KARAKTERISASI ENZIM EKSTRASELULAR Phanerochaete chrysosporium
HASIL IRADIASI GAMMA DALAM MEDIUM JERAMI PADI
SUBAGYO
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
2013 M/1434 H
HASIL IRADIASI GAMMA DALAM MEDIUM JERAMI PADI
Oleh:
SUBAGYO 1090 9500 0046
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
2013 M/1434 H
PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU LEMBAGA MANAPUN
Jakarta, September 2013
Subagyo 109095000046
i
Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
2013
Jerami padi merupakan sumber energi yang potensial sebagai pengganti rumput untuk ternak ruminansia. Pemanfaatan jerami padi masih rendah disebabkan kualitasnya yang rendah yaitu tingginya kandungan lignin. Peningkatan kualitas jerami padi dapat dilakukan dengan memanfaatkan mikroorganisme. Mikroorganisme yang digunakan pada penelitian ini adalah isolat P. chrysosporium. Dalam penelitian ini digunakan pemanfaatan teknik nuklir yaitu radiasi sinar gamma untuk meningkatkan produksi enzim ekstraseluler P. chrysosporium. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil protein ekstraseluler dari P. chrysosporium yang diradiasi gamma dengan variasi dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, 40 Gy dalam medium jerami padi. Tahapan penelitian terdiri dari iradiasi kultur spora, kultivasi pada medium SDA dan produksi enzim ekstraseluar dalam medium serbuk jerami padi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat P. chrysosporium hasil iradiasi dosis 40 Gy memiliki pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan dosis lainnya pada media peremajaan SDA. Hasil analisis kadar protein menunjukkan bahwa kadar protein tertinggi terjadi pada hari ke-3 inkubasi untuk dosis 10 Gy. Semua perlakuan dosis mengalami peningkatan kadar gula hingga hari ke-13 kecuali kontrol. Karakteristik enzim ekstraseluler kapang P.
chrysosporium pada perlakuan dosis 20 Gy tidak memiliki perbedaan dengan kontrol (0 Gy), sedangkan perlakuan dosis 10 Gy dan 40 Gy berbeda dengan kontrol (0 Gy).
Enzim yang terdeteksi pada perlakuan dosis 0 Gy dan 20 Gy adalah enzim lakase (BM= 110 kDa) dan dua enzim belum diketahui karakteristiknya (BM = 35 kDa dan 21,5 kDa). Enzim yang terdeteksi pada perlakuan dosis 10 Gy adalah enzim Lignin Peroksidase (BM= 42 kDa), Mangan Peroksidase (BM= 48 kDa), dan lakase (BM=
110 kDa) serta dua enzim belum diketahui karakteristiknya (BM= 35 kDa dan 21,5 kDa. Enzim yang terdeteksi pada perlakuan dosis 40 Gy adalah enzim lakase (BM=
110 kDa) dan enzim Lignin Peroksidase (BM= 40 kDa) serta satu enzim belum terdeteksi karakteristiknya (BM= 22 kDa).
Kata kunci: Enzim Ekstraseluler, Phanerochaete chrysosporium, Iradiasi Gamma, Jerami Padi
ii ABSTRACT
Subagyo. Extracellular Enzymes Characterization of Gamma Irradiated Phanerochaete chrysosporium in Rice Straw Medium. Undergraduate Thesis.
Biology Departement. Faculty of Science and Technology. Syarif Hidayatullah State Islamic University Jakarta. 2013
Rice straw is a potential source of energy as substitute of grass for ruminants.
Utilization of rice straw is low due to the low quality of the high content of lignin.
Quality of rice straw can be improving by utilizing microorganisms. Microorganisms used in this research were isolates of P. chrysosporium. This study used gamma radiation to increase the production of extracellular enzymes of P. chrysosporium.
The purpose of this research was to determine the profiles of extracellular protein from P. chrysosporium which was irradiated by gamma rays with doses of 0 Gy 10 Gy, 20 Gy, 40 Gy in medium rice straw. Stages of the research were irradiated spore culture, cultivation on SDA medium and enzyme production in the medium ekstraseluar rice straw powder. The results showed that dose of 40 Gy could initiated the best growth of P. chrysosporium in SDA media. The highest of protein content occurred on the third day of incubation belonged to a dose of 10 Gy. Sugar content of all treatments has increased until the 13th days incubation except dose of 0 Gy (control). Characteristics of extracellular enzymes showed that treatment of dose 20 Gy had no difference with the control (0 Gy), but treatment of 10 Gy and 40 Gy was different. Enzymes were detected at treatment dose 0 Gy and 20 Gy i.e. laccase enzyme (MW 110 kDa) and two enzymes was not yet known characteristics (MW 35 kDa and 21,5 kDa). The enzyme was detected at a dose of 10 Gy treatment i.e. Lignin peroxidase enzyme (MW 42 kDa), manganese peroxidase (molecular weight 48 kDa), laccase enzyme (MW 110 kDa) and two enzymes is not yet known characteristics (35 kDa and 21,5 kDa. Enzymes were detected the treatment dose of 40 Gy is laccase enzyme (MW 110 kDa) and enzyme lignin peroxidase (MW 40 kDa) and the enzyme has not been detected characteristics (molecular weight 22 kDa).
Keywords: Extracellular Enzymes, Phanerochaete chrysosporium, Gamma Iradiation, Rice Straw
iii
Segala puji bagi Allah SWT, Tuhan semesta alam yang telah memberikan nikmat tak terbatas, atas rahmat, hidayah dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini. Salawat serta salam senantiasa tercurahkan untuk baginda Nabi Muhammad SAW yang memperjuangkan kesempurnaan agama ini sampai akhir hayat. Skripsi dengan judul “Karakterisasi Enzim Ekstraseluler Phanerochaete chrysosporium Hasil Iradiasi Gamma Dalam Medium Jerami Padi” disusun sebagai salah satu syarat dalam menyelesaikan program studi S1 pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada pihak- pihak yang telah membantu dalam penyusunan skripsi ini yaitu :
1. Orang tua penulis yang selalu mendoakan dan memberi dukungan baik moril dan materil kepada penyusun.
2. Dr. Irawan Sugoro, M.Si. selaku pembimbing I yang memberikan bimbingan, saran, nasihat dan pengarahan tentang penelitian dan penulisan skripsi.
3. Megga Ratnasari Pikoli, M.Si. selaku pembimbing II yang senantiasa memberikan informasi-informasi, saran dan pengarahan dalam melakukan penelitian dan penulisan skripsi.
iv
4. Dr. Agus Salim, M.Si. selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
5. Dasumiati, M.Si. selaku Ketua Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
6. Seluruh Dosen Program Studi Biologi yang telah memberi ilmunya sehingga bermanfaat bagi Penulis.
7. Seluruh staf PATIR BATAN yang telah membantu dan memberikan bimbingan kepada penyusun.
8. Restu Yuslida, S.Si yang selalu memberikan motivasi kepada penulis.
9. Teman-teman PT Prudential Life Asurance (Ka Linda, Cha-Cha, Buthonk) yang telah membantu hingga selesainya perkuliahan ini.
10. Teman-teman Biologi angkatan 2009 yang telah memberikan dukungan dan bantuannya
Penulis menyadari bahwa kesempurnaan hanya milik Allah SWT, oleh karena itu saran yang bersifat membangun sangat diharapkan demi penyempurnaan skripsi ini.
Jakarta, Sepetember 2013
Subagyo 109095000046
v
ABSTRAK ... i
ABSTRACT ... ii
KATA PENGANTAR ... iii
DAFTAR ISI ... v
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... ix
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Perumusan Masalah ... 3
1.3. Hipotesis ... 3
1.4. Tujuan Penelitian ... 4
1.5. Manfaat Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Jerami Padi... 5
2.2. Kapang Phanerochaete chrysosporium ………... ... 6
2.3. Iradiasi Sinar Gamma ... 8
2.4. Efek Radiasi Terhadap Sel………... 10
2.5. Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa………... ... 12
2.5. Elektroforesis SDS-PAGE ... 15
vi BAB III METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ... 17
3.2. Alat dan Bahan ... 17
3.3. Prosedur Kerja ... 18
3.3.1. Persiapan dan Sterilisasi Alat ... 18
3.3.2. Persiapan Serbuk Jerami Padi... 18
3.3.3. Pembuatan Medium SDA ... 18
3.3.4. Peremajaan Isolat P. chrysosporium ... 18
3.3.5. Proses Iradiasi Sinar Gamma ... 19
3.3.6. Produksi Spora P. chrysosporium Pasca Iradiasi ... 19
3.3.7. Pembuatan Media Serbuk Jerami Padi ... 19
3.3.8. Produksi Crude extract Enzim P. chrysosporium ... 20
3.3.9. Pengukuran pH Medium ... 20
3.3.10. Analisis Kadar Protein Metode Lowry ... 20
3.3.11. Analisis Kadar Glukosa Metode Nelson Somogy ... 21
3.3.12. Karakterisasi Enzim dengan Elektroforesis ... 21
3.3.13. Analisis Degradasi Hemiselulosa, Lignin, dan Selulosa .... 23
3.3.14. Analisis Data ... 24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Pertumbuhan Kapang Phanerochaete chrysosporium Pada Permukaan Media SDA ... 25
vii
4.2.2. pH Media ... 30
4.2.3. Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa ... 33
4.2.4. Kadar Glukosa Media ... 35
4.3.5. Kadar Protein Media ... 37
4.3.6. Karakteristik Enzim Ekstraseluler P. chrysosporium ... 41
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan ... 44
5.2. Saran ... 44
DAFTAR PUSTAKA ... 45
LAMPIRAN ... 51
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Miselium P. chrysosphorium ... 6
Gambar 2. Bagan Peluruhan Co-60 ... 9
Gambar 3. Skema Iradiator Gamma Chamber-4000 A ... 10
Gambar 4. Skema Sistem Degrdasi Lignin oleh P. chrysosporium ... 13
Gambar 5. Mekanisme Hidrolisis Selulosa ... 14
Gambar 6. Alat Elektroforesis SDS-PAGE ... 16
Gambar 7. Pertumbuhan Kapang P. chrysosporium Pada Media SDA ... 25
Gambar 8. Kolonisasi Kapang P. chrysosphorium Pada Media Jerami ... 28
Gambar 9. Nilai pH Medium ... 31
Gambar 10. Hasil Analisis Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa ... 33
Gambar 11. Kadar Glukosa Medium Kapang P. chrysosphorium... 36
Gambar 12. Kadar Protein Ekstraseluler P. chrysosphorium ... 38
Gambar 13. Profil Enzim Hasil Elektroforesis ... 42
ix
Lampiran 1. Kerangka Berpikir ... 51
Lampiran 2. Skema Kerja ... 52
Lampiran 3. Komposisi Larutan Elektroforesis ... 53
Lampiran 4. Komposisi Larutan Lowry ... 54
Lampiran 5. Reagen Nelson ... 54
Lampiran 6. Hasil Pengukuran pH ... 55
Lampiran 7. Pertumbuhan Kapang P. chrysosporium Pada Media Jerami... 55
Lampiran 8. Pertumbuhan Kapang P. chrysosphorium Pada Media SDA ... 56
Lampiran 9. Persentase Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa ... 56
Lampiran 10. Kurva Standar Absorbansi Glukosa ... 57
Lampiran 11. Hasil Pengukuran Kadar Protein ... 58
Lampiran 12. Hasil Elektroforesis SDS-PAGE ... 59
Lampiran 13. Pita-pita Profil Enzim ... 60
1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Jerami padi merupakan sumber energi yang potensial sebagai pengganti rumput untuk ternak ruminansia. Namun demikian belum dimanfaatkan secara maksimal. Menurut data Badan Pusat Statistik (2012) produksi padi tahun 2012 sebesar 69,05 juta ton Gabah Kering Giling (GKG) atau mengalami kenaikan sebesar 3,29 juta ton (5,00 persen) dibanding tahun 2011. Potensi jerami padi yang sangat besar ini masih disia-siakan oleh petani. Sebagian besar jerami padi dibuang dan hanya sebagian kecil peternak yang memanfaatkannya sebagai pakan. Pemanfaatan jerami padi yang rendah sebagai pakan ternak disebabkan kualitasnya yang rendah.
Kualitas jerami padi yang rendah disebabkan oleh tingginya kandungan lignin (Tang dkk., 2008). Kandungan lignin yang tinggi berpengaruh terhadap rendahnya kecernaan jerami padi sebagai pakan ternak. Lignin sering berikatan dengan selulosa membentuk lignoselulosa yang sulit untuk dicerna oleh mikroba rumen. Oleh karena itu perlu dilakukan proses pengolahan jerami padi terlebih dahulu untuk memudahkan dalam proses pencernaan. Salah satu pengolahan yang telah banyak dilakukan yaitu secara biologis. Pengolahan secara biologis dilakukan dengan memanfaatkan bantuan mikroorganisme untuk mendegradasi lignin.
Kapang merupakan salah satu mikroorganisme yang mampu mendegradasi lignin (Singh, 2006). Kapang dari kelas Basidiomycetes dapat mendegradasi
lignin karena mampu mensintesis enzim ligninase. Ada tiga enzim ligninase dari kapang kelas Basidiomycetes yaitu lignin peroxidase (LiP), mangan peroxidase (MnP), dan laccase, masing-masing mempunyai berat molekul 38-47 kDa, 43-50 kDa, dan 53-110 kDa (Fakuosa dan Hofrichter, 1999). Menurut Singh (2006) white rot fungi merupakan mikroorganisme yang paling aktif dalam mendegradasi
lignin. Kapang Phanerochaete chrysosporium merupakan kelompok white rot fungi yang sering dipelajari dan diteliti oleh para ilmuwan dalam mendegradasi
lignin. Kapang P. chrysosporium diketahui mampu mensintesis enzim lignin peroksidase (LiP) dan mangan peroksidase (MnP) dalam mendegradasi lignin (Hatakka, 1994). Penggunaan kapang P. chrysosporium merupakan penelitian lanjutan yang sebelumnya telah digunakan untuk proses biosolubilisasi batubara (Hidayati, 2011)
Salah satu upaya untuk meningkatkan produktivitas enzim kapang P.
chrysosporium dengan pendekatan bioteknologi adalah melakukan mutasi
melalui iradiasi dengan cara mencoba berbagai dosis radiasi (Aryantha dan Rachmat, 1999). Setelah didapatkan dosis yang optimum, maka diuji produktivitasnya di lapangan di mana mutan yang memberikan hasil terbaik selanjutnya dikembangkan sebagai kultur induk. Dalam penelitian ini akan digunakan pemanfaatan teknik nuklir yaitu iradiasi sinar gamma (Co-60) pada P.
chrysosporium. Menurut Djajanegara dkk. (2007) iradiasi dengan sinar gamma
(Co-60) menyebabkan mutasi pada jamur tiram abu-abu (Pleurotus sajur-caju).
Dosis iradiasi yang digunakan adalah 0,75 KGy dengan kecepatan dosis 1,149 KGy. Analisis profil enzim menunjukkan intensitas pita protein antara mutan dan
3
kontrol berbeda. Intensitas pita pada mutan lebih terang yang menunjukkan bahwa terjadi perubahan pada produksi enzim di mana pada mutan lebih banyak produksi enzimnya daripada kontrol.
Berdasarkan pertimbangan tersebut di atas, maka pada penelitian ini dilakukan iradiasi sinar gamma pada kultur miselium yang telah dipisahkan dari media tumbuh dengan dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy. Karakterisasi enzim dilakukan dengan cara elektroforesis menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) untuk mengetahui perbedaan
karakteristik enzim dilihat dari profil-profilnya sehingga dapat diketahui efek iradiasi terhadap enzim ekstraseluler P. chrysosporium.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah terdapat perbedaan karakteristik enzim ekstraseluler dari Phanerochaete chrysosporium yang diiradiasi gamma dengan variasi dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy dalam medium jerami padi?
1.3 Hipotesis
Terdapat perbedaan karakteristik enzim ekstraseluler Phanerochaete chrysosporium yang diiradiasi gamma dengan variasi dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy dalam medium jerami padi.
1.4 Tujuan Penelitian
Mengetahui karakterisik enzim ekstraseluler dari Phanerochaete chrysosporium yang diiradiasi gamma dengan variasi dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy dalam medium jerami padi.
1.5 Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai metode yang baik dalam pengolahan jerami padi dan memberikan pengetahuan dan informasi dosis radiasi optimum untuk proses pengolahan jerami padi oleh kapang Phanerochaete chrysosporium guna meningkatkan kualitas jerami padi sebagai pakan ternak.
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Jerami Padi
Jerami padi adalah batang padi yang ditinggalkan termasuk daun, sesudah diambil buahnya yang masak (Arinong, 2008). Jerami padi merupakan produk sampingan pertanian yang sangat potensial sebagai sumber energi bagi ternak ruminansia karena produksi jerami padi sangat banyak dan tersedia sepanjang tahun. Menurut Badan Pusat Statistik (2012) produksi padi pada tahun 2012 sebanyak 69,05 juta ton, bila diasumsikan produk sampingan yang dihasilkan 50
% dari produksi padi maka produksi jerami padi sebanyak 34,075 juta ton. Dari jumlah tersebut baru sekitar 7,8 % yang sudah dimanfaatkan sebagai pakan ternak. Pemafaatan jerami padi sebagai pakan baru mencapai 31-39 % sedangkan yang dibakar sekitar 36-62 % (Syamsu, 2007).
Jerami padi sebagai pakan ternak memiliki kelemahan diantaranya adalah mengandung kadar serat yang tinggi, dan kecernaan yang rendah (Dixon, 1988).
Rendahnya daya cerna ini disebabkan oleh adanya lignin yang mengikat selulosa dan hemiselulosa, sehingga sukar dicerna oleh enzim dari mikroorganisme dalam rumen (Arinong, 2008). Penggunaan jerami padi sebagai pakan ternak mengalami kendala karena adanya faktor pembatas nilai nutrisi yang rendah yaitu kandungan protein rendah, serat kasar tinggi, dan kecernaan rendah. Menurut Arinong (2008) bahan yang terkandung dalam jerami padi meliputi: protein 3,6%, lemak 1,3%, abu 16,4%, lignin 4,9%, serat kasar 32,0%, silika 13,5%, kalsium 0,24%, kalium
1,20%, magnesium 0,11%, dan phosphor 0,10% (Arinong, 2008). Doyle dkk.
(1986) menerangkan bahwa nilai koefisien cerna bahan organik jerami padi berkisar antara 31-59%. Menurut Kartadisastra (1997) nilai cerna jerami hanya sekitar 30 % artinya dari jerami padi yang dikonsumsi 10 kg, maka hanya 3 kg saja yang dapat dicerna.
2.2 Kapang Phanerochaete chrysosporium
Kapang Phanerochaete chrysosporium merupakan jamur pelapuk putih yang ada pada kayu. Kapang ini menghasilkan enzim ekstraseluler LiP, MnP, dan Lakase (Suparjo, 2008). Enzim yang dihasilkan ini berperan dalam pelapukan kayu dan pendegradasian jerami. Kapang P. chrysosporium mempunyai suhu pertumbuhan optimum 40 ºC, pH 4 - 7, dan aerob. Jamur pelapuk putih seperti P.
chrysosporium merupakan jenis yang paling aktif mendegradasi lignin.
Gambar 1. Miselium P. chrysosporium (Sumber: Dokumen Pribadi)
Klasifikasi kapang P. chrysosporium adalah divisi: Mycota, sub divisi:
Eumycota, kelas: Basidiomycetes, ordo: Polyporales, famili: Hymenomycetaceae, genus: Phanerochaete, spesies: P. chrysosporium (Fadilah dkk., 2008). Ciri-ciri
7
spesifik dari kapang tersebut adalah memiliki miselium seperti kapas dan berwarna putih, serta memiliki spora dan talus bercabang yang disebut hifa.
Miselium kapang P. chrysosporium mempunyai tiga fase pertumbuhan yaitu fase vegetatif, seksual, dan aseksual. Fase vegetatif merupakan fase pertumbuhan dominan. Selama fase ini jamur paling banyak menghasilkan enzim ekstraseluler (Fardiaz, 1998).
Miselium dari P. chrysosporium lebih sering digunakan untuk penerapan dalam bidang bioteknologi daripada tahap sporanya (Iriani, 2003), setelah umur empat hari kapang ini akan mencapai fase lignolitik dan segera memulai mendegradasi lignin. Kapang P. chrysosporium tidak dapat tumbuh pada substrat yang hanya mengandung lignin sebagai sumber karbon untuk menunjang perkembangbiakan sel, sehingga dibutuhkan sumber lain seperti glukosa dan sukrosa (Martina, 1998).
P. chrysosporium merupakan kapang yang mempunyai kemampuan
ligninolitik paling banyak dipelajari (Howard, dkk. 2003). Keadaan ligninolitik adalah keadaan dimana jamur mengeluarkan enzim yang dapat mendegradasi lignin. Pada jamur pelapuk putih, enzim yang dikeluarkan adalah enzim peroksidase. Kapang P. chrysosporium mengeluarkan enzim heme peroksidase, yaitu lignin peroksidase (LiP) dan mangan peroksidase (MnP). Menurut Dey dkk.
(1994) P. chrysosporium lebih efisien tiga kali atau lebih dibandingkan dengan Polyporus ostreiformis dalam mendegradasi jerami padi. Rolz dkk. (1986), mempelajari biodelignifikasi rumput lemon dengan menggunakan dua belas jenis white rot fungi. Kapang P. chrysoporium merupakan salah satu diantara
keduabelas white rot fungi yang menunjukkan aktivitas lignolitik dan menghasilkan enzim pendegradasi lignin.
2.3 Iradiasi Sinar Gamma
Iradiasi adalah pancaran energi melalui suatu materi atau ruang dalam bentuk panas, partikel atau gelombang elektromagnetik dari sumber iradiasi, sedangkan secara umum iradiasi diartikan sebagai pemancaran suatu energi elektromagnetik atau partikel-partikel dengan kecepatan tinggi (Darussalam, 1996). Iradiasi ini memiliki dua sifat yang khas, yaitu tidak dapat dirasakan secara langsung oleh panca indra manusia dan beberapa jenis iradiasi dapat menembus berbagai jenis bahan. Penentuan ada atau tidak adanya iradiasi nuklir dilakukan dengan menggunakan suatu alat yang disebut dosimeter. Dosimeter merupakan pengukur radiasi untuk mendeteksi dan mengukur iradiasi baik kuantitas, energi, atau dosisnya (BATAN, 1995).
Berdasarkan muatan listriknya, radiasi dapat dibagi menjadi dua macam yaitu radiasi pengion dan radiasi non-pengion. Radiasi pengion adalah radiasi yang apabila menumbuk atau menabrak sesuatu, akan muncul partikel bermuatan listrik yang disebut ion. Peristiwa terjadinya ion ini disebut ionisasi. Ion ini kemudian akan menimbulkan efek atau pengaruh pada bahan, termasuk benda hidup. Radiasi pengion disebut juga radiasi atom atau radiasi nuklir. Termasuk ke dalam radiasi pengion adalah sinar-X, sinar gamma (γ), sinar kosmik, serta partikel beta (β), alfa (α) dan neutron. Partikel beta, alfa dan neutron dapat menimbulkan ionisasi secara langsung. Meskipun tidak memiliki massa dan muatan listrik, sinar-X, sinar gamma dan sinar kosmik juga termasuk ke dalam
9
radiasi pengion karena dapat menimbulkan ionisasi secara tidak langsung. Radiasi non-pengion adalah radiasi yang tidak dapat menimbulkan ionisasi. Termasuk ke dalam radiasi non-pengion adalah gelombang radio, gelombang mikro, inframerah, cahaya tampak dan ultraviolet (BATAN, 1995).
Sinar gamma adalah sebuah bentuk energi dari iradiasi elektromagnetik yang diproduksi oleh zat radioaktif. Sumber radionuklida yang digunakan dalam penelitian ini adalah Co-60. Co-60 dalam aplikasinya dilindungi oleh pembungkus stainlees steel dan disimpan dalam kolam air deionisasi pada kedalaman 6 meter
yang terletak dalam ruangan berllapis tebal. Co-60 memiliki emisi sinar gamma sebesar 1,17 dan 1,33 MeV. Waktu paruh 5,2 tahun dan meluruh dalam bentuk nikel yang stabil dan tidak bersifat radioaktif (Diehl, 1990). Laju dosis maksimum untuk CO-60 sebesar 0,67 kGy/jam.Reaksi pembentukan isotop Co-60 adalah sebagai berikut :
Gambar 2. Bagan Peluruhan Co-60 (Sumber: Lieser, 2001)
Gambar 3. Skema Iradiator Gamma Chamber-4000 A (Sumber: BATAN, 1995)
Iradiator gamma dimanfaatkan untuk aplikasi iradiasi gamma baik dalam skala laboratorium maupun skala pilot untuk berbagai proses iradiasi seperti polimerisasi, gafting, mutasi tanaman, sterilisasi bahan, pelapisan permukaan bahan (BATAN, 1995). Iradiator Gamma yang digunakan pada penelitian ini adalah iradiator Gamma Chamber-4000 A (Gambar 3). Gamma Chamber-4000 A mampu meradiasi bahan dengan volume maksimum 2 liter per batch. (BATAN, 1995).
2.4 Efek Radiasi Terhadap Sel
Jika radiasi sinar gamma mengenai sel organisme, maka dapat mengionisasi atau mengeksitasi atom. Setiap terjadi proses ionisasi atau eksitasi, radiasi akan kehilangan sebagian energinya. Energi radiasi yang hilang akan menyebabkan peningkatan temperatur (panas) pada bahan (atom) yang berinteraksi dengan radiasi tersebut. Dengan kata lain, semua energi radiasi yang terserap di jaringan biologis akan muncul sebagai panas melalui peningkatan
11
vibrasi (getaran) atom dan struktur molekul. Ini merupakan awal dari perubahan kimiawi yang kemudian dapat mengakibatkan efek biologis yang merugikan.
Efek radiasi terhadap sel meliputi: efek langsung dan efek tidak langsung.
Efek langsung adalah terjadinya pemutusan ikatan senyawa-senyawa penyusun sel. Efek tidak langsung terjadi karena materi sel terbanyak adalah air, yang apabila terkena sinar gamma akan mengalami hidrolisis dan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas inilah yang akan mempengaruhi sistem metabolisme atau penyebab kerusakan materi sel (Alatas dkk., 2005).
Satuan dasar dari jaringan biologis adalah sel. Sel mempunyai inti sel yang merupakan pusat pengontrol sel. Sel terdiri dari 80% air dan 20% senyawa biologis kompleks. Jika radiasi pengion menembus jaringan, maka dapat mengakibatkan terjadinya ionisasi dan menghasilkan radikal bebas, misalnya radikal bebas hidroksil (OH), yang terdiri dari atom oksigen dan atom hidrogen.
Secara kimia, radikal bebas sangat reaktif dan dapat mengubah molekul-molekul penting dalam sel. Salah satu molekul yang terdapat di inti sel, berperan untuk mengontrol struktur dan fungsi sel adalah deoxyribonucleic acid (DNA). Ada dua cara radiasi dapat mengakibatkan kerusakan pada sel. Pertama, radiasi dapat mengionisasi langsung molekul DNA sehingga terjadi perubahan kimiawi pada DNA. Kedua, perubahan kimiawi pada DNA terjadi secara tidak langsung, yaitu jika DNA berinteraksi dengan radikal bebas hidroksil. Terjadinya perubahan kimiawi pada DNA tersebut, baik secara langsung maupun tidak langsung, dapat menyebabkan mutasi.
Iradiasi dengan sinar gamma dapat menyebabkan beberapa mutasi untuk gen sel melalui mekanisme perbaikan DNA dalam sel (Thacker, 1986). Penelitian Chang dkk. (2003) menyatakan bahwa Pleurotus ostreatus diinduksi oleh radiasi sinar gamma mengalami mutasi pada gen MNP Mangan (II) peroksidase. Abo- State dkk. (2011) menambahkan bahwa Pleurotus sajor-cajuI yang diinduksi sinar gamma dosis 0,75 dan 1 KGy mampu memproduksi enzim MnP 0, 165 u/ml atau 4 kali lebih tinggi dibandingkan kontrol. Namun demikian peningkatan dosis radiasi gamma akan menurunkan pertumbuhan miselium P. sajor-caju. Hal ini dapat dijelaskan bahwa iradiasi gamma juga menyebabkan berbagai kerusakan DNA dalam sel apabila dosisnya meningkat.
2.4 Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa
Enzim lignoselulolitik terdiri dari sekumpulan enzim yang terbagi dalam dua kategori yaitu hidrolitik dan oksidatif. Enzim hidrolitik mendegradasi selulosa dan hemiselulosa dan setiap enzim bekerja terhadap substrat yang spesifik. Enzim oksidatif merupakan enzim non spesifik dan bekerja melalui mediator bukan protein yang berperan dalam degradasi lignin.
Enzim pendegradasi lignin termasuk ke dalam enzim oksidatif karena akan mengoksidasi substrat, dalam hal ini lignin, menjadi senyawa yang lebih sederhana. Enzim ini terdiri dari dua kelompok utama yaitu lakase dan peroksidase (Perez dkk., 2002). Enzim peroksidase terdiri dari lignin peroksidase (LiP) dan mangan peroksidase (MnP) (Chahal dan Chahal, 1998). Ketiga enzim tersebut bertanggung jawab terhadap pemecahan awal polimer lignin (Akhtar dkk., 1997).
13
Lignin peroksidase (LiP) merupakan enzim ligninolitik pertama yang berhasil ditemukan (Hammel, 1997) yang diisolasi dari beberapa jamur pelapuk putih (Perez, dkk. 2002) dari kelas Basidiomycetes (Piontek dkk., 2001) seperti P.
chrysosphorium (Tien dan Kirk, 1983). LiP memiliki berat molekul antara 38
sampai 47 kDa. LiP mengoksidasi inti aromatik (fenolik dan non fenolik) melalui pelepasan satu elektron menghasilkan radikal kation dan fenoksi (Akhtar dkk., 1997). LiP adalah enzim peroksidase ekstraseluler yang mengandung heme yang aktivitasnya bergantung pada H2O2, mempunyai potensial redoks yang luar biasa besar dan pH optimum yang rendah (Gold dan Alic, 1993).
Gambar 4. Skema Sistem Degrdasi Lignin oleh Phanerochaete chrysosporium (Sumber: Akhtar dkk., 1977)
Mangan peroksidase (MnP) hanya dihasilkan pada sejumlah jamur basidiomycetes (Steffen, 2003) ditemukan tidak lama setelah ditemukan LiP dari
P. chrysosphorium oleh Kuwahara dkk., (1984). MnP memiliki berat molekul
antara 43 sampai 50 kDa. MnP merupakan heme peroksidase ekstraseluler yang membutuhkan Mn2+ menjadi Mn3+ yang kemudian mengoksidasi struktur fenolik menjadi radikal fenoksil. Mn3+ yang terbentuk sangat reaktif dan membentuk kompleks dengan chelating asam organik seperti asam oksalat atau malat (Cui dan Dolphin, 1999). Dengan bantuan chelator, ion Mn3+ distabilkan dan dapat menembus ke dalam jaringan substrat (Steffen, 2003).
Gambar 5. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim selulase (Sumber: Tomas dkk., 2010)
Degradasi selulosa oleh fungi merupakan hasil kerja sekelompok enzim selulolitik (Howard dkk., 2003) yang bekerja secara sinergis. Sistem enzim selulolitik terdiri dari tiga kelompok utama yaitu endoglukanases atau 1,4-β- D- glucan-4-glukanohydrolases, exoglukanases (1,4-β-D-glukan glukanohydrolases dan 1,4-β-D-glukan cellobiohydrolases), dan β-glukosidases atau β-glukoside
15
glukohydrolases (Perez dkk., 2002). Kapang P. chrysosporium menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas menyerupai endoglukonases (EGs).
Enzim endoglukanases menghidrolisis bagian selulosa serat (Howard dkk., 2003) menghasilkan oligosakarida (Lynd dkk., 2002). Hidrolisis bagian berkristal selulosa hanya dapat dilakukan secara efiesien oleh enzim exoglucanases (Perez dkk., 2002). Hasil kerja sinergis endoglukanases menghasilkan molekul selobiosa.
Hidrolisis selulosa secara efektif memerlukan enzim (β-glucosidases yang memecah selobiosa menjadi 2 molekul glukosa (Perez dkk., 2002).
2.5 Elektroforesis SDS-PAGE
Menurut Yuwono (2005), elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Elektroforesis dapat digunakan untuk keperluan preparatif, selain bersifat analitik, bentuknya ada yang bersifat kolom dan ada pula yang lempengan.
Salah satu jenis elektroforesis adalah elektroforesis SDS-PAGE. Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) terutama
dilakukan untuk menetapkan berat molekul protein. SDS-PAGE adalah suatu teknik biologi molekular yang digunakan untuk memisahkan protein sesuai dengan ukuran berat molekul. Instrument elektroforesis SDS-PAGE dapat dilihat pada gambar 6.
Gambar 6. Alat Elektroforesis SDS-PAGE (Sumber: Dokumen Pribadi)
Mekanisme kerja SDS-PAGE adalah protein bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif.
Protein akan terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini terpisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya (Garfin, 2003). Elektroforesis gel SDS dilakukan pada pH mendekati netral. Adanya SDS menyebabkan protein rantai ganda akan terdisosiasi menjadi rantai-rantai individual yang terdenaturasi oleh detergent ini. Peristiwa ini dibantu oleh adanya merkaptoetanol yang memecah ikatan-ikatan disulfida antar ataupun dalam rantai (mereduksi ikatan disulfida menjadi gugus-gugus sulfihidril) (Hames, 1998). Oleh karena itu protein dapat dipisahkan hanya berdasarkan ukurannya (BM), dimana kompleks SDS protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil (Garfin, 2003).
17 BAB III
METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian berlangsung dari Bulan April sampai dengan Agustus 2013.
Penelitian dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Iradiasi (PATIR) Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) Pasar Jum’at, Lebak Bulus, Jakarta Selatan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat utama yang digunakan adalah Iradiator Gamma Chamber-4000 A dari Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Iradiasi (PATIR) Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) Jakarta, seperangkat alat elektroforesis SDS PAGE Atto®, inkubator Heraeus®, Autoklaf Wish Clave®, Oven Fisher®, pH meter Hanna Instrumen®, shacking incubator Precisssion®, mikroskop Novel®, spektrofotometer Uv-Vis Hitachi®, dan saringan berukuran 100 mesh.
Bahan–bahan yang digunakan adalah serbuk jerami padi dengan ukuran 100 mesh, diambil dari sawah tadah hujan setelah panen (± umur 3 bulan) berasal dari Kabupaten Kebumen, Saboraud Dextrose Agar (SDA) Pronadisa®, larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA), marker protein Broad Range Biorad®, larutan elektroforesis SDS PAGE (Lampiran 3), larutan Lowry I dan II (Lampiran 4), Reagen Nelson (lampiran 5) dan isolat kapang P. chrysosporium yang diperoleh dari hasil isolasi batubara yang berasal dari Sumatra Selatan.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat–alat gelas yang digunakan terlebih dahulu dibersihkan, lalu disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC tekanan 1 atm selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% (Waluyo, 2008).
3.3.2 Persiapan Serbuk Jerami Padi
Jerami padi dihancurkan dengan mesin penggiling, kemudian disaring dengan saringan 100 mesh. Sampel jerami padi ditempatkan ke dalam kulkas 4ºC sampai digunakan untuk penelitian selanjutnya.
3.3.3 Pembuatan Media Saboraud Dextrose Agar (SDA)
Ditimbang media SDA sebanyak 39 gr dilarutkan dengan akuades 500 ml pada Erlenmeyer. Media SDA disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Setelah selesai disterilisasi, kemudian segera dituang ke dalam cawan petri steril.
3.3.4 Peremajaan Isolat P. chrysosporium
Sebanyak 5 ml medium SDA dimasukkan ke dalam tabung reaksi (untuk agar miring). Kultur stok atau isolat kapang diinokulasikan pada medium SDA tersebut menggunakan ose. Kultur kapang tersebut diinkubasi selama 5-7 hari pada suhu ruang sampai kapang menghasilkan spora.
19
3.3.5 Proses Iradiasi Sinar Gamma
Kultur P. chrysosporium yang telah diremajakan, kemudian ditumbuhkan dalam cawan petri dengan media SDA selama 4 hari. Kultur miselium yang tumbuh kemudian dimasukkan ke dalam 4 tabung gelas vial ukuran 5 ml, dan ditambahkan 5 ml akuades. Masing-masing sampel kultur miselium dalam tabung gelas diiradiasi pada Irradiator Gamma Chamber (Co-60) dengan dosis 0 Gy (kontrol), 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy.
3.3.6 Produksi spora P. chrysosporium Pasca Iradiasi
Isolat kapang P. chrysosporium yang telah diiradiasi, kemudian ditumbuhkan pada cawan petri menggunakan media SDA dan diinkubasi selama 4-7 hari pada suhu ruang hingga menghasilkan spora. Sebanyak 10 ml NaCl 0,85% steril dimasukkan ke dalam cawan petri berisi isolat kapang, kemudian spora kapang dilepaskan menggunakan ose hingga tampak larut di dalam larutan.
Selanjutnya dimasukkan ke dalam erlenmeyer 10 ml dan dihitung jumlah sel vegetatif dan spora dari kapang P. chrysosporium dengan Neubauer.
3.3.7 Pembuatan Media Serbuk Jerami
Ditimbang 2 gr serbuk jerami padi dalam 1 liter akuades. Dimasukkan serbuk jerami ke dalam Erlenmeyer 100 ml, ditambahkan dekstrose 0,1 % selanjutnya ditutup dengan alumunium foil dan disterilisasi dengan autoklaf 121oC selama 15 menit.
3.3.8 Produksi Crude Extract Enzim Ekstraseluler Kapang P.
chrysosporium
Isolat kapang P. chrysosporium yang diremajakan di cawan petri, diinkubasi pada suhu ruang sampai menghasilkan spora. Sebanyak 5 ml akuades steril dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi inokulum spora kapang P.
chrysosporium, lalu spora dilepas dengan bantuan ose. Sebanyak 1 ml inokulum
spora kapang P. chrysosporium dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer yang berisi 30 ml media jerami padi dan diinkubasi pada suhu ruang, dan agitasi 150 rpm. Pencuplikan sampel dilakukan pada hari ke-0, 1, 3, 6, 9, dan 13. Parameter yang diukur adalah pH pada substrat dan kolonisasi. Kultur disentrifugasi 3000 rpm untuk memisahkan supernatan dengan miselia dan substrat, dimana supernatan berada di sebelah atas dan substrat yang mengendap di bawah.
Selanjutnya supernatan akan dianalisis kadar protein dan profil protein masing- masing dengan metode Lowry dan elektroforesis SDS-PAGE.
3.3.9 Pengukuran pH
Supernatan dari masing-masing perlakuan diukur nilai pH-nya menggunakan pH meter. Pengukuran dilakukan setiap pencuplikan pada hari ke-0, 1, 3, 6, 9 dan 13.
3.3.10 Analisis Kadar Protein Ekstraseluler Metode Lowry
Sampel supernatan sebanyak 0,5 ml ditambahkan 2,5 ml larutan Lowry 1 (lampiran 4) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 mL larutan Lowry II (lampiran 4), divorteks dan diinkubasi
21
pada suhu ruang selama 30 menit. Kemudian dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 750 nm dan dibandingkan dengan larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA).
3.3.11 Analisis Kadar Glukosa Metode Nelson Somogyi
Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan berdasarkan metode Nelson Somogyi (Sudarmaji dkk., 1984) yaitu 2 gr sampel yang telah dihidrolisis asam maupun hidrolisis enzimatik yang telah diberi perlakuan awal, disaring dengan kertas saring, lalu filtrat yang dihasilkan dilakukan pengujian kadar gula reduksi.
Sebanyak 1 ml filtrat yang telah diencerkan dicampur dengan 1 ml larutan reagen Nelson, dipanaskan selama 20 menit sampai mendidih, didinginkan, ditambahkan 1ml larutan arsen, dilakukan pengadukan dan ditambah dengan 7 ml air destilat.
Selanjutnya dilakukan pengukuran dengan Spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm untuk mendapatkan nilai absorbansi.
3.3.12 Karakterisasi Enzim Ekstraseluler dengan Elektroforesis SDS-PAGE Karakterisasi enzim ekstraseluler dilakukan melalui elektroforesis dengan menggunakan SDS-PAGE. Menurut Laemli (1970) tahapan kerja elektroforesis yang dilakukan antara lain:
1. Preparasi sampel
Sebanyak 30 µl supernatan ditambahkan 50 µl buffer sampel lalu dipanaskan pada suhu 95 °C selama 10 menit. Kemudian sampel disentrifugasi 6000 rpm selama 10 menit.
2. Preparasi gel elektroforesis a. Resolving gel (10%)
Sebanyak 3,3 ml Acrylamid 30 % dicampurkan dengan resolving gel buffer (1,5 Tris-HCl, pH 8,8) sebanyak 2,5 ml, kemudian akuabides 4,1 ml, SDS
20 % sebanyak 0,05 ml, amonium persulfate (APS) 10 % sebanyak 0,05 ml dan TEMED 0,005 ml.
b. Stacking gel (4%)
Sebanyak 0,67 ml Acrylamid 30 % dicampurkan dengan separating gel buffer (0,5 Tris-HCl, pH 6,8) sebanyak 1,25 ml kemudian akuabides 3,075 ml,
SDS 0,025 ml, amonium persulfate (APS) 0,025 ml dan TEMED 0,005 ml.
3. Proses Elektroforesis
Setelah resolving gel dibuat, kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan akuades untuk meratakan resolving gel tersebut. Setelah resolving gel membeku, akuades dibuang dan dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu dipasang sisir pembentuk kolom dan dibiarkan hingga stacking gel membeku kemudian sisir diangkat.
Sebanyak 600 ml larutan running buffer dimasukkan dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel dan marker protein masing-masing sebanyak 10 µl dan 5 µl dimasukkan ke dalam kolom gel yang sudah terbentuk lalu dielektroforesis dengan kecepatan 200 Volt dan kuat arus 40 mA selama ± 45 menit atau hingga warna biru (Bromtimol Blue) sebagai penanda pada sampel mencapai batas bawah gel.
23
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining R- 250 kurang lebih selama 1 jam. Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250 kurang lebih selama 24 jam. Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan Lab Image 1 D untuk diketahui berat molekulnya.
3.3.13 Analisis Degradasi Hemiselulosa, Lignin, dan Selulosa (Metode Chesson)
a. Kadar Hemiselulosa
Pengukuran kadar hemiselulosa dianalisis dengan metode Chesson (Datta, 1981) yaitu sebanyak 1-2 gr sampel dicampur dengan 150 ml air destilat, dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 2 jam, difiltrasi dengan kertas saring dan terakhir dibilas dengan air destilat, bagian padat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC sampai konstan dan ditimbang beratnya (a). Selanjutnya sampel dicampur dengan 150 ml larutan H2SO4 1 N, dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 1 jam, difiltrasi dengan kertas saring dan terakhir dibilas dengan air destilat.
Kemudian bagian padat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC sampai konstan dan ditimbang beratnya (b).
b. Kadar Selulosa
Pengukuran kadar selulosa dianalisis dengan metode Chesson (Datta, 1981) yaitu sampel yang telah dikeringkan pada analisis hemiselulosa (b) dicampur dengan larutan H2SO4 72 % sebanyak 10 ml, dilakukan perendaman selama 4 jam, lalu dicampur dengan 150 ml larutan H2SO4 1 N, dipanaskan pada suhu 100 ºC selama 2 jam, difiltrasi dengan kertas saring dan terakhir dibilas
dengan air destilat. Kemudian bagian padat dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC sampai konstan dan ditimbang beratnya (c).
Kadar hemiselulosa = X 100 %
c. Kadar Lignin
Pengukuran kadar lignin dianalisis dengan metode Chesson (Datta, 1981), yaitu sampel yang telah dikeringkan pada analisis selulosa (c), selanjutnya dipanaskan pada suhu 600 ºC selama 4-6 jam lalu ditimbang beratnya (d).
Kadar lignin = X 100 %
3.3.14 Analisis Data
Data yang telah didapat dari pengukuran pH medium, kadar protein dan kolonisasi dianalisis secara deskriptif dengan Ms. Excel 2007. Analisis hasil elektroforesis dengan Lab Image 1 D untuk menentukan nilai RF (Retensi Faktor) sebagai representasi dari profil protein yang dihasilkan dan berat molekulnya.
25 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Pertumbuhan Kapang Phanerochaete chrysosporium pada Permukaan Media Saboraud Dextrose Agar (SDA)
Pertumbuhan kapang P. chrysosporium hasil iradiasi gamma pada media SDA menunjukkan hasil yang berbeda (Gambar 7). Pertumbuhan kapang hasil iradiasi lebih baik dibandingkan kontrol. Pertumbuhan kapang terbaik terjadi pada dosis 40 Gy, kemudian diikuti oleh dosis 20 Gy, 10 Gy, dan 0 Gy (kontrol). Persentase pertumbuhan miselia kapang dosis 0 Gy, 10 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy masing-masing sebesar 10,5 %, 24,5 %, 48,9 %, dan 70 %. Hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan kapang sebanding dengan meningkatnya dosis iradiasi.
Gambar 7. Pertumbuhan miselia kapang Phanerochaete chrysosporium pasca iradiasi dalam media SDA setelah inkubasi hari ke-7 pada suhu ruang.
Perlakuan dosis 40 Gy menunjukkan miselia kapang P. chrysosporium mampu tumbuh dengan baik, dengan persentase pertumbuhan miselia sebesar 70 %.
Hal ini didukung pengamatan makroskopis (lampiran 8) pertumbuhan miselia kapang hampir menutupi seluruh permukaan media SDA. Menurut Alexopoulus dkk. (1996) kapang P. chrysosporium memiliki tipe pertumbuhan ekstensif selama substrat masih tersedia. Sel-sel hifa pada bagian ujung miselium merupakan sel-sel yang memiliki tingkat metabolisme tinggi. Sel-sel tersebut mensekresikan enzim dan polimer untuk pertumbuhan ujung-ujung hifa. Pertumbuhan kapang P. chrysosporium pada media SDA diduga dipengaruhi oleh efek iradiasi yang terjadi pada sel kapang yang dapat menyebabkan mutasi. Crowder (1986) melaporkan bahwa iradiasi sinar gamma menembus bagian tertentu dari gen dapat menyebabkan perubahan susunan basa nitrogen pada DNA. Frekuensi mutasi berbanding lurus dengan dosis radiasi sinar gamma. Perubahan untaian DNA akan menyebabkan fenotip pada kapang berubah.
4.2. Pertumbuhan Kapang Phanerochaete chrysosporium pada Media Jerami Padi
4.2.1. Kolonisasi Kapang Phanerochaete chrysosporium pada Media Jerami Padi Kapang P. chrysosporium hasil perlakuan iradiasi gamma dapat tumbuh pada substrat jerami padi (Gambar 8). Hal ini ditandai dengan adanya kolonisasi berupa terselimutinya substrat jerami padi oleh miselia kapang P. chrysosporium. Hasil pengamatan memperlihatkan kolonisasi miselia kapang P. chrysosporium dalam substrat jerami padi berbeda pada setiap dosis perlakuan.
27
Spora-spora kapang P. chrysosporium terlihat bergerminasi setelah hari ke-1 inkubasi. Hal ini ditandai dengan memanjangnya sel spora. Germinasi ini terjadi karena sel spora memanfaatkan nutrien sederhana yang ditambahkan ke dalam media berupa dekstrosa. Pemberian medium dekstrosa pada media merupakan sumber karbon yang dapat membantu dalam proses degradasi jerami padi guna memberikan energi awal untuk kapang agar dapat menggunakan substrat jerami padi pada proses selanjutnya. Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Liu dan Orskov (2000), didapatkan hasil bahwa pertumbuhan kapang dapat dipacu dengan pemberian medium yang mengandung gula sehingga jerami padi dapat terdegradasi.
Waktu (Hari ke-)
0 Gy 10 Gy 20 Gy 40 Gy
0
1
3
6
9
13
Gambar 8. Kolonisasi P. chrysosporium dalam media jerami padi yang diinkubasi pada suhu ruang dengan dosis iradiasi yang berbeda (perbesaran 40x) (keterangan: tanda panah merah menunjukkan susbstrat jerami padi, panah biru menunjukkan spora kapang, dan panah hijau menunjukkan miselia kapang).
Proses kolonisasi sudah mulai tampak pada hari ke-3 inkubasi. Inokulum sudah tampak jelas berikatan dengan substrat jerami padi dan membentuk jalinan miselia pada hari ke-6 hingga ke-13 inkubasi. Perbedaan jalinan miselia tampak terlihat jelas pada perlakuan dosis 20 Gy dan 40 Gy. Jalinan miselia pada dosis perlakuan 20 Gy tampak terlihat sangat rapat menyelimuti substrat jerami padi pada hari ke-6 inkubasi. Jalinan miselia pada dosis 40 Gy belum terlihat jelas dan
29
cenderung menurun pertumbuhannya pada hari ke-6 inkubasi. Hal ini berbeda pada saat ditumbuhkan dalam media SDA (Gambar 7). Hal ini diduga terjadi karena perbedaan substrat dan adanya efek radiasi yang mempengaruhi pertumbuhan kapang P. chrysosporium.
Media merupakan sumber nutrisi yang akan digunakan oleh suatu isolat kapang untuk tumbuh dan berkembang. Kandungan nutrisi media menentukan tersedia tidaknya suatu unsur yang dibutuhkan oleh kapang. Isolat kapang P.
chrysosporium dapat tumbuh pada substrat jerami padi karena di dalamnya
terkandung nutrisi yang dibutuhkan kapang untuk kelangsungan kehidupannya.
Menurut Herliyana (1997), pertumbuhan koloni isolat jamur P. chrysosporium pada susbtrat dipengaruhi oleh kondisi media kandungan nutrisi, kadar air dan tingkat keasaman.
Efek radiasi pada sel yang dapat terjadi adalah perubahan sifat selamanya atau hanya pada beberapa generasi, bahkan dapat menimbulkan kematian (Sugoro dan Tetriana, 2008). Radiasi sinar gamma yang menembus DNA target kapang mengakibatkan efek radiasi yaitu mutasi. Gen dapat dianggap sebagai suatu target atau sasaran di dalam proses mutasi. Menurut Claire (2002) secara alamiah sel mempunyai kemampuan untuk melakukan proses perbaikan terhadap kerusakan yang timbul dengan menggunakan beberapa jenis enzim spesifik. Proses perbaikan dapat berlangsung tanpa terjadi kesalahan sehingga struktur DNA kembali seperti semula (normal).
Kolonisasi yang terbentuk pada setiap dosis perlakuan membuktikan bahwa kapang P. chrysosporium dapat menggunakan substrat jerami padi. Penggunaan substrat tersebut untuk proses metabolismenya sehingga kapang P. chrysosporium mampu mendegradasi jerami padi dengan bantuan enzim hingga dihasilkan senyawa yang lebih sederhana. Enzim-enzim yang dihasilkan oleh kapang P. chrysopsorium terikat di permukaan hifa sehingga terjadi kontak dengan lignin yang ada pada jerami padi (Cathcheside dan Ralph, 1994).
Miselium yang menyelimuti substrat jerami padi semakin renggang di hari ke- 9 bahkan di hari ke-13 inkubasi hanya kotak spora saja yang tampak. Hal ini karena berkurangnya sumber nutrisi sehingga terdapat sel yang mati. Munculnya spora pada hari ke-9 dan ke-13 inkubasi karena berkurangnya sumber nutrisi pada medium sehingga kapang P. chrysosporium menghasilkan struktur tubuh yang mampu bertahan pada kondisi ekstrim seperti kurangnya nutrisi pada lingkungan tempat hidupnya.
4.2.2. pH media
Perubahan pH pada proses degradasi jerami padi merupakan salah satu faktor yang menunjukkan aktifitas dari P. chrysosporium. Pola perubahan pH medium kapang P. chrysosporium untuk semua dosis perlakuan cenderung meningkat hingga akhir masa inkubasi (Gambar 9). Pola perubahan pH tersebut hampir sama pada masing-masing dosis radiasi selama proses agitasi. pH awal dari semua dosis perlakuan berkisar 5,5 hingga 5,8. Selama masa inkubasi, pH semua dosis perlakuan
31
mengalami penurunan pada hari ke-1 inkubasi dan meningkat pada hari ke-3 hingga akhir masa inkubasi.
Gambar 9. Nilai pH medium kapang P. chrysosporium dalam substrat jerami padi, inkubasi pada suhu ruang dengan agitasi 150 rpm.
Perlakuan dosis 0 Gy memiliki pH 5,78 ± 0,01 pada hari ke-0 inkubasi.
Kemudian pH menurun menjadi 5,60 ± 0,04 pada hari ke-1 inkubasi. pH mengalami peningkatan menjadi 7,67 ± 0,02 hingga akhir masa inkubasi. Perlakuan dosis 10 Gy dan 20 Gy memiliki pH 5,65 ± 0,08 pada hari ke-0 inkubasi. pH mengalami peningkatan masing-masing menjadi 7,69 ± 0,05 dan 7,89 ± 0,05 hingga akhir masa inkubasi. Perlakuan dosis 40 Gy memiliki pH 5,71 ± 0,03 pada hari ke-0 inkubasi. pH mengalami penurunan menjadi 5,25 ± 0,03 pada hari ke-1 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 7,79 ± 0,03 hingga akhir masa inkubasi.
Penurunan pH medium pada hari ke-1 inkubasi diduga terjadi karena pertumbuhan kapang P. chrysosporium pada medium menghasilkan metabolit yang
bersifat asam. Mayoritas kapang mampu tumbuh pada kondisi lingkungan asam atau pH yang rendah. pH optimum untuk pertumbuhan fungi pada umumnya 3,8 sampai 5,6 (Madigan dkk., 2009).
Peningkatan pH terjadi pada hari ke-3 inkubasi hingga akhir masa inkubasi.
Peningkatan pH ini disebabkan oleh meningkatnya senyawa ammonium di dalam medium karena terdapat sejumlah sel kapang yang mengalami lisis. Senyawa ammonium yang dihasilkan dari sel yang lisis tersebut merupakan senyawa alkali yang dapat meningkatkan nilai pH (Shi dkk., 2009). Menurut penelitian Mustikasari (2009), nilai pH cenderung mengalami kenaikan seiring dengan bertambahnya masa inkubasi. Peningkatan pH medium diduga karena kapang P. chrysosporium lebih banyak mendegrdasi senyawa yang mengandung Nitrogen seperti protein sehingga dihasilkan senyawa yang bersifat basa seperti ammonia.
Perubahan nilai pH pada setiap perlakuan menunjukkan bahwa kapang mengalami proses pertumbuhan selama masa inkubasi dan membentuk kolonisasi.
Hal ini didukung oleh data sebelumnya mengenai pertumbuhan dan kolonisasi kapang P. chrysosporium pada media jerami (Gambar 8). Secara umum perubahan nilai pH masih dalam kisaran untuk pertumbuhan kapang P. chrysosporium. Kapang P. chrysosporium dapat tumbuh sehingga mampu berkolonisasi dengan substrat jerami padi. Telah diketahui bahwa kapang dapat tumbuh pada pH berkisar antara 2 – 8,5 (Gandjar dkk., 2006).
33
4.2.3. Degradasi Lignin, Selulosa, dan Hemiselulosa
Hasil analisis degradasi substrat jerami padi menunjukkan bahwa pada setiap dosis perlakuan kapang P. chrysosporium memiliki kemampuan yang berbeda dalam mendegradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa (Gambar 10). Proses degradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa terjadi akibat adanya aktivitas kapang P.
chrysosporium yang mengalami pertumbuhan. Hal ini didukung oleh hasil
pengamatan kolonisasi kapang (Gambar 8). Perlakuan dosis 0 Gy mampu mendegradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa masing-masing 2,8 %, 9,8 %, dan 12,2 %. Perlakuan dosis 10 Gy mampu mendegradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa masing-masing 16,6 %, 2,9 %, dan 14,2 %. Perlakuan dosis 20 Gy mampu mendegradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa masing-masing masing- masing 16,1 %, 0,1 %, dan 11,4 %. Perlakuan dosis 40 Gy mampu mendegradasi lignin, selulosa, dan hemiselulosa masing-masing 4,4 %, 14,8 %, dan 4 %.
Gambar 10. Hasil analisis degradasi hemiselulosa, lignin, dan selulosa oleh kapang P. chrysosporium dalam substrat jerami padi pada hari ke- 13 yang diinkubasi pada suhu ruang dan agitasi 150 rpm.
Perlakuan dosis 10 Gy terbukti memiliki tingkat degradasi lignin tertinggi yaitu sebesar 16,2 % pada hari ke-13 inkubasi. Menurut Akhtar dkk., (1997) P.
chrysosporium mampu menghasilkan enzim pendegradasi lignin yaitu lignin
peroksidase dan mangan peroksidase. Kedua enzim tersebut bertanggung jawab terhadap pemecahan awal polimer lignin.
Lignin merupakan suatu makromolekul 3-dimensi, heteropolimer, tidak larut dalam air, mengandung unit fenilpropan (Perez dkk., 2002). Prekursor utama lignin adalah tiga senyawa alkohol aromatik yaitu p-coumaryl, coniferyl dan sinapyl alkohol (Hendriks dan Zeeman, 2009). Enzim LiP mampu mengoksidasi unit non fenolik lignin. Unit non fenolik merupakan penyusun sekitar 90 % struktur lignin. Oksidasi substruktur lignin oleh LiP dimulai dengan pemisahan satu elektron cincin aromatik substrat donor dan menghasilkan radikal aril. LiP memotong ikatan Cα-Cβ molekul lignin (Hammel, 1997).
Selain itu perlakuan dosis 10 Gy terbukti memiliki tingkat degradasi hemiselulosa tertinggi dibandingkan dosis lainnya yaitu sebesar 14 % pada hari ke-13 inkubasi. Hemiselulosa mengalami biodegradasi menjadi monomer gula dengan bantuan enzim hemiselulase. Hemiselulase seperti kebanyakan enzim lainnya dapat menghidrolisis dinding sel tanaman (Howard dkk., 2003). Xilan merupakan karbohidrat utama penyusun hemiselulosa (Perez dkk., 2002) dan xilanase merupakan hemiselulase utama yang menghidrolisis ikatan β-1,4 rantai xilan. P. chrysosporium menghasilkan endoxylanase yang berperan dalam pemecahan xilan menjadi oligosakarida (Perez dkk., 2002).
35
Perlakuan dosis 40 Gy terbukti memiliki tingkat degradasi selulosa tertinggi dibandingkan dosis lainnya yaitu sebesar 14,7 % pada hari ke-13 inkubasi.
Mekanisme hidrolisis selulosa disajikan pada gambar 4. Endoglukanase memotong rantai amorf pada gugus selulosa, eksoglukanase memutus gugus reduksi ataupun non reduksi rantai selulosa dan menghasilkan glukosa sebagai produk utama.
Eksoglukanase juga diasumsikan dapat merombak struktur selulosa sedangkan β- glukosidase dapat memecahkan selodekstrin β dan selobiosa menjadi glukosa (Lynd dkk., 2002).
4.2.4. Kadar Glukosa Media
Hasil analisis kadar glukosa menunjukkan bahwa terjadi penurunan dan peningkatan kadar glukosa pada setiap dosis perlakuan selama masa inkubasi (Gambar 11). Gula pereduksi merupakan indikator aktivitas enzim dalam menghidrolisis lignoselulosa pada substrat jerami padi. Lignoselulosa merupakan komponen utama dari jaringan tanaman yang terdiri dari selulosa, hemiselulosa, dan lignin dengan struktur berupa mikrofibril polisakarida.
Perlakuan dosis kontrol memiliki kadar glukosa 1,11 ± 0,03 mg/ml pada hari ke-0 inkubasi. Kadar glukosa menurun menjadi 0,22 ± 0,05 mg/ml hingga hari ke-6 inkubasi. Kadar glukosa kembali meningkat menjadi 1,92 ± 0,06 mg/ml pada hari ke- 9 inkubasi. Namun pada akhir masa inkubasi hari ke-13 kembali menurun menjadi 0,71 ± 0,07 mg/ml. Perlakuan dosis 10 Gy dan 20 Gy memiliki kadar glukosa sama sebesar 1,07 ± 0,04 mg/ml pada hari ke-0 inkubasi. Kadar glukosa perlakuan dosis 10
Gy meningkat menjadi 1,16 ± 0,01 mg/ml, namun untuk dosis 20 Gy sudah mulai menurun menjadi 1,05 ± 0,01 mg/ml pada hari ke-3 inkubasi. Selanjutnya kedua dosis perlakuan tersebut menurun menjadi 1,07 ± 0,04 dan 0,51 ± 0,03 mg/ml hingga hari ke-6 inkubasi. Kadar glukosa kembali meningkat menjadi 1,56 ± 0 dan 1,18 ± 0,01 mg/ml di akhir masa inkubasi. Perlakuan dosis 40 Gy memiliki kadar glukosa terendah yaitu sebesar 0,24 ± 0,03 mg/ml pada hari ke-0 inkubasi. Kadar glukosa cenderung sama berkisar antara 0,7-0,8 ± 0,03 mg/ml hingga akhir masa inkubasi.
Gambar 11. Kadar glukosa medium kapang P. chrysosporium dalam substrat jerami padi pada inkubasi suhu ruang dan agitasi 150 rpm.
Peningkatan kadar glukosa dalam medium disebabkan oleh adanya pemecahan selulosa yang terkandung dalam substrat jerami padi menjadi glukosa dengan bantuan enzim selulase. Kadar glukosa akan meningkat ketika laju pemecahan selulosa lebih cepat dibandingkan dengan pemakaian glukosa. Selulosa tersusun atas polimer glukosa dengan ikatan glikosidik β-1,4 dalam rantai lurus
37
dengan bangun dasar suatu selobiosa yaitu dimer dari glukosa (Kogel-Knabner, 2002). Menurut Beguin dan Aubert (1992) enzim selulase terdiri dari tiga jenis enzim yang memiliki fungsi sinergis yaitu endoglukanase, eksoglukanase (cellodekstrinase) dan β-glukosidase (β-glukosideglukohidrolase) yang dapat mengubah selulosa menjadi glukosa.
Proses hidrolisis selulosa melalui tiga tahap yaitu pemecahan selulosa (polisakarida) menjadi oligosakarida, kemudian oligosakarida akan dihidrolisis oleh enzim menjadi disakarida lalu disakarida akan dihidrolisis menjadi monosakarida yaitu glukosa (Anomalibio, 2011). Penurunan kadar glukosa dalam medium disebabkan penggunaan gula sederhana (glukosa) yang terkandung dalam substrat jerami padi untuk metabolisme kapang sebagai sumber karbon dan energi. Kadar glukosa yang menurun ini diakibatkan pula oleh lambatnya laju pemecahan selulosa, sehingga glukosa yang dipakai untuk proses metabolisme kapang semakin menurun.
4.2.5. Kadar Protein Media
Analisis uji protein ekstraseluler bertujuan untuk mengetahui seberapa besar enzim ekstraseluler yang diekskresikan oleh kapang P. chrysosporium. Kadar protein ekstraseluler menunjukkan adanya perubahan kadar protein pada setiap perlakuan dosis radiasi (Gambar 12). Berdasarkan hasil regresi, secara umum semua perlakuan mengalami penurunan kadar protein yang ditandai dengan nilai slop yang negatif.
Penurunan tertinggi terjadi pada perlakuan dosis 20 Gy, diikuti oleh dosis perlakuan 10 Gy, 40 gy, dan 0 Gy.
Gambar 12. Kadar protein ekstraseluler kapang P. chrysosporium yang ditumbuhkan dalam medium jerami padi yang diinkubasi pada suhu ruang dan agitasi 150 rpm.
Kadar protein ekstraseluler semua dosis perlakuan berfluktuatif selama masa inkubasi. Hal ini dapat terjadi karena kapang mengalami mutasi akibat iradiasi gamma sehingga DNA mengalami perubahan. Menurut Claire (2002) perubahan nukleotida tunggal di dalam rantai cetakan DNA mengakibatkan produksi protein yang abnormal. Gen menentukan fenotip melalui enzim yang mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik di dalam sel. Selain itu, substrat pada jerami padi yang bersifat heterogen kemungkinan akan menyebabkan protein atau enzim yang dihasilkan berbeda-beda.
Perlakuan dosis 0 Gy memiliki kadar protein ekstraseluler sebesar 2,09 ± 0,01 mg/ml pada hari ke-0 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler menurun menjadi 1,78 ± 0,04 mg/ml pada hari ke-1 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 1,80 ± 0,01 mg/ml
39
pada hari ke -3 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler kembali menurun menjadi 1,30
± 0,01 mg/ml, kemudian meningkat menjadi 1,62 ± 0,01 mg/ml hingga akhir masa inkubasi hari ke-13.
Perlakuan dosis 10 Gy memiliki kadar protein ekstraseluler 2,05 ± 0,05 mg/ml pada hari ke-0 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler menurun menjadi 1,98 ± 0,04 mg/ml pada hari ke-1 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 2,18 ± 0,01 mg/ml pada hari ke -3 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler kembali menurun menjadi 1,24 ± 0,03 mg/ml, kemudian meningkat menjadi 1,56 ± 0,01 mg/ml hingga akhir masa inkubasi hari ke-13.
Perlakuan dosis 20 Gy memiliki kadar protein ekstraseluler 2,25 mg/ml pada hari ke-0 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler menurun menjadi 1,28 mg/ml hingga hari ke-3 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 1,91 mg/ml pada hari ke -6 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler kembali menurun menjadi 1,37 mg/ml pada hari ke-9 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 1,41 mg/ml hingga akhir masa inkubasi hari ke-13.
Perlakuan dosis 40 Gy memiliki kadar protein ekstraseluler 2,04 ± 0,04 mg/ml pada hari ke-0 dan ke-1 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler menurun menjadi 1,24
± 0,02 mg/ml hingga hari ke-3 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 1,57 ± 0,01 mg/ml pada hari ke -6 inkubasi. Kadar protein ekstraseluler kembali menurun menjadi 1,20 ± 0,01 mg/ml pada hari ke-9 inkubasi, kemudian meningkat menjadi 1,47 ± 0,03 mg/ml hingga akhir masa inkubasi hari ke-13.
Perlakuan dosis 10 Gy memiliki kadar protein ekstraseluler tertinggi pada hari ke-3 inkubasi dibandingkan dengan perlakuan dosis lainnya. Hal tersebut disebabkan sel-sel kapang lebih cepat dapat beradaptasi pada hari ke-3, sehingga mampu tumbuh dan menghasilkan enzim ekstraseluler dengan kadar yang tinggi. Data tersebut sesuai dengan gambar 8, dimana kolonisasi miselium kapang yang terbentuk pada hari ke-3 untuk dosis 10 Gy lebih rapat dibandingkan dengan perlakuan dosis lainnya.
Perlakuan dosis 20 Gy memiliki kadar protein ekstraseluler tertinggi pada hari ke-6 inkubasi dibandingkan dengan perlakuan dosis lainnya. Hal tersebut disebabkan setelah hari ke-6 inkubasi, kapang P. chrysosporium dosis 20 Gy mampu beradaptasi lebih lama dibandingkan dosis lainnya. Kapang P. chrysosporium memanfaatkan nutrien hasil degradasi jerami padi. Data tersebut sesuai dengan (Gambar 8) yang menunjukkan kolonisasi miselium kapang P. chrysosporium yang sangat rapat pada hari ke-6 dibandingkan dengan perlakuan dosis lainnya.
Kadar protein ekstraseluler yang meningkat di akhir masa inkubasi pada setiap perlakuan menandakan tingginya enzim ekstraseluler pada hari tersebut. Hal ini terjadi karena kapang P. chrysosporium telah mengalami adaptasi dengan baik pada medium yang mengalami penambahan jerami padi sehingga dapat mengalami pertumbuhan dengan baik pula. Sel-sel dari kapang P. chrysosporium yang semakin banyak menyebabkan enzim ekstraseluler yang dikeluarkan juga mengalami peningkatan. Namun pada nilai pH mengalami kenaikan di akhir masa inkubasi, salah satu penyebabnya adalah lisisnya sel dan terjadi efek buffering serta dihasilkannya senyawa ammonium. Peningkatan nilai absorbansi menunjukkan kadar protein
41
ekstraseluler yang meningkat karena kapang mensekresikan enzim ekstraseluler dan terjadi degradasi jerami padi oleh kapang.
4.2.6. Karakteristik Enzim Ekstraselular P. chrysosporium
Hasil elektroforesis SDS-PAGE memperlihatkan gambaran karakteristik enzim ekstraselular kapang P. chrysosporium berdasarkan berat molekulnya (BM).
Karakteristik enzim ekstraseluler P. chrysosporium menunjukkan hasil yang berbeda (Gambar 13). Perlakuan 0 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy terdeteksi memiliki jumlah pita sebanyak 3. Perlakuan dosis 10 Gy terdeteksi memiliki jumlah pita sebanyak 5 (Lampiran 13). Meskipun karakteristik enzim yang sama pada dosis 0 Gy, 20 Gy, dan 40 Gy, tetapi berbeda konsentrasinya. Hal ini dapat dilihat bahwa semakin besar dosis iradiasinya, intensitas warna pita yang terbentuk semakin gelap (Lampiran 13).
Perlakuan dosis 0 Gy, dan 20 Gy terdeteksi memiliki enzim lakase (BM= 110 kDa) dan dua enzim belum diketahui karakteristiknya (BM = 35 kDa dan 21,5 kDa).
Karakteristik enzim pada perlakuan dosis 10 Gy terdiri dari atas Lignin Peroksidase (BM=42 KDa), Mangan Peroksidase (BM= 48 kDa), lakase (BM= 110 kDa) dan dua enzim belum diketahui karakteristiknya masing-masing memiliki BM 35 kDa dan 21,5 kDa. Perlakuan dosis 40 Gy terdeteksi memiliki enzim lakase (BM= 110 kDa) dan enzim Lignin Peroksidase (BM= 40 kDa) serta satu enzim belum terdeteksi karakteristiknya (BM = 22 kDa). Menurut Fakuosa dan Hofrichter (1999), enzim Lignin peroksidase memiliki berat molekul (BM) antara 38-47 kDa, Mangan peroksidase (BM= 43-50 kDa), lakase (BM= 53-110 kDa). Terdeteksinya enzim LiP dan MnP didukung oleh aktivitas kapang dalam mendegradasi lignin (Gambar 10).
