TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Fragmentasi DNA Sperma
2.3.1 DNA sperma Manusia dan struktur kromatin
Tidak seperti sel somatik kromatin, kromatin sperma sangat erat dipadatkan berdasarkan asosiasi unik di antara DNA, matriks nukleus, dan protein nukleus sperma. Selama tahap akhir pematangan spermatid, kondensasi chromatin dan reorganisasi histon dan digantikan oleh protamin dan hanya 15% DNA yang tetap berkondensasi dengan histon (Gatewood et al, 1990). Dimasukkannya protamin ke dalam inti sperma memungkinkan untai DNA untuk membentuk struktur toroidal (berbentuk donat), memfasilitasi pemadatan yang erat kepala nukleus sperma untuk menyediakan sarana untuk menonaktifkan sementara transkripsi dari genom haploid laki-laki dan untuk menstabilkan DNA sperma (Balhorn, 1998). Hal ini bertujuan untuk melindungi Universitas Sumatera Utara
integritas genom ayah selama transportasi melalui saluran reproduksi laki-laki dan perempuan dan menjamin DNA ayah disalurkan kedalam proses penyatuan dari dua genom gamet dan mewariskan informasi genetik kepada embrio yang telah terbentuk (Ward dan Zalensky, 1996). Disulfida cross-link inter dan intramolekular antara protamin memungkinkan pemadatan lebih lanjut dan stabilisasi inti sperma, melindungi DNA sperma dari stres eksternal dan kerusakan DNA berikutnya. Kurangnya protamin yang kaya sistein akan menyebabkan instabilisasi DNA sperma. Ada 3 jenis protamin pada manusia. Protein ini kecil, hanya berukuran setengah dari histon dan sangat basa, 55% - 70% mengandung arginin (Cho et al, 2003).
Pria subur dengan parameter semen normal hampir semua memiliki tingkat kerusakan DNA yang rendah, sedangkan laki-laki tidak subur, terutama mereka dengan parameter sperma yang abnormal mempunyai derajat kerusakan DNA yang lebih tinggi. Selain itu, sampai dengan 8% dari pria subur akan memiliki integritas DNA yang abnormal meskipun parameter semen normal (konsentrasi, motilitas, dan morfologi) (Spano et al, 2000).
2.3.2 Etiologi kerusakan DNA sperma
Etiologi kerusakan DNA sperma sama seperti etiologi infertilitas pria, tampaknya multifaktorial dan berupa faktor intrinsik atau eksternal dan sampai sekarang tidak sepenuhnya dipahami.
Gangguan intrinsik yang dapat mempengaruhi kerusakan DNA sperma meliputi: 1. Defisiensi protamin, yang mungkin menyebabkan masalah dalam
pemadatan DNA dan stabilisasi, di mana jika longgar, DNA akan mudah terfragmentasi (Cho et al, 2003; Oliva, 2006).
2. Mutasi yang mempengaruhi merusak proses pemadatan DNA (Gatewood et al, 1990).
3. Defek proses pengemasan DNA. Selama tahap akhir pematangan sperma, untai DNA dipecahkan oleh topoisomerase secara temporer dan ditemukan pada spermatid bulat dan lonjong, sementara itu inti histon dalam spermatid dihancurkan dan digantikan oleh protamin untuk proses pengemasan kromatin ulang. Jika pemecahan sementara DNA tidak diperbaiki karena berlebihan topoisomerase atau kekurangan topisomerase inhibitor maka fragmentasi DNA akan terjadi (Balhorn, 1982; Sharma et al, 2004).
4. Apoptosis abortif. Sampai dengan 75% spermatozoa potensial menyelesaikan proses kematian sel terprogram (apoptosis) selama spermatogenesis (Hikim et al, 1999). Proses ini bertujuan untuk membatasi garis sel germinal supaya sebanding dengan jumlah sel Sertoli yang mendukung mereka. Spermatozoa yang mulai menjalani apoptosis tetapi kemudian terhindar dari proses ("apoptosis abortif") akan menderita peningkatan kerusakan DNA (Sakkas et al, 2003). Teori ini didukung dengan ditemukannya Fas spermatozoa pada ejakulasi, spermatozoa yang mengandung banyak mitokondria yang apoptotik (Donnelly et al, 2000) dan adanya kehadiran aktivitas endonuklease, salah satu mediator potensial dalam apoptosis (Spadofora, 1998).
5. Tingginya kadar Reactive Oxygen Species (ROS) yang terdeteksi dalam cairan semen 25% dari pria infertil (Agarwal et al, 1994), dan kerusakan DNA sperma telah dikaitkan dengan kadar yang tinggi ROS dalam semen (Zini dan Lamirande, 1993). Sumber utama ROS dalam semen berasal dari leukosit (Ozgocmen et al, 2003) dan morfologi sperma dengan bentuk abnormal (Aitken dan Barat, 1990). Dalam keadaan normal, ROS berguna untuk meningkatkan fungsi sperma untuk kapasitasi, reaksi akrosom dan fusi sperma ke dalam oosist (Gagnon et al, 1991). Jumlah ROS juga dikendalikan oleh antioksidan semen. Ketika ROS berlebihan dibanding jumlah antioksidan semen ,keadaan ini disebut sebagai stres oksidatif (Aitken dan Fisher, 1994), ini akan mengoksidasi asam lemak tak jenuh ganda pada membran sperma dan selanjutnya akan terjadi kerusakan DNA (Lopes et al, 1998).
6. Usia ayah yang lanjut telah dikaitkan dengan kerusakan DNA sperma yang mungkin karena disebabkan proses mutasi dan apoptosis (Singh et al, 2003).
Faktor eksternal yang dapat menyebabkan fragmentasi DNA sperma seperti panas (Bank et al, 2005), agen kemoterapi (Hales et al, 2005), radiasi (Aitken dan Luliis, 2007), dan gonadotoxin lain seperti pestisida, kimia berkaitan dengan peningkatan dalam persentase spermatozoa ejakulasi dengan kerusakan DNA, (Bian et al, 2004) meskipun mekanisme yang tepat yang terlibat belum dapat digambarkan (Brinkworth et al, 2000). Merokok (Kunzle et al, 2003), peradangan saluran genital, varicocele (Saleh et al, 2003), Universitas Sumatera Utara
kriptorkismus dan kanker semua telah dikaitkan dengan peningkatan kerusakan DNA pada model binatang atau manusia (Evenson et al, 2006). Kurangnya stimulasi FSH juga akan meningkatkan fragmentasi DNA (Hikim et al, 1999). Akhirnya, tehnik preparasi sperma dengan menggunakan sentrifugasi kecepatan tinggi dan isolasi sperma dari cairan semen, yang mengandung antioksidan yang bersifat protektif , dapat berkontribusi terhadap kerusakan DNA sperma (Donnelly et al, 2000; Younglai et al, 2001).
2.3.3 Konsekuensi kerusakan DNA sperma
Sperma dengan fragmentasi DNA yang tinggi akan kehilangan kemampuannya untuk membuahi sel telur (Ahmadi dan Ng, 1999). Sampai tingkat tertentu kerusakan DNA sperma, oosit memiliki kemampuan untuk memperbaiki kerusakan DNA sperma dan telah dibuktikan dalam telur hamster (Genesca dan Caballin, 1992). Jika sel telur dibuahi dan menjadi embrio, kemungkinan menjadi cacat akan lebih tinggi. Hasil kehamilan dapat berakhir dengan keguguran atau keturunan dengan kelainan genetik (Crow, 1997). 2.3.4 Interpretasi hasil indeks fragmentasi sperma
Kerusakan DNA sperma dapat diukur dan dinyatakan sebagai Indeks Fragmentasi DNA sperma (DFI) dengan menghitung jumlah sperma dengan DNA terfragmentasi dan bandingkan dengan total sperma dihitung. Ambang batas DFI untuk manusia pertama kali dibuat menggunakan data-data dari 200 pasangan usia subur diduga berusaha untuk hamil secara alami dalam "Studi Faktor Infertilitas Pria Georgetown". Data-data dari studi ini digunakan untuk menetapkan ambang statistik DFI> 30% untuk 'lag signifikan', DFI 15-30% untuk 'batas ambang' dan DFI <15% untuk 'status kesuburan tinggi' (Evenson et al, 2006 ).
Studi dilakukan untuk menyelidiki hubungan fragmentasi DNA sperma pada hasil kehamilan menggunakan in-vivo dan prosedur IUI dan hasil menunjukkan bahwa pasien 7.1 kali lebih mungkin untuk mencapai kehamilan / persalinan jika indeks fragmentasi DNA (DFI) adalah <30%. Ketika IVF rutin dipertimbangkan, pasangan itu ~ 2,0 kali lebih mungkin untuk menjadi hamil jika mereka DFI <30% (Bungum et al, 2004). Studi menggunakan ICSI dan / atau pembuahan IVF untuk menyelidiki hubungan fragmentasi DNA sperma pada hasil kehamilan menunjukkan tren di mana pasien 1,8 kali lebih mungkin untuk mencapai kehamilan / persalinan jika DFI adalah < 30% . Tes ini secara Universitas Sumatera Utara
signifikan memprediksi keberhasilan kehamilan yang rendah dengan menggunakan in-vivo, IUI, dan IVF dan tingkat fertilisasi yang lebih rendah dengan ICSI (Morris et al, 2002). Data ini jelas menunjukkan bahwa DFI merupakan komponen penting dari pemeriksaan infertilitas dan menyarankan bahwa jika seorang pria memiliki DFI dari> 30% bahwa IUI seharusnya tidak dipertimbangkan dan bahwa langkah untuk pasangan ini adalah lebih tepat IVF atau ICSI (Bungum et al, 2004 ).
2.3.5 Metode untuk penilaian fragmentasi DNA sperma
Ada beberapa metode dalam penilaian fragmentasi DNA sperma:
a. Pewarnaan Asam anilin biru, dengan mendeteksi histon kaya lisin dan dan dan protamin kaya arginin. Histon akan menyerap warna biru dan protamin tidak akan menyerap warna biru (Hammadeh et al, 2001).
b. Acridine orange Test (AOT), dengan mendeteksi kerusakan DNA sperma menggunakan flow cytometer . Sperma yang dipanaskan sampai 100 ° C selama 5 menit untuk denaturasi DNA dan diikuti dengan pewarnaan dengan acridine Orange (AO), AO interkalasi ke dalam DNA asli dan berfluoresensi hijau bila terkena cahaya biru dan berfluoresensi merah bila dikaitkan dengan DNA beruntai tunggal (Agarwal et al, 2008).
c. Dalam uji in situ nick translation incorporation of biotinylated deoxyuridine trifosfat (dUTP) pada rantai tunggal DNA yang pecah dalam reaksi yang dikatalisis oleh enzim yang dependen DNA polimerase I. Secara khusus sperma yang mengandung cukup banyak kerusakan DNA endogen akan terwarnai (Manicardi et al, 1998).
d. Terminal Deoxynucleotidyl Mediated dUTP transferase Nick end labeling assay (Tunel), esensi dari tes adalah untuk mentransfer nukleotida berlabel ke 3 ° OH dari untai DNA yang pecah dengan menggunakan terminal deoxynucleotidyl transferase. Intensiatas Fluoresens dari masing-masing diperiksa sperma ditentukan sebagai ya atau tidak untuk sperma pada slide mikroskop cahaya fluoresence atau dengan saluran intensitas fluoresen dalam alat flow cytometer (Sailer et al, 1995).
e. Uji komet, terdiri dari untai DNA yang pecah terdeteksi dalam sel tunggal pada slide mikroskop. Metodologi ini terdiri dari pencampuran sperma dengan agarosa meleleh, yang ditempatkan pada slide kaca. Sel-sel mengalami lisis dan kemudian mengalami elektroforesis horisontal. Berat Universitas Sumatera Utara
molekul tinggi, DNA yang tidak rusak tetap di kepala sperma, sedangkan pecahan yang lebih kecil dari DNA bermigrasi keluar untuk mengambil bentuk komet (Morris et al, 2002).
f. Sperm chromatin Structure Assay (SCSA) mengukur kerentanan DNA situ terhadap asam yang menginduksi transisi kumparan heliks konformasi terhadap pewarnaan fluoresensi AO dengan menggunakan flow cytometry untuk mencari pergeseran metachromatic fluoresensi hijau (DNA asli) menjadi fluoresensi merah(DNA yang terdenaturasi) sebagai perubahan struktur kromatin yang termasuk kemungkinan adanya fragmentasi DNA, denaturasi protein yang memungkinkan denaturasi DNA (Apedaile, 2004). g. Fluoresece in situ Hibridization (FISH) Assay. Kemasan kromatin sperma
abnormal meningkatkan aksesibilitas ligan DNA dan sensitivitas denaturasi DNA oleh alkali dan ini berkaitan dengan adanya pelabelan intens (fluoresensi merah) oleh FISH (Fernandez et al, 1998).
h. 8-hidroksi-2-deoxyguanosine level assay, uji yang mewakili biomarker kerusakan DNA oksidatif menggunakan kromatografi cairan berkinerja tinggi (Shen dan Ong, 2000).
i. Sperma Kromatin Dispersi (SCD) assay, dasar teknologi terletak pada respon yang berbeda yang ditawarkan oleh inti sperma dengan DNA terfragmentasi dibandingkan dengan mereka yang utuh. Denaturasi dikendalikan dari DNA diikuti oleh ekstraksi protein nukleus menimbulkan nucleoids yang terdeproteiniisasi sebagian di mana untai DNA akan melebar , membentuk lingkaran cahaya dari dispersi kromatin dan nukleotida sperma yang terfragmentasi tidak akan membentuk atau sedikit halo. Tes ini juga disebut sebagai tes halosperm (Evenson et al, 2005; Fernandez et al, 2005).
2.4 Hiperhomosisteinemia
