Metode Analisis

3. METODOLOG

3.3. Metode Analisis

Kitosan yang telah dihasilkan pada penelitian pendahuluan diuji mutunya.

Uji mutu kitosan ini meliputi uji kadar air, kadar abu, kadar nitrogen, derajat

deasetilasi dan uji viskositas. Kitosan yang telah diuji mutunya kemudian

diaplikasikan sebagai matriks penyangga proses imobilisasi enzim pada

penelitian utama. Enzim terimobil dianalisis secara kualitatif yang meliputi uji

aktivitas enzim dan uji protein untuk menentukan aktivitas spesifik enzim

terimobil.

3.3.1.

Kadar air (AOAC 1995)

Penentuan kadar air didasarkan pada perbedaan berat contoh sebelum dan

sesudah dikeringkan. Cawan porselin kosong dikeringkan pada suhu 105

o

C

selama 1 jam, kemudian cawan tersebut didinginkan dalam desikator dan

ditimbang beratnya (A gram). Cawan yang telah ditimbang tersebut diisi

dengan sampel sebanyak 5 gram dan ditimbang beratnya (B gram). Cawan yang

sudah berisi sampel tersebut dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105

o

C sampai

beratnya konstan. Kadar air dihitung berdasarkan persamaan:

Kadar air (%) =

(B-A)

×100%

contoh

berat

Keterangan : A = berat cawan + contoh kering (g)

B = berat cawan + contoh basah (g)

3.3.2.

Kadar abu (AOAC 1995)

Cawan dibersihkan dan dikeringkan dalam oven selama 30 menit pada suhu

105

o

C, lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel sebanyak 1 g

ditimbang lalu dimasukkan ke dalam cawan, kemudian dibakar diatas kompor

listrik sampai tidak berasap lagi dan selanjutnya dimasukkan dalam tanur

pengabuan dengan suhu 650

o

C selama 5 jam. Cawan didinginkan dalam desikator

dan kemudian ditimbang. Kadar abu ditentukan dengan rumus:

Kadar abu (%) =

berat abu

×100%

sampel

3.3.3.

Kadar protein (AOAC 1995)

Sampel 0,5 g dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 50 ml, lalu ditambahkan

kjeltab dan 2,5 ml H

2

SO

4

pekat. Contoh didestruksi sampai cairan berwarna hijau

bening. Campuran tersebut dibiarkan sampai dingin, kemudian dipindahkan ke

alat destilasi. Labu Kjeldal yang telah digunakan dicuci dengan akuades. Air

cucian tersebut dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 10 ml NaOH

pekat sampai berwarna coklat kehitaman, lalu didestilasi. Hasil destilasi

ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml H

3

BO

3

dan indikator

metilen blue, lalu dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai berubah menjadi

warna pink. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung

dengan persamaan di bawah ini:

Kadar Nitrogen (%) =

(

−

)×

×14,007×100%

sampel

mg

HCl

N

blanko

ml

HCl

ml

3.3.4.

Derajat deasetilasi (diacu dalam Suptijah et al. 1992)

Kitosan sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 200 ml asam asetat 2%.

Larutan tersebut dikeringkan dalam suhu kamar di atas “glass plate”, kemudian

ditambahkan sodium hidroksida 1 N untuk menetralkan asam asetat yang telah

ditambahkan sebelumnya dan dicuci dengan air bersih. Derajat deasetilasi

diukur dengan spektrofotometer inframerah IR-408.

Pengukuran derajat

deasetilasi berdasarkan kurva yang tergambar oleh spektrofotometer. Puncak

tertinggi (P

o

) dan puncak terendah (P) dicatat dan diukur dengan garis dasar

yang dipilih. Nisbah absorbansi dihitung dengan rumus:

A =

P

Po

Log

dimana : P

o

= Jarak antara garis dasar dengan garis singgung antara dua

puncak tertinggi dengan panjang gelombang 1.655 cm

-1

atau 3.450 cm

-

'

P = Jarak antara garis dasar dengan lembah terendah dengan

panjang gelombang 1.655 cm

-1

atau 3.450 cm

-1

Perbandingan absorbansi pada 1.655 cm

-1

dengan absorbansi 3.450 cm

-1

digandakan satu per standar N-deasetilasi kitosan (1,33). Pengukuran absorbansi

pada puncak yang berhubungan dengan nilai persen N-deasetilasi dapat dihitung

dengan rumus:

% N-deasetilasi =













×













×

100%

33

.

1

1

450 . 3 655 . 1

A

A

3.3.5. Viskositas (Sophanodora, Benjakula 1993)

Kitosan sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 200 ml asam asetat 2 %.

Larutan kitosan ini kemudian diukur nilai viskositasnya dengan menggunakan

viskosimeter rotari model BM. Rotari yang digunakan adalah rotari no 2 dengan

menggunakan kecepatan putaran 60 rpm.

Nilai viskositas dinyatakan dalam satuan centipoise (cps). Viskositas

dihitung dangan menggunakan rumus :

Viskositas (cP) = Nilai terukur x (Konstanta R-2, V 60 rpm)

Nilai konstanta rotari no 2 pada putaran 60 rpm adalah 5.

3.3.6.

Penentuan aktivitas protease (Bergmeyer, Grassl 1983)

Menurut prosedur pengukuran aktivitas enzim ini, pereaksi trikloroasetat

(TCA) digunakan untuk mengendapkan sisa protein substrat yang tidak sempat

terurai. Pereaksi folin digunakan untuk memberikan warna yang dapat dipantau

dengan spektrofotometer sinar tampak.

Prosedur pengukuran aktivitas enzim protease ini secara berurutan terdiri

atas tiga tahap. Setiap sampel memerlukan tabung reaksi masing-masing untuk

blanko, standar dan sampel. Pembuatan pereaksi yang digunakan pada uji ini

dapat dilihat pada Lampiran 1.

Tahap pertama, ke dalam ketiga tabung reaksi masing-masing dimasukkan

0,25 ml buffer borat 0,01 M dengan pH 8, substrat kasein 0,25 ml. 0,05 ml

campuran enzim dimasukkan ke dalam tabung sampel, sedangkan pada tabung

standar dimasukkan 0,05 ml larutan standar (5mmol/l). Akuades sebanyak 0,05

ml dimasukkan sebagai larutan blanko. Ketiga tabung selanjutnya diinkubasi pada

suhu 50

o

C (suhu optimum bromelin) atau 55

o

C (suhu optimum papain) selama

10 menit.

Tahap kedua dilakukan setelah inkubasi pertama. Setiap tabung ditambah

dengan 0,5 ml TCA 0,1 M. Tabung blanko dan standar ditambah dengan

campuran enzim sebanyak 0,05 ml, sedangkan pada tabung sampel ditambah

akuades 0,05 ml. Keseluruhan tabung reaksi diinkubasi kembali selama 50

o

C

selama 10 menit yang selanjutnya disentrifuse pada 5000 rpm selama 10 menit.

Tahap ketiga dilakukan dengan mengambil 0,375 ml filtrat hasil sentrifuse.

Masing-masing ditambah dengan 1,25 ml larutan Na

2

CO

3

(0,4 M) dan folin

0,25 ml. Tabung sampel, standar dan blanko diinkubasi kembali pada 50

o

C

selama 20 menit, kemudian dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang

gelombang 578 nm. Prosedur dapat dilihat pada Tabel 5. Pengukuran nilai

aktivitas enzim protease dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :

T

1

P

A

-

A

A

-

A

U

bl st bl sp

×

×

=

Keterangan :

U = unit aktivitas dalam IU (Internasional Unit) per menit

A

sp

= nilai absorbansi sampel

A

bl

= nilai absorbansi blanko

A

st

= nilai absorbansi standar (tirosin)

P = faktor pengenceran

T = waktu inkubasi (menit)

Tabel 5. Prosedur pengukuran aktivitas protease

No

Pereaksi

Sampel

(ml)

Blanko

(ml)

Standar

(ml)

1

Bufer borat (0,01 M pH 8)

0,25

0,25

0,25

2

Substrat kasein 2% pH 8

0,25

0,25

0,25

3

Enzim (2 mmol/l)

0,05

-

-

4

Tirosin standar

-

-

0,05

5

Air suling

-

0,05

-

6

Inkubasi pada suhu 50

o

C selama 10 menit

7

TCA (0,2 M)

0,5

0,5

0,5

8

Air suling

0,05

-

-

9

Enzim (2mmol/l)

-

0,05

0,05

10

Inkubasi pada suhu 50

o

C selama 10 menit, sentrifuse 10000 rpm

11 Filtrat

0,375

0,375

0,375

12 Na

2

CO

3

1,25

1,25

1,25

13 Pereaksi folin (1:2)

0,25

0,25

0,25

14 Inkubasi pada suhu 50

o

C selama 20 menit, baca absorbansi pada panjang

gelombang 578 nm

3.3.7.

Analisis konsentrasi protein protease kasar (Bradford 1976)

Konsentrasi protein ditentukan melalui metode Bradford (1976) dengan

menggunakan Bovine Serum Albumin sebagai larutan standar protein.

Konsentrasi awal larutan Bovine Serum Albumin adalah 2 mg/ml. Konsentrasi

standar protein BSA tersebut kemudian dibuat menjadi 0,01 hingga 0,3 mg/ml.

Komposisi serial konsentrasi standar protein dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Komposisi larutan standar metode Bradford

No.

tabung

Volume larutan BSA

(ml)

Volume akuades

(ml)

Konsentrasi protein

(mg/ml)

1

1,5

8,5

0,3

2

1,0

9,0

0,2

3

0,6

9,4

0,1

4

0,4

9,6

0,08

5

0,3

9,7

0,06

6

0,2

9,8

0,04

7

0,15

9,85

0,03

8

0,10

9,9

0,02

9

0,06

9,94

0,01

Sumber : Bradford (1976)

Masing-masing konsentrasi standar protein diambil sebanyak 60 ì

l dan

ditempatkan pada tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan 3 ml pereaksi

Bradford. Skema pembuatan larutan Bradford dapat dilihat pada Lampiran 2.

Campuran dihomogenkan selama 5 menit kemudian diukur absorbansinya

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Nilai absorbansi dan

konsentrasi protein dari standar BSA diplotkan pada grafik Cartesius dengan

konsentrasi sebagai absis (sumbu X) dan absorbansi sebagai ordinat (sumbu Y),

kemudian ditentukan persamaan garis regresinya. Kurva tersebut dijadikan

sebagai standar untuk menentukan konsentrasi protein sampel.