Kerja enzim sering terganggu karena adanya kontaminan, sehingga agar terhindar dari kontaminan tersebut maka perlu dilakukan ekstraksi enzim sebelum melakukan tahap pemurnian. Proses ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini meliputi tahap presipitasi dan dialisis.
1. Presipitasi
Presipitasi merupakan tahap penambahan reagen sehingga terjadi pengendapan protein. Reagen yang biasa digunakan adalah garam (amonium sulfat, sodium sulfat), pelarut organik (metanol, etanol, isopropanol), dan polimer organik (Harris dan Angal, 1989). Reagen yang dipilih pada penelitian ini adalah garam amonium sulfat karena metode presipitasi yang digunakan adalah presipitasi dengan peningkatan kekuatan ion (salting out). Menurut Suwanto et al., (1991) keuntungan menggunakan garam amonium sulfat adalah kelarutannya tinggi dalam air,
harganya murah, tidak dipengaruhi struktur protein, tidak memberi pengaruh yang berarti pada enzim, dan tidak beracun. Amonium sulfat ditambahkan dengan konsentrasi yang tinggi yaitu 80% amonium sulfat jenuh dan bentuk garam yang ditambahkan berupa bahan padat. Dimana penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi tinggi menyebabkan peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan menarik mantel air dari koloid protein, sehingga interaksi hidrofobik diantara sesama molekul protein pada suasana ionik tinggi akan menurunkan kelarutan protein (salting out). Haliza (2003) melaporkan bahwa amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 80% memberikan aktivitas yang optimum bagi enzim kitosanase. Penambahan amonium sulfat pada kondisi jenuh dimaksudkan agar terdapat kumpulan molekul protein bila telah melewati titik jenuh. Amonium sulfat ditambahkan sedikit demi sedikit dan diatur dengan menggunakan magnetic stirrer, hal ini bertujuan agar kontak antara enzim dengan garam dapat berlangsung dengan baik.
Proses salting out tergantung pada ikatan hidrofobik yang ada pada bagian dalam protein. Dimana saat garam ditambahkan, air akan melarutkan ion garam dan terjadinya peningkatan konsentrasi garam sehingga air lepas dari sekitar protein menyebabkan hydrophobic patches. Hydrophobic patches dari suatu protein dapat berinteraksi/berikatan dengan yang lain menghasilkan endapan, dimana protein yang hydrophobic patches lebih besar akan mengendap sebelum yang lebih kecil (Harris & Angal, 1989). Proses presipitasi dilakukan pada kondisi dingin untuk mengurangi inaktifasi misalnya oleh protease endogenous, dimana penigkatan suhu akibat proses pelarutan dengan bantuan magnetic stirrer dapat menyebabkan denaturasi.
Proses pengendapan disempurnakan dengan menyimpan enzim yang telah ditambahkan amonium sulfat selama semalam pada suhu 4°C. Selama proses penyimpanan molekul-molekul protein beragregasi tetapi tidak langsung semua mengendap, sebagian agregat protein melayang dan terkumpul di bagian permukaan membentuk suatu lapisan. Presipitat (crude enzyme) diperoleh dengan cara sentrifugasi pada suhu 4°C selama
20 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian pelarutan hasil sentrifugasi dengan bufer fosfat 0.05 M pH 6.0 dan larutan enzim yang dihasilkan kemudian diukur aktivitas dan kadar proteinnya. Aktivitas enzim dan konsentrasi protein setelah presipitasi mengalami peningkatan menjadi 1.087 U/ml (gambar 8) dengan konsentrasi protein sebesar 0.759 mg/ml. Hal ini dapat dimengerti karena yang diendapkan oleh amonium sulfat adalah protein enzim dan protein-protein lain. Namun peningkatan yang terjadi pada aktivitas katalitik enzim dan jumlah protein enzim tidak diikuti dengan peningkatan aktivitas spesifik enzim. Aktivitas spesifik enzim setelah presipitasi mengalami penurunan yang cukup besar dari 4.539 U/mg menjadi 1.433 U/mg. Hal ini diduga karena adanya protease endogenous dan kemungkinan adanya sisi aktif enzim yang terdenaturasi. Penurunan yang terjadi pada aktivitas spesifik enzim menyebabkan tingkat kemurnian enzim pun ikut menurun menjadi 0.32 kali.
1.07 1.072 1.074 1.076 1.078 1.08 1.082 1.084 1.086 1.088 Supernatan bebas sel
Crude enzim Dialisat
A k ti v ita s (U /m l)
Gambar 8. Aktivitas enzim kitosanase hasil ekstraksi
2. Dialisis
Menurut Copeland (1994) dialisis merupakan proses yang dilakukan untuk memisahkan/menghilangkan molekul garam amonium sulfat dan ion-ion penggangu lainnya yang berpengaruh terhadap kestabilan molekul protein enzim selama penyimpanan, dimana molekul- molekul kecil dan ion-ion akan melewati pori-pori selaput semipermeabel
(2000) dialisis merupakan proses difusi selektif yang melewati membran semipermeabel dan merupakan metode yang paling dikenal untuk menghilangkan molekul-molekul pengganggu berukuran kecil dan menggantikannya dengan larutan bufer yang masuk ke dalam dialisat.
Pada awal dialisis karena konsentrasi garam di dalam kantong yang lebih tinggi daripada di luar kantong menyebabkan bufer masuk ke dalam kantong. Selanjutnya garam akan keluar dari kantong hingga tercapai kondisi keseimbangan dimana konsentrasi garam di dalam dan di luar kantong sama (gambar 9). Proses dialisis dilakukan dengan memasukkan enzim kedalam kantong dialisis dan merendamnya dalam larutan bufer. Kantong yang digunakan adalah kantong selofan berukuran 10.000 dalton. Selofan merupakan turunan dari membran selulosa yang akan menahan molekul yang memiliki berat molekul lebih dari 10.000 dalton. Perebusan ke dalam larutan EDTA dan sodium karbonat dilakukan terhadap kantong selofan sebelum kantong selofan tersebut digunakan. Adapun tujuan perebusan adalah untuk menghilangkan protein yang mungkin menempel di kantong dan untuk menghindari kontaminasi dari bahan kimia selama proses pabrikan. Bufer yang digunakan adalah bufer fosfat 0.05 M pH 6.0. Proses dialisis dilakukan selama semalam pada suhu 4°C agar tidak terjadi kerusakan enzim. Teknik dialisis dikatakan berhasil bila larutan bufer pendialisis menampakkan warna yang sama seperti sebelum dilakukannya proses dialisis.
Gambar 9. Prinsip dialisis
Kantong dialisis
Konsentrasi larutan
Bufer
Dari hasil analisa, aktivitas enzim dan konsentrasi protein setelah dialisis mengalami penurunan menjadi 1.086 U/ml (gambar 8) dan konsentrasi protein menjadi 0.531 mg/ml. Namun penurunan aktivitas enzim diikuti dengan peningkatan aktivitas spesifik enzim menjadi 2.045 U/mg. Adanya penurunan aktivitas enzim diduga disebabkan oleh hilangnya kofaktor yang berupa ion logam yang penting untuk aktivitasnya dan diduga akibat adanya proteolisis endogenous. Penurunan kadar protein menunjukkan adanya sebagian protein lain yang memiliki berat molekul kurang dari 10.000 dalton bermigrasi keluar membran. Sedangkan peningkatan aktivitas spesifik menunjukkan telah berkurangnya komponen protein non enzim. Peningkatan aktivitas spesifik menyebabkan tingkat kemurnian setelah dialisis mengalami peningkatan menjadi 0.45 kali, hal ini menunjukkan bahwa molekul-molekul yang mengotori telah berkurang dan tingkat kemurnian pun akan semakin meningkat dengan melakukan beberapa metode pemurnian yang lebih selektif seperti dengan metode kromatografi.
Tabel 10. Perbandingan aktivitas enzim dengan kitosanase lain
Sumber Jenis enzim Aktivitas atau
aktivitas spesifik Acuan Bacillus licheniformis MB-2
1. Supernatan bebas sel (waktu panen 7 hari, 55oC) 2. Crude enzyme (amonium sulfat 80%) 3. Dialisat 1.076 U/ml, 4.539 U/mg 1.087 U/ml, 1.433 U/mg 1.086 U/ml, 2.045 U/mg Penelitian ini Bacillus lichenifromis MB-2
Supernatan bebas sel (waktu panen 7 hari, 55oC)
0.8 U/ml Chasanah,
coagulans LH 28.38
(waktu panen 7 hari, 55oC) 2. Crude enzyme (amonium sulfat 80%) 65.39 U/mg Bacillus circulans MH-K1
Supernatan bebas sel (waktu panen 3 hari, 30oC)
4.0 U/mg Yabuki, 1989
Bacillus licheniformis UTK
1. Supernatan bebas sel (waktu panen 8 hari,30oC) 2. Crude enzyme (amonium sulfat 60 – 90%) 3.28 U/ml 124 U/ml Uchida et al., 1992
Mucor rouxii Crude enzyme (amonium sulfat 65%)
6.65 U/mg Arcadiacono et al., 1989