselium merupakan sel-sel yang memiliki tingkat metabolisme tinggi. Sel-sel tersebut mensekresikan enzim dan polimer untuk pertumbuhan ujung-ujung hifa. Pertumbuhan kapang P. chrysosporium pada media SDA diduga dipengaruhi oleh efek iradiasi yang terjadi pada sel kapang yang dapat menyebabkan mutasi. Crowder (1986) melaporkan bahwa iradiasi sinar gamma menembus bagian tertentu dari gen dapat menyebabkan perubahan susunan basa nitrogen pada DNA. Frekuensi mutasi berbanding lurus dengan dosis radiasi sinar gamma. Perubahan untaian DNA akan menyebabkan fenotip pada kapang berubah.
4.2. Pertumbuhan Kapang Phanerochaete chrysosporium pada Media Jerami Padi
4.2.1. Kolonisasi Kapang Phanerochaete chrysosporium pada Media Jerami Padi Kapang P. chrysosporium hasil perlakuan iradiasi gamma dapat tumbuh pada substrat jerami padi (Gambar 8). Hal ini ditandai dengan adanya kolonisasi berupa terselimutinya substrat jerami padi oleh miselia kapang P. chrysosporium. Hasil pengamatan memperlihatkan kolonisasi miselia kapang P. chrysosporium dalam substrat jerami padi berbeda pada setiap dosis perlakuan.
27
Spora-spora kapang P. chrysosporium terlihat bergerminasi setelah hari ke-1 inkubasi. Hal ini ditandai dengan memanjangnya sel spora. Germinasi ini terjadi karena sel spora memanfaatkan nutrien sederhana yang ditambahkan ke dalam media berupa dekstrosa. Pemberian medium dekstrosa pada media merupakan sumber karbon yang dapat membantu dalam proses degradasi jerami padi guna memberikan energi awal untuk kapang agar dapat menggunakan substrat jerami padi pada proses selanjutnya. Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Liu dan Orskov (2000), didapatkan hasil bahwa pertumbuhan kapang dapat dipacu dengan pemberian medium yang mengandung gula sehingga jerami padi dapat terdegradasi.
Waktu (Hari ke-)
0 Gy 10 Gy 20 Gy 40 Gy
0
1
3
6
9
13
Gambar 8. Kolonisasi P. chrysosporium dalam media jerami padi yang diinkubasi pada suhu ruang dengan dosis iradiasi yang berbeda (perbesaran 40x) (keterangan: tanda panah merah menunjukkan susbstrat jerami padi, panah biru menunjukkan spora kapang, dan panah hijau menunjukkan miselia kapang).
Proses kolonisasi sudah mulai tampak pada hari ke-3 inkubasi. Inokulum sudah tampak jelas berikatan dengan substrat jerami padi dan membentuk jalinan miselia pada hari ke-6 hingga ke-13 inkubasi. Perbedaan jalinan miselia tampak terlihat jelas pada perlakuan dosis 20 Gy dan 40 Gy. Jalinan miselia pada dosis perlakuan 20 Gy tampak terlihat sangat rapat menyelimuti substrat jerami padi pada hari ke-6 inkubasi. Jalinan miselia pada dosis 40 Gy belum terlihat jelas dan
29
cenderung menurun pertumbuhannya pada hari ke-6 inkubasi. Hal ini berbeda pada saat ditumbuhkan dalam media SDA (Gambar 7). Hal ini diduga terjadi karena perbedaan substrat dan adanya efek radiasi yang mempengaruhi pertumbuhan kapang P. chrysosporium.
Media merupakan sumber nutrisi yang akan digunakan oleh suatu isolat kapang untuk tumbuh dan berkembang. Kandungan nutrisi media menentukan tersedia tidaknya suatu unsur yang dibutuhkan oleh kapang. Isolat kapang P.
chrysosporium dapat tumbuh pada substrat jerami padi karena di dalamnya
terkandung nutrisi yang dibutuhkan kapang untuk kelangsungan kehidupannya.
Menurut Herliyana (1997), pertumbuhan koloni isolat jamur P. chrysosporium pada susbtrat dipengaruhi oleh kondisi media kandungan nutrisi, kadar air dan tingkat keasaman.
Efek radiasi pada sel yang dapat terjadi adalah perubahan sifat selamanya atau hanya pada beberapa generasi, bahkan dapat menimbulkan kematian (Sugoro dan Tetriana, 2008). Radiasi sinar gamma yang menembus DNA target kapang mengakibatkan efek radiasi yaitu mutasi. Gen dapat dianggap sebagai suatu target atau sasaran di dalam proses mutasi. Menurut Claire (2002) secara alamiah sel mempunyai kemampuan untuk melakukan proses perbaikan terhadap kerusakan yang timbul dengan menggunakan beberapa jenis enzim spesifik. Proses perbaikan dapat berlangsung tanpa terjadi kesalahan sehingga struktur DNA kembali seperti semula (normal).
Kolonisasi yang terbentuk pada setiap dosis perlakuan membuktikan bahwa kapang P. chrysosporium dapat menggunakan substrat jerami padi. Penggunaan substrat tersebut untuk proses metabolismenya sehingga kapang P. chrysosporium mampu mendegradasi jerami padi dengan bantuan enzim hingga dihasilkan senyawa yang lebih sederhana. Enzim-enzim yang dihasilkan oleh kapang P. chrysopsorium terikat di permukaan hifa sehingga terjadi kontak dengan lignin yang ada pada jerami padi (Cathcheside dan Ralph, 1994).
Miselium yang menyelimuti substrat jerami padi semakin renggang di hari ke-9 bahkan di hari ke-13 inkubasi hanya kotak spora saja yang tampak. Hal ini karena berkurangnya sumber nutrisi sehingga terdapat sel yang mati. Munculnya spora pada hari ke-9 dan ke-13 inkubasi karena berkurangnya sumber nutrisi pada medium sehingga kapang P. chrysosporium menghasilkan struktur tubuh yang mampu bertahan pada kondisi ekstrim seperti kurangnya nutrisi pada lingkungan tempat hidupnya.
4.2.2. pH media
Perubahan pH pada proses degradasi jerami padi merupakan salah satu faktor yang menunjukkan aktifitas dari P. chrysosporium. Pola perubahan pH medium
Perubahan pH pada proses degradasi jerami padi merupakan salah satu faktor yang menunjukkan aktifitas dari P. chrysosporium. Pola perubahan pH medium