4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.3. Aktivitas Enzim
4.3.2. Enzim bromelin
Enzim bromelin merupakan salah satu enzim protease yang diperoleh dari tanaman keluarga Bromeliaceae. Penelitian ini menggunakan pengempuk daging komersial sebagai sumber enzim bromelin.
Imobilisasi enzim dilakukan dua kali ulangan dengan perlakuan matriks kitosan 0-1 gram. Aktivitas enzim bromelin yang terukur sangat bervariasi. Enzim bromelin tanpa perlakuan (kontrol) mempunyai aktivitas rata-rata sebesar 0,0112 U/ml/menit, sedangkan enzim bromelin dengan perlakuan kitosan, mempunyai aktivitas yang lebih kecil daripada enzim tanpa perlakuan, yaitu berkisar antara 0,0011-0,0108 U/ml/menit. Aktivitas Enzim bromelin imobil terkecil diperoleh pada perlakuan 0,1 g kitosan yaitu sebesar 0,0011 U/ml/menit, sedangkan aktivitas enzim bromelin imobil tertinggi yaitu sebesar 0,0108 U/ml/menit diperoleh pada perlakuan 1 g kitosan. Histogram data hasil imobilisasi yang diperoleh disajikan pada Gambar 12 sebagai rata-rata, sedangkan data mentah hasil pengukuran aktivitas enzim bromelin terdapat pada Lampiran 4.
0.0112 0.0011 0.0028 0.0047 0.0043 0.0066 0.0034 0.0018 0.0041 0.0031 0.0108 0.0000 0.0020 0.0040 0.0060 0.0080 0.0100 0.0120 A k ti v it as E n z im ( U /m l/ me n it ) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Perlakuan (g)
Gambar 12. Histogram hubungan perlakuan kitosan dengan aktivitas enzim bromelin imobil.
Hasil analisis statistik terhadap hipotesis rancangan percobaan memberikan kesimpulan terima H0. Kesimpulan ini diperoleh dari perbandingan besarnya nilai Fhitung terhadap nilai Ftabel.
Nilai Fhitung yang diperoleh pada selang kepercayaan 95% yaitu, sebesar 1,896 dan nilai Ftabel yang
diperoleh adalah 2,854 sehingga terlihat bahwa Fhitung < Ftabel. Kesimpulan yang diperoleh adalah
terima H0, artinya tidak ada perlakuan kitosan yang memberikan pengaruh terhadap aktivitas
Perlakuan kitosan berbagai konsentrasi yang tidak memberikan pengaruh terhadap aktivitas enzim bromelin imobil diduga disebabkan oleh perubahan konformasi protein enzim akibat proses imobilisasi. Perubahan konformasi molekul enzim terjadi karena modifikasi asam amino pada sisi aktif maupun sisi non aktif enzim. Perubahan konformasi ini terjadi karena reaksi asam amino yang bersangkutan dengan senyawa pengikat atau matrik penyangga yang ditambahkan selain itu perubahan konformasi ini juga disebabkan oleh perubahan gaya-gaya yang menentukan keseluruhan struktur enzim seperti gaya elektrostatik, gaya vander walls dan interaksi hidrofobik karena pengaruh lingkungan selama proses imobilisasi atau penambahan molekul polimer penyangga dan senyawa kimia lain yang menginduksi perubahan ini (Suhartono 1989).
Rendahnya nilai aktivitas enzim bromelin imobil yang diperoleh terutama pada perlakuan 0,1 g dan 0,7 g kitosan dimana besarnya aktivitas enzim yang diperoleh masing-masing 0,0011 U/ml/menit dan 0,0018 U/ml/menit disebabkan oleh terjadinya reaksi antara enzim dengan glutaraldehid yang menyebabkan terdegradasinya enzim. Glutaraldehid mempunyai potensi untuk menghambat aktivitas protease yaitu bereaksi dengan gugus sulfhidril pada sisi aktif enzim (Goldstein, Manecke 1976). Aktivitas enzim imobil yang rendah dapat juga disebabkan oleh banyaknya sisi aktif enzim yang ikut terlibat dalam pembentukan ikatan silang pada proses imobilisasi, selain itu adanya tahanan pada matriks enzim imobil juga dapat menghambat pertemuan substrat dengan enzim sehingga aktivitas enzim menurun (Chibata 1978).
Rendahnya nilai aktivitas enzim bromelin pada kedua perlakuan diduga juga karena terjadinya faktor pembagian (partioning). Kelemahan kitosan sebagai matriks penyangga adalah sifatnya yang porous. Sifat porous ini memungkinkan terjadinya efek partisi akibat adanya ruang- ruang mikrokopis pada matriks yang terjenuhi oleh substrat dan produk sehingga substrat yang memiliki ukuran molekul yang relatif lebih besar akan sulit kontak dengan sisi aktif enzim (Messing 1975 diacu dalam Smith 1990).
Penyebab rendahnya aktivitas enzim bromelin imobil diduga juga karena pengukuran aktivitas enzim terimobil dilakukan pada pH dan suhu optimum enzim bebasnya, sedangkan enzim bromelin imobil akan mengalami perubahan sifat seperti aktivitas spesifik, parameter Km, pH, suhu optimum dan sebagainya (Suhartono 1991). Suhu dan pH optimum enzim terimobilisasi dapat berubah atau tetap tergantung pada sifat enzim dan sifat bahan pengikat tersebut (Suhartono 1989), oleh karena itu nilai aktivitas enzim imobil yang diperoleh tidak maksimal dan cenderung menurun karena diukur berdasarkan kondisi enzim bebasnya (kontrol).
Absorpsi awal enzim terhadap matriks kitosan diduga ikut mempengaruhi aktivitas enzim imobil. Absorpsi enzim ini dipengaruhi oleh karakteristik kitosan. Kitosan sebagai polisakarida mempunyai kerangka gula dan sifat yang unik yaitu memiliki gugus amin yang bermuatan positif. Muatan positif ini mengakibatkan gaya tarik menarik yang sangat baik dengan suspensi dalam cairan seperti selulosa dan polimer glikoprotein. Gugus positif kitosan akan berpengaruh kuat pada bahan yang memiliki gugus negatif (protein, anion, polisakarida dan asam nukleat) membentuk ion netral (Sandford, Hucthings 1987). Kekuatan ion juga akan mempengaruhi struktur kitosan. Kekuatan ion akan memberikan pengaruh terhadap sifat kaku matriks kitosan, daya gembung dan
ukuran pori-pori matriks (Rha 1984 diacu dalam Suyanti 2003). Porositas granular kitosan berpengaruh terhadap peningkatan kereaktifan grup-grup amino kitosan.
Berdasarkan sifat-sifat kitosan tersebut dapat diduga pengaruhnya terhadap aktivitas enzim imobil yang dihasilkan. Proses imobilisasi enzim dengan menggunakan matriks kitosan memungkinkan tidak hanya mengikat enzim, tetapi juga senyawa-senyawa lain yang bermuatan negatif, sehingga matriks kitosan akan terjenuhi oleh senyawa tersebut. Matriks kitosan yang sudah jenuh tidak dapat mengikat protein enzim dengan maksimal sehingga banyak protein enzim yang terlarut ataupun terikat dengan glutraldehid dalam cairan yang terbuang pada proses pencucian. Terbuangnya enzim pada proses pencucian membuat jumlah enzim yang terikat pada matriks sedikit dan aktivitas enzim yang terukur pun sangat rendah pada semua perlakuan kitosan terutama pada perlakuan 0,1 g dan 0,7 g kitosan.
4.4. Aktivitas Spesifik Enzim
Aktivitas spesifik adalah jumlah unit enzim per miligram protein. Aktivitas spesifik adalah ukuran kemurnian suatu enzim. Nilai aktivitas enzim akan meningkat selama pemurnian enzim dan akan menjadi maksimum serta konstan jika enzim sudah berada dalam keadaan murni (Lehninger 1993). Aktivitas spesifik umumnya digunakan untuk preparat enzim yang murni, namun dapat juga digunakan untuk preparat enzim yang tidak murni (Winarno 1995).
4.4.1. Enzim papain
Informasi penting yang perlu diperhatikan dalam mengetahui aktivitas spesifik enzim adalah jumlah protein yang terikat pada enzim imobil. Jumlah protein yang terikat pada perlakuan 0 sampai 1 g kitosan dapat dilihat pada Lampiran 5. Perlakuan kontrol mempunyai jumlah protein tertinggi yaitu 0,215 mg protein bila dibandingkan dengan jumlah protein pada enzim imobil. Jumlah protein tertahan pada enzim imobil yang paling rendah diperoleh pada perlakuan 0,1 g kitosan yaitu sebesar 0,092 mg protein, sedangkan jumlah protein tertahan pada enzim imobil papain yang paling tinggi diperoleh pada perlakuan 0,7 g kitosan.
Enzim merupakan protein dimana aktivitas katalitiknya bergantung pada integritas strukturnya sebagai protein. Asam-asam amino yang menyusun enzim sangat mempengaruhi aktivitas katalitiknya sebagai enzim (Lehninger 1993).
Aktivitas spesifik enzim papain imobil yang disajikan pada Gambar 13 menunjukkan bahwa aktivitas enzim dengan perlakuan kitosan mempunyai nilai aktivitas spesifik yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan kontrol. Nilai aktivitas spesifik enzim kontrol yaitu 0,0948 U/mg protein enzim, sedangkan nilai aktivitas spesifik enzim imobil berkisar antara 0,0940-0,1432 U/mg protein enzim dengan aktivitas spesifik terendah pada perlakuan 0,7 g kitosan dan aktivitas spesifik tertinggi pada perlakuan 1 g kitosan.
0.0498 0.1291 0.1033 0.1024 0.1158 0.1305 0.1165 0.0940 0.1198 0.1097 0.1432 0.0000 0.0200 0.0400 0.0600 0.0800 0.1000 0.1200 0.1400 0.1600 A k ti v it as E n z im ( U /m g pr ot e in) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Perlakuan (g)
Gambar 13. Histogram hubungan perlakuan kitosan dengan aktivitas spesifik enzim papain imobil.
Aktivitas spesifik enzim kontrol yang rendah dengan konsentrasi protein yang terukur sangat tinggi diduga disebabkan oleh adanya kemungkinan protein enzim papain terinaktivasi oleh lingkungan bercahaya yang menyebabkan terjadinya oksidasi pada gugus aktif enzim (Suhartono 1991). Enzim papain dapat terinaktivasi oleh senyawa pengganggu gugus tiol seperti oksidator, disulfida, iodo asetat, pereaksi aldehid, senyawa pengalkil dan logam berat (Muchtadi et al. 1992). Jumlah protein yang tertahan pada enzim imobil dengan perlakuan 0,7 g kitosan termasuk tinggi, tetapi aktivitas enzim spesifik yang dihasilkan cukup rendah. Rendahnya aktivitas spesifik pada perlakuan ini mungkin disebabkan perubahan konformasi molekul enzim selama proses imobilisasi. Perubahan konformasi ini terjadi karena reaksi asam amino yang bersangkutan dengan senyawa pengikat atau matriks penyangga yang ditambahkan (Suhartono 1989) sehingga asam- asam amino penyusun protein enzim papain tersebut memberikan aktivitas katalitik spesifik yang rendah.
Jumlah protein tertahan yang tinggi dengan aktivitas spesifik yang rendah diduga dipengaruhi oleh stabilitas operasional. Kondisi operasional yang tidak stabil dapat menyebabkan denaturasi protein enzim dan molekul penyangga karena kecepatan aliran substrat atau pelarut lainnya selain disebabkan oleh perubahan pH, suhu, kekuatan ion dan kondisi fisik lainnya (Suhartono 1989).
Jumlah protein tertahan yang rendah dengan aktivitas spesifik enzim yang tinggi diduga disebabkan oleh tidak terjadinya perubahan konformasi dari molekul protein enzim secara signifikan. Hal ini dapat dijelaskan karena enzim berada dalam bentuk ikatan silang yang mantap dan tepat dengan kitosan melalui bantuan pereaksi glutaraldehid. Enzim yang direaksikan dengan bantuan glutaraldehid pada konsentrasi tertentu dengan pH, suhu, kekuatan ion, medium reaksi dan waktu reaksi yang tepat akan membentuk tingkat cross-linking yang diinginkan yang membuat enzim tidak larut (Suhartono 1989). Kitosan yang digunakan sebagai molekul penyangga juga
dapat berperan sebagai pelindung molekul protein enzim dari kondisi fisik yang ekstrim. Kitosan mempunyai struktur berpori sehingga memberikan keuntungan berupa luas permukaan ikatan serta perlindungan protein enzim dalam porinya terhadap kerusakkan fisik oleh lingkungan (Messing 1975 diacu dalam Mayangsari 1995).
4.4.2. Enzim bromelin
Berdasarkan data yang dihasilkan pada pengukuran kandungan protein enzim bromelin, diperoleh jumlah protein tertinggi pada enzim tanpa perlakuan (kontrol) yaitu sebesar 0,304 mg protein enzim. Jumlah protein tertahan pada enzim bromelin imobil berkisar antara 0,078-0,234 mg protein enzim dengan kandungan protein yang tertinggi pada perlakuan 1 g kitosan dan jumlah protein tertahan yang paling rendah pada enzim yang diberi perlakuan 0,9 g kitosan. Kandungan protein enzim bromelin yang tertahan pada matriks dipengaruhi oleh karakteristik kitosan. Menurut Shahidi et al. (1999) kitosan memiliki tiga gugus fungsi yang reaktif yaitu sebuah gugus amino, gugus hidroksil primer dan gugus sekunder pada posisi C-2, C-3 dan C-6 secara berurutan. Gugus amino yang bermuatan positif memiliki afinitas atau daya tarik menarik yang sangat baik dengan suspensi dalam cairan. Gugus amino ini akan berikatan kuat dengan bahan yang bermuatan negatif seperti protein, anion polisakarida dan asam nukleat membentuk ion netral. Enzim merupakan protein yang memiliki sifat katalitik, oleh karena itu enzim dapat diserap oleh kitosan. Proses penyerapan enzim juga berhubungan dengan gugus hidrofilik di dalam molekul kitosan yang menyebabkan kitosan mempunyai kemampuan untuk mengikat air dan bahan-bahan tersuspensi dalam air.
Penambahan konsentrasi kitosan yang semakin besar diharapkan memberikan kemungkinan tingginya kandungan protein enzim yang tertahan, namun kandungan protein enzim bromelin tertahan yang terukur pada penelitian ini berbanding terbalik dengan perlakuan kitosan yang diberikan. Kandungan protein enzim yang tertahan semakin kecil dengan bertambah besarnya perlakuan konsentrasi kitosan.
Rendahnya kandungan protein enzim yang tertahan diduga berhubungan dengan daya serap atau daya ikat dari matriks kitosan. Kitosan mungkin saja mengikat bahan-bahan yang tersuspensi dalam larutan enzim sepert anion polisakarida, protein non enzim dan senyawa pengotor lainnya terlebih dahulu karena memiliki bobot molekul yang lebih rendah, sedangkan protein dari enzim bromelin dengan bobot molekul 33.000 dalton tidak mampu diserap secara maksimal (Suhartono 1991). Selektifitas pengikatan molekul ini memungkinkan matriks kitosan dengan konsentrasi rendah akan cepat jenuh oleh bahan-bahan tersuspensi yang berbobot molekul rendah dibandingkan dengan kitosan konsentrasi tinggi yang masih dapat mengikat protein enzim secara lebih baik.
Aktivitas spesifik enzim bromelin imobil yang diperoleh pada penelitian ini disajikan pada Gambar 14. Berdasarkan Gambar 14 dapat dilihat bahwa perlakuan 0,1 g kitosan memberikan aktivitas spesifik yang terendah bila dibandingkan dengan semua perlakuan yaitu sebesar 0,0036
U/mg protein enzim. Aktivitas spesifik enzim bromelin imobil tertinggi diperoleh pada perlakuan 1 g kitosan, dengan aktivitas spesifik sebesar 0,0733 U/mg protein enzim.
0.0374 0.0036 0.0132 0.0318 0.0338 0.0340 0.0285 0.0171 0.0303 0.0494 0.0733 0.0000 0.0100 0.0200 0.0300 0.0400 0.0500 0.0600 0.0700 0.0800 A k ti v it as E n z im ( U /m g pr ot e in) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Perlakuan(g)
Gambar 14. Histogram hubungan perlakuan kitosan dengan aktivitas spesifik enzim bromelin imobil.
Aktivitas spesifik enzim bromelin imobil pada perlakuan 0,1 g kitosan sangat rendah bila dibandingkan dengan aktivitas spesifik enzim semua perlakuan (Gambar 14) walaupun jumlah protein enzim yang tertahan sangat tinggi dibandingkan dengan semua perlakuan (Lampiran 5). Faktor yang mempengaruhi hal ini diduga disebabkan enzim telah mengalami kerusakan selama proses imobilisasi akibat pengaruh pereaksi glutaraldehid ataupun matriks kitosan yang ditambahkan. Penambahan senyawa pengikat atau polimer penyangga dapat menyebabkan perubahan konformasi molekul enzim yang berupa modifikasi asam amino baik pada sisi aktif maupun sisi non aktif (Suhartono 1989). Pembentukan ikatan silang menyebabkan kemungkinan enzim menjadi tidak aktif sebagian atau seluruhnya akibat reaksi kimia selama cross-linking atau akibat pengikatan pada pusat aktif enzim (Smith 1990).
Aktivitas spesifik enzim imobil yang tinggi seperti yang diperoleh pada perlakuan 1 g kitosan dengan jumlah protein terikat yang sangat kecil (Lampiran 5) diduga karena adanya selektifitas dari matriks kitosan. Gugus reaktif kitosan hanya berikatan dengan protein enzim melalui bantuan pereaksi glutaraldehid dalam konformasi yang tepat dengan tidak mengganggu gugus sulfhidril sebagai gugus aktif enzim bromelin, sehingga nilai aktivitas spesifik enzim yang terukur masih mempertahan daya kataliknya. Juang et al. (2002) menyatakan pengikatan satu molekul –CHO dari glutaraldehid dengan hanya satu gugus –NH2 dari kitosan dapat menyebabkan
meningkatnya aktivitas enzim imobil.
Konsentrasi kitosan yang ditambahkan juga ikut memberikan pengaruh terhadap nilai aktivitas spesifik enzim imobil yang dihasilkan. Pengikatan silang dapat terjadi dari berbagai sisi reaktif kitosan termasuk –NH2 dan –OH (Monteiro diacu dalam Juang et al. 2002), sehingga
dengan konsentrasi kitosan yang tinggi memberikan kemungkinan lebih besar untuk berikatan dengan molekul protein enzim secara lebih maksimal dan lebih spesifik melalui bantuan glutaraldehid sehingga aktivitas spesifik enzim pada perlakuan ini lebih tinggi. Hal sebaliknya berlaku juga terhadap perlakuan kitosan dengan konsentrasi yang rendah, karena konsentrasi kitosan yang rendah memberikan kemungkinan protein enzim yang terikat lebih kecil sehingga menyebabkan aktivitas spesifik enzim bromelin terimobil yang diperoleh pun menjadi rendah.