DETEKSI CEPAT Carnation mottle virus
5 EKSPRESI GEN PROTEIN SELUBUNG Carnation mottle virus DALAM BAKTERI Escherichia col
Abstrak
Carnation mottle virus (Tombusviridae; Carmovirus) menyebabkan gejala belang dan ditemukan menjadi virus yang dominan menginfeksi tanaman anyelir di sentra produksi di Jawa Barat. Penelitian bertujuan mendapatkan antigen CarMV melalui ekspresi gen CP CarMV pada bakteri E. coli. Gen CP CarMV di klon ke dalam TA vektor pTZ57R/T. TA vektor, dirunut nukleotidanya dan disubkloning pada vektor ekspresi pET28a pada situs enzim restriksi BamHI dan
XhoI. Keberadaan gen CP CarMV dalam bakteri ekspresi dikonfirmasi dengan koloni PCR. Ekspresi gen CP dalam bakteri ekspresi E. coli strain BL21(DE3) diinduksi dengan penambahan isopropy-3-D-I-thiogalactoside (IPTG) pada konsentrasi akhir antara 0.25 – 1.0 mM. Gen CP CarMV berhasil dikloning ke dalam TA vektor pTZ57R/T dan disubkloning ke dalam vektor ekspresi pET28a. Ekspektasi gen CP CarMV dalam vektor ekspresi menghasilkan fusi protein berukuran ±40.2 kDa. Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan adanya pita protein fusi pada ukuran 40.2 kDa sebagai ekspresi dari gen CP CarMV rekombinan pada bakteri E.coli BL21(DE3) pada kondisi suhu inkubasi 25 oC, dan waktu panen 8 jam setelah induksi IPTG. Namun ekspresi gen belum optimal sehingga perlu dilakukan optimasi beberapa faktor yang mempengaruhiya. Kata kunci: Bakteri BL21(DE3), Carmovirus, kloning, plasmid pET28a, SDS-
Abstrack
Carnation mottle virus (Tombusviridae; Carmovirus) as the causal mottle symptom is found as dominant virus infecting carnation in production centers in West Java. The aims of the research was to obtain the antigene of CarMV through gene expression in E. coli. CarMV-CP gene was amplified and cloned into TA vector pTZ57R/T and then the DNA sequenced, and subcloned into expression vector pET28a at BamHI and XhoI restriction enzyme site. The existence of the CP gene of CarMV in bacterial expression was confirmed by colony PCR. CP expressed in the bacteria expression E. coli strain BL21(DE3) was induced by an addition of isopropy-3-D-I-thiogalactoside (IPTG) at a final concentration of 0.25 – 1.0 mM. CarMV CP gen was sucsesfully cloned into TA vector pTZ57R/T and subcloned into expression vector pET28a. The expectation of CarMV CP gen in expression vector will produce fusion protein with size ±40.2 kDa. SDS- PAGE analysis showed that fusion protein band with sized ±40.2 kDa expressed by E. coli at temperature 25 oC and 8 hour after IPTG induction. However the expression protein is not optimal yet. It is necessary to optimize some factors which are affect the expression level to obtain over expression protein as antigene.
Key words: Bacterial BL21(DE3), Carmovirus, cloning, pET28a plasmid, SDS- PAGE
Pendahuluan
Carnation mottle virus (Tombusviridae; Carmovirus) merupakan salah satu virus penting pada tanaman anyelir di dunia (Lomel et al. 1983; Sing et al. 2005; Raikhy et al. 2006; Safari et al. 2009; Alexandre et al. 2015). Berdasarkan hasil deteksi serologi pada beberapa kultivar tanaman anyelir yang ada di Jawa Barat menggunakan metode DAS/TAS/indirect-ELISA, CarMV merupakan satu- satunya virus yang menginfeksi tanaman anyelir di Jawa Barat. Virus ini menyebabkan gejala belang pada daun, dan pada beberapa kultivar anyelir menyebabkan terhambatnya pertumbuhan sehingga tanaman menjadi kerdil. Ruas-ruas tanaman menjadi tampak lebih pendek dibandingkan tanaman yang sehat. Infeksi virus juga menyebabkan tanaman tidak begejala, tanaman tampak sehat, tetapi setelah dilakukan diagnosis secara serologi, tanaman menunjukkan reaksi positif terhadap antiserum yang digunakan terutama terhadap antiserum CarMV.
CarMV sudah dilaporkan dan tersebar di beberapa negara produsen bunga potong anyelir termasuk India, Turki, Iran, Brazil, dan California (Lomel et al. 1983; Sing et al. 2005; Raikhy et al. 2006; Safari et al. 2009; Alexandre et al. 2015). Insidensi penyakit CarMV pada tanaman anyelir di negara-negara tersebut paling tinggi dibandingkan virus-virus anyelir lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa CarMV sangat mudah menular dan menyebar sehingga menyebabkan epidemi.
Epidemi penyakit virus pada tanaman anyelir belum dirasakan oleh petani- petani tanaman hias di Indonesia. Hal ini disebabkan kurangnya pengetahuan mereka terhadap penyakit ini. Padahal, lalu-lintas perdagangan stek tanaman anyelir dari satu tempat ke tempat lainnya telah menyebabkan terjadinya insidensi penyakit virus yang tinggi di Indonesia, khususnya Jawa Barat sebagai salah satu sentra produksi anyelir di Indonesia. Kondisi seperti ini menjadikan pentingnya deteksi dini terhadap keberadaan CarMV pada stek yang diperdagangkan atau pada tanaman-tanaman induk yang digunakan sebagai sumber perbanyakan vegetatif.
Untuk keperluan deteksi massal, diperlukan adanya antiserum. Antiserum untuk beberapa virus anyelir sudah diproduksi oleh perusahaan luar. Namun, untuk mendapatkan antiserum tersebut membutuhkan biaya yang cukup besar dan kadang-kadang membutuhkan waktu yang cukup lama karena harus diimpor dari luar negeri.
Pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi di Indonesia sangat diperlukan untuk mengurangi ketergantungan negara terhadap produk-produk luar negeri. Terkait hal ini, di Indonesia sudah dilakukan produksi antiserum secara konvensional terhadap beberapa virus penting yang menginfeksi berbagai jenis tanaman pertanian seperti Chrysanthemum virus B (CVB) pada krisan (Temaja et al. 2010). Secara konvensional, antiserum dibuat melalui purifikasi partikel virus dari tanaman sakit yang kemudian diinjeksikan ke kelinci untuk menginduksi pembentukan antibodi terhadap virus tersebut dalam tubuh kelinci. Namun, melalui metode konvensional ini, antiserum yang dihasilkan tidak spesifik terhadap virus target saja tetapi juga terhadap protein tanaman yang terbawa pada saat purifikasi dan terinjeksikan ke dalam kelinci sehingga mempengaruhi hasil pengujian.
Metode pembuatan antiserum yang telah berkembang saat ini ialah melalui kloning gen virus pada sistem ekspresi bakteri Escherichia coli (Nikolaeva et al. 1995; Cerovska et al. 2003; Abdelkader et al. 2004; Komorowsa et al. 2009;). Dengan metode kloning, antibodi yang dihasilkan spesifik terhadap antigen virus yang diinjeksikan dan tidak terjadi reaksi silang (cros reaction) dengan tanaman sehat. Dalam pembuatan antiserum melalui kloning, terdapat beberapa tahapan penting, di antaranya ialah mengekspresikan gen target dan menginjeksikan antigen yang diperoleh ke tubuh hewan mamalia seperti kelinci. Dengan demikian, pada penelitian ini dilakukan ekspresi gen CP CarMV dalam E. coli
untuk mendapatkan antigen yang akan digunakan untuk produksi antiserum pada penelitian berikutnya. Berdasarkan hal tersebut, maka penelitian ini bertujuan mendapatkan antigen CarMV melalui ekspresi gen CP CarMV pada bakteri E. coli.
Metode Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, dari bulan Februari 2015 sampai dengan Mei 2016.
Perancangan Primer
Peracangan primer dilakukan pada data urutan nukleotida CarMV yang diperoleh. Dalam penelitian ini dirancang primer yang akan menghasilkan pita dengan ukuran 1020 bp. Start codon tidak diikutkan dalam fragmen gen CP, tetapi akan digantikan oleh start codon yang sudah terdapat pada vektor ekspresi pET28a. Pada ujung 5’ dari forward primer ditambahkan sekuen tambahan AATTAA dan sekuen dari enzim restriksi BamH1(GGATCC), dan pada ujung 5’
reverse primer ditambahkan sekuen tambahan TAT dan sekuen dari enzim restriksi XhoI (CTCGAG). Urutan nukleotida kedua enzim tersebut sudah diketahui tidak terdapat dalam gen CP CarMV sehingga tidak memotong gen CP dari Carnation mottle virus (Tabel 5.1).
Ekstraksi dan Multiplikasi gen CP CarMV
Ekstraksi RNA total dari tanaman anyelir terinfeksi CarMV (dipilih isolat Ciputri) dilakukan menggunakan kit isolasi RNA total (Xprep Plant RNA Mini
Tabel 5.1 Perancangan primer gen CP CarMV
Primer Sekuen Produk
(pb) CarMV4F
CarMV1020R
5’AATTAAGGATCCGAAAATAAAGGAGAAA
AGATCGCG 3’
(36 basa, GC = 52%, Tm = 60.1 °C)
5’ TATCTCGAGTCATGGTTGTTCTGC 3’
(24 basa, GC = 46%, Tm = 55.7 °C)
1020
Kit). Prosedur ekstraksi sesuai instruksi pembuat kit. Amplifikasi gen CP dilakukan melalui RT-PCR. Untuk reaksi reverse transcription (RT) (10 l),
cDNA disintesis dari total RNA menggunakan Moloney Murine Leukemia Virus
(MMuLV) (Thermo Scientific) pada 25 oC selama 5 menit, 42 oC selama 60 menit, dan 70 oC selama 15 menit. Amplifikasi cDNA dilakukan menggunakan pasangan primer spesifik terhadap gen CP CarMVyang sudah ditambahkan situs enzim restriksi BamHI dan XhoI (Tabel 6.1) dengan produk PCR yang diharapkan berukuran 1020 pb. Amplifikasi cDNA dilakukan sebanyak 39 siklus yang melalui tiga tahapan yaitu pemisahan utas DNA (denaturasi) pada 94 °C selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada 55 °C selama 1 menit, dan sintesis DNA (extension) pada 72 °C selama 1 menit, 10 detik. Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 30 menit, kemudian siklus diakhiri pada suhu 4 °C. Produk PCR yang dihasilkan dipurifikasi menggunakan gel/PCR DNA
fragment extraction kit dengan protokol purifikasi sesuai instruksi dari perusahaan pembuat kit (Genaid, China). Untuk purifikasi diperlukan sekitar 50 µ l produk PCR.
Persiapan Sel Kompeten E. coli strain JM 107 dan BL21(DE3)
Stok E. coli strain JM 107 dan BL21(DE3) dalam gliserol (didapatkan dari Laboratorium Virologi) digores pada media Luria Broth (LB) agar kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C semalam. Satu kultur biakan E. coli semalam dipindahkan ke dalam 4 ml LB cair kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C, dikocok dengan kecepatan 150 rpm selama 16 jam (overnight). Sekitar 200 µl kultur semalam tersebut diambil dan diinokulasikan ke dalam 20 ml media LB cair (1:100), kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 oC dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya kultur bakteri dipindahkan ke beberapa tabung ependorf 2 ml (10 tabung @ 2 ml) dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 °C. Supernatan dibuang dan diambil peletnya. Pelet diresuspensi dengan 1.0 ml CaCl2 1 mM dan diinkubasikan dalam es selama 30 menit. Tabung kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 °C dan diambil peletnya. Pelet bakteri yang diperoleh diresuspensi dengan 50 µ l CaCl2 1 mM yang mengandung 20% gliserol. Sel bakteri kompeten yang sudah didapatkan disimpan pada suhu -80 oC.
TA Kloning
Ligasi. TA kloning dilakukan pada vektor pTZ57R/T. Produk PCR gen CP CarMV yang sudah dipurifikasi diligasi pada TA vektor dalam suatu larutan yang berisi campuran dari 3 µ l produk PCR, 1 µ l vektor pTZ57R/T, 1 µ l enzim T4 DNA ligase, 2 µ l bufer T4 DNA ligase 5x, dan 3 µl ddH2O. Ligasi dilakukan pada suhu 4 oC selama 16 jam. Vektor rekombinan pTZ57R/T-CP kemudian ditransformasi ke dalam bakteri E. coli strain JM 107 yang kompeten yang sudah disiapkan sebelumnya.
Transformasi. Transformasi dilakukan dengan mencampur 2.5 µl hasil ligasi dengan 50 µ l sel kompeten JM 107 dalam tabung ependorf 1.5 ml (dilakukan dalam es). Terhadap siapan ini berturut-turut dilakukan inkubasi dalam es selama 20 menit, heat shock (kejutan panas) pada suhu 42 °C selama 60 detik dalam penangas air agar plasmid bisa masuk ke dalam sel bakteri, siapan segera didinginkan dalam es batu selama 2 menit, kemudian ditambahkan 500 µ l
SOC (pada suhu ruang), dan diinkubasi dengan digoyang pada suhu 37 °C selama 1 jam pada kecepatan 200 rpm. Suspensi bakteri kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang, pelet dan LB yang masih tersisa sampai 50 µ l dihomogenisasi dan ditumbuhkan dalam media LB agar yang mengandung 50 µg/ml ampicillin (Sambrook & Russel 2001).
Konfirmasi Transforman
Konfirmasi keberadaan rekombinan pTZ57RR/T-CP CarMV dalam bakteri transforman dilakukan melalui koloni PCR, pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi BamHIdan XhoI, dan perunutan DNA.
Koloni PCR. Satu koloni transforman (sebagai templat) diambil dengan tusuk gigi, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 0.2 ml (tabung PCR) yang telah diisi dengan komponen PCR. Reaktan PCR dilakukan dengan volume total 25 µ l, terdiri atas 9.5 µ l H2O, 12.5 µl Dream taq PCR master mix 2x, 1 µ l primer forward CP-CarMV 10 mM dan 1 µ l primer reverse CP–CarMV 10 mM (seperti pada Tabel 6.1). Reaksi PCR dilakukan dengan Perkin Elmer 480 Thermocycler dan dikondisikan untuk denaturasi inisiasi pada 94 °C selama 4 menit, kemudian dilanjutkan 35 siklus yang terdiri atas denaturasi 94 °C selama 30 detik, penempelan primer (annealing) pada 55 °C selama 1 menit, dan sintesis DNA (extention) pada 72 °C selama 1 menit, 10 detik. Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 10 menit, kemudian siklus diakhiri pada suhu 4°C (Raikhy et al. 2006).
Hasil koloni PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1% dalam bufer TBE 0.5x dengan voltase 50 V selama 45 menit. Pewarnaan dilakukan dengan merendam gel dalam cairan yang mengandung etidium bromide (EtBr) selama 15 menit, kemudian direndam dalam H2O selama 1 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV Transliuminator dan didokumentasikan dengan kamera digital.
Restriksi. Keberadaan fragmen gen CP CarMV dalam vektor pTZ57R/T dikonfirmasi dengan memotong fragmen gen tersebut dari vektor rekombinan (yang telah diisolasi) dengan enzim restriksi BamHI dan XhoI. Dengan demikian dilakukan isolasi plasmid terlebih dahulu dari bakteri transforman yang menunjukkan reaksi positif pada koloni PCR. Untuk isolasi plasmid, satu koloni transforman dikulturkan pada 4 ml media LB cair yang mengandung antibiotik ampisilin (50 µg/ml). Kultur diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 16 jam. Selanjutnya dilakukan isolasi plasmid secara manual dari bakteri transforman JM 107 mengikuti metode Sambrook & Russel (2001) yang dimodifikasi. Sebanyak 4 ml suspensi bakteri dipeletkan dengan disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Pelet yang dihasilkan disuspensi dengan 80 µ l larutan I (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA) dengan cara divortek. Selanjutnya, ditambahkan 20 µ l larutan lysozime (20 mg/ml TE) dan divortek kembali selama 2 menit kemudian diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Setelah itu, ditambahkan 200 µ l larutan II (0.2 M NaOH, 1% SDS), tabung dibolak-balik sebanyak 10 kali dengan tujuan untuk melisis dinding sel bakteri, dan diinkubasi selama 5 menit dalam es. Sebanyak 200 µ l larutan III (3M CH3COOK, pH 4.8) kemudian ditambahkan ke dalam tabung untuk netralisasi, dibolak-balik sebanyak 10 kali, dan inkubasi kembali selama 5 menit dalam es. Supernatan diambil dengan disentrifugasi pada
kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 500 µ l Phenol- Chloroform-Isoamilalkohol (PCI) (25:24:1) ke dalam supernatan dan divortek selama 2 menit untuk mengekstrak protein dan lipid yang terdapat dalam suspensi. Tabung kemudian disentrifugasi 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang mengandung molekul-molekul DNA/RNA dipisahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan etanol absolut dingin 2.5 x volume. Tabung dibolak-balik selama 10 kali, diinkubasi 3 menit dan disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet DNA/RNA yang diperoleh dicuci dengan cara menambahkan 1 ml etanol 70% dingin dan disentrifugasi 12000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh dikeringanginkan (selama 15 menit), kemudian dilarutkan dengan 35 µ l larutan TE yang mengandug RNAse (20 µg/ml TE) dan diinkubasi pada suhu 37 oC. Plasmid yang diperoleh disimpan pada suhu -20 oC selama 30 menit.
Restriksi terhadap plasmid rekombinan yang sudah diperoleh dilakukan dalam campuran yang terdiri atas 3 µ l vektor rekombinan pTZ57R/T-CP (hasil isolasi), 4.5 µ l H2O (nuclease free water), 1 µ l bufer BamHI, 0.5 µl BamHI, dan 1 µ l XhoI. Campuran diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 16 jam. Hasil restriksi kemudian divisualisasikan dalam 1% gel agarosa dalam 0.5x TBE.
Perunutan DNA. Perunutan DNA dilakukan untuk mengonfirmasi integritas/urutan nukleotida gen CP CarMV yang tersisipkan ke dalam vektor pTZ57R/T. Sekuensing dilakukan dari plasmid rekombinan hasil isolasi menggunakan primer universal M13F(-20) dan M13RpUC(-26) di 1st’ Base Laboratories, Malaysia.
Sub kloning
Rekombinan vektor pTZ57R/T-CP CarMV dan pET28a diputus dengan enzim restriksi BamHI dan XhoI, konstruksi vektor ekspresi, ligasi, transformasi dan konfirmasi transforman (bakteri pembawa vektor rekombinan pET28a-CP CarMV).
Perbanyakan Vektor Ekpsresi pET28a. Perbanyakan vektor pET28a dilakukan dengan tujuan mendapatkan stok plasmid yang cukup, karena vektor plasmid pET28a yang tersedia sangat terbatas. Plasmid pET28a yang tersedia (diperoleh dari Laboratorium Virologi) ditransformasi ke sel bakteri E. coli
BL21(DE3) yang kompeten yang sudah disiapkan sebelumnya. Selanjutnya dilakukan isolasi plasmid dari sel bakteri BL21 yang tumbuh menggunakan metode secara manual (Sambrook et al. 2001).
Pemotongan/Restriksi Vektor Ekspresi pET28a dan pTZ57R/T. DNA vektor (plasmid) yang digunakan untuk ekspresi gen dipotong sebelumnya dengan enzim restriksi yang sama yang digunakan dalam perancangan primer, yaitu
BamHI dan XhoI. Sebanyak 40 µ l campuran (4x reaksi) yang terdiri atas 12 µ l pET28a, 4 µl BamH1, 4 µ l XhoI, 4 µ l bufer BamHI, dan 16 µ l dd H2O diinkubasi pada suhu 37 oC selama satu malam. Terpotong atau tidaknya vektor ekspresi pET28a dikonfirmasi melalui visualisasi pada gel agarosa 1%. Vektor ekspresi yang telah terpotong dipurifikasi dari gel menggunakan gel/PCR DNA fragment extraction kit dengan protokol purifikasi sesuai instruksi dari perusahaan pembuat kit. Fragmen gen CP CarMV yang sudah tersisipkan pada vektor pTZ57R/T pada TA kloning diisolasi dengan melakukan restriksi menggunakan enzim BamHI dan
tetapi dengan 5x reaksi (72.5 µ l dH2O, 5 µl bufer BamHI, 15 µl plasmid rekombinan, 2.5 µ l BamHI, dan 5 µ l XhoI). Hasil restriksi divisualisasi dalam gel agarosa 1% dalam 0.5x TBE. Bagian gel yang menunjukkan gen CP CarMV selanjutnya dipurifikasi menggunakan kit komersial seperti tahap sebelumnya.
Ekpresi gen CP-CarMV dalam pET28a dilakukan menggunakan promoter T7. Gen CP-CarMV disisipkan pada tempat pemotongan BamHI/XhoI yang terletak antara promoter T7 dan 6xhis-tag pada ujung depan setelah start codon
dan 6xhis-tag pada ujung belakang sebelum stop codon dari pET28a sehingga terbentuk pET28a – CP CarMV(Gambar 5.1).
Gambar 5.1 Konstruksi gen CP-CarMV dalam vektor ekspresi pET28a
Ligasi dan Transformasi pada Sistem Ekspresi. Fragmen gen CP- CarMV yang dipotong dari rekombinan pTZ57R/T-CP CarMV dan vektor ekspresi pET28a (Novagen) yang telah dipotong dengan enzim restriksi BamH1 dan XhoI diligasi dilakukan dalam volume 10 µl yang terdiri atas 1 µl vektor plasmid pET28a, 3 µl fragmen gen CP-CarMV, 2 µ l bufer T4 DNA ligase 5x, 1 µl T4 DNA ligase, dan 3 µl dd H2O. Campuran diinkubasi pada suhu 4 oC selama 16 jam. Transformasi dilakukan dengan mencampur 2.5 µl hasil ligasi dengan 50 µ l sel kompeten BL21(DE3) dalam tabung ependorf 1.5 ml (dalam es). Terhadap siapan ini selanjutnya diberikan perlakuan seperti pada metode transformasi yang dijelaskan pada TA kloning. Namun, pelet dan LB yang masih tersisa sampai 50 µ l dihomogenasi dan ditumbuhkan pada media LB agar yang mengandung 25 µg/ml kanamycin.
Konfirmasi transforman. Pada tahap ini, konfirmasi bakteri transforman dilakukan melalui koloni PCR. Koloni-koloni bakteri yang tumbuh pada media digunakan sebagai templat pada koloni PCR. Metode koloni PCR dilakukan seperti dijelaskan pada metode konfirmasi transforman pada TA kloning dengan primer CarMV4F dan CarMV1020R.
Ekspresi gen CP CarMV
Ekspresi gen CP CarMV dalam E coli diamati melalui suatu teknik/tahap yang disebut dengan kultur ekspresi. Pada tahap ini, koloni E.coli strain BL21(DE3) yang membawa plasmid rekombinan pET28a-CP CarMV diinokulasikan ke dalam 4 ml media LB yang mengandung 25 g/ml kanamycin. Biakan diinkubasi di dalam orbital shaker (120 rpm) pada suhu 37 oC selama 16- 18 jam. Kemudian, 120 l biakan semalam di inokulasikan ke dalam 12 ml media LB cair (1:100) yang mengandung 25 g/ml kanamycin dan diinkubasikan di
dalam orbital shaker (150 rpm) pada suhu 37 oC. Setelah pertumbuhan bakteri mencapai OD600 0.5-0.7 (kira-kira 3 jam), ditambahkan Isopropyl β-D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG) ke dalam biakan untuk menginduksi terjadinya ekspresi protein gen CP CarMV dalam E. coli dengan konsentrasi akhir 0.25, 0.5, 0.75,dan 1.0 mM (optimasi konsentrasi IPTG), selanjutnya diinkubasikan pada suhu optimasi 25, 30 dan 37 oC. Pemanenan bakteri dilakukan pada 4, 8, dan 12 jam setelah induksi (optimasi waktu inkubasi). Sel bakteri yang dikultur- ekpresikan dipanen dengan disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit (suhu ruang). Pelet yang dihasilkan diambil dan disimpan pada suhu -80 oC untuk analisis selanjutnya dengan metode SDS-PAGE.
Analisis Protein melalui Sodiumdodesylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
Analisis protein melalui SDS-PAGE dilakukan dengan tahapan sebagai berikut: 1) Preparasi sampel hasil kultur ekpresi, 2) Preparasi gel polyacrylamide, 3) Elektroforesis, dan 4) pewarnaan.
Preparasi Sampel. Sampel berupa pelet bakteri transforman dalam tabung ependorf hasil kultur ekspresi yang diinduksi dengan penambahan IPTG. Sebanyak 50-100 µ l bufer lisis ditambahkan ke dalam tabung yang berisi pelet bakteri (dari 1.5 ml suspensi bakteri). Tabung divortek selama 2 menit, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang sambil digoyang pada kecepatan 150 rpm. Selanjutnya tabung disentrifugasi pada 12000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang dihasilkan dipisahkan ke dalam tabung ependorf baru. Selanjutnya ditambahkan 50-100 µ l bufer sampel 2x (1:1) (10% SDS, 10 mM DTT, 20% Glycerol, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, dan 0.5% BPB) ke dalam supernatan dan 250 µ l sampel bufer 1x ke dalam pelet yang dihasilkan dan divortek beberapa menit, kemudian dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100 oC. Sampel disimpan dalam es sebelum dilakukan elektroforesis.
Preparasi gel. Sebanyak 36.19 ml separating gel 12.5% dibuat dengan cara mencampur 12 ml akuades, 9 ml ml tris HCl 1.5 M pH 8.8 yang mengandung 0.4% SDS (Bufer A), 15 ml acrylamide/bis 30% (37.5:1), 170 µl amonium persulfat (APS) 10%, dan 20 µ l TEMED. Larutan yang sudah terbentuk dituang ke dalam cetakan gel. Separating gel dibiarkan beberapa saat kemudian dituangkan sekitar 5 ml air pada bagian atasnya supaya permukaan gel terlihat rata. Setelah 30 menit gel akan membeku. Setelah separating gel membeku, disiapkan 12 ml stacking gel 4.5% dengan cara mencampur 7.2 ml akuades, 1.8 ml acrylamide/bis 30% (37.5:1), 3.0 ml 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 yang mengandung 0.4% SDS (Bufer B), 45 µ l APS 10%, dan 20 µ l temed. Sebelum stacking gel
dituangkan, air yang berfungsi sebagai perata permukaan separating gel tadi harus dibuang, kemudian larutan stacking gel dituang ke dalam cetakan tersebut dan segera dimasukkan sisir (comb) untuk membentuk sumuran gel. Adanya gelembung udara dalam gel harus dihindari ketika pembuatan gel.
Elektroforesis. Setelah stacking gel membeku (diinkubasi selama 1 jam),
comb dibuka dan gel dipindahkan ke dalam chamber elektroforesis. Chamber
kemudian diisi dengan bufer elektroforesis sehingga sumuran gel terendam. Sebagai bufer elektroforesis digunakan 1x Tris-glycine-SDS PAGE (25 mM Tris- HCl, 200 mM Glycine, dan 0.1% SDS). Sebelum diisi dengan sampel, sumuran gel dibersihkan dari sisa-sisa gel dengan cara menyemprot-nyemprotnya
menggunakan larutan bufer elektroforesis. Setelah itu, sebanyak 10 µ l penanda protein low range (Bio Rad) dan 40 µl sampel yang sudah disiapkan sebelumnya (sudah dicampur dengan sampel bufer) dimasukkan ke dalam sumuran gel yang sudah dibersihkan. Elektroforesis dilakukan pada Biorad power pac 300. Sumuran yang tidak diisi sampel diisi dengan sample buffer. Setelah sumuran terisi semua, tangki elektroforesis ditutup, kabel dihubungkan ke power suplay, yang positif (merah) ke yang positif lagi, dan sebaliknya yang negatif (hitam) ke yang negatif lagi. Power suplay dijalankan pada tegangan 150 volt (constant