TINJAUAN PUSTAKA
3.6 Metode dan Prosedur Laboratorium .1 Pengambilan sampel .1 Pengambilan sampel
3.6.1.1 Pengumpulan data
Pengumpulan data dilakukan dengan menggunakan kuesioner, yang dirancang untuk memperoleh informasi mengenai data karakteristik dan demografis (usia, BMI, agama, pekerjaan, pendidikan, status perkawinan), status kesuburan ( lama perkawinan, jumlah anak, riwayat keguguran), Status seksual (kebiasaan seksual, riwayat penyakit menular seksual, infeksi urogenitalia), dan status kesehatan (riwayat penyakit, riwayat operasi, riwayat pemakaian obat, riwayat radiasi). Temuan diagnostik fisik termasuk tanda-tanda vital, umum dan status lokalisata dengan status genitalia juga dimasukkan dalam kuesioner
3.6.1.2 Metode pengumpulan semen dan prosedur laboratorium untuk pemeriksaan fragmentasi DNA sperma
Semen analisis dan fragmentasi DNA sperma dilakukan di Laboratorium IVF HFC, Divisi Endokrinologi Reproduksi dan Infertilitas, Departemen Ostetri & Ginekologi, Fakultas Kedokteran, USU, Rumah Sakit H. Adam Malik, Medan.
Para peserta penelitian diminta untuk memproduksi sperma untuk analisis semen dan indeks fragmentasi DNA sperma dalam keadaan sebagai berikut:
1. Pasien dipantangkan berhubungan seksual selama 2-5 hari.
4. Sperma harus dianalisa dalam waktu 2 jam setelah diproduksi. 5. Analisis sperma rutin juga sedang dilakukan.
Teknik pengujian fragmentasi DNA sperma dengan menggunakan kit Halosperm:
a. Tahap memasukkan sampel di-gel agarosa mikro.
• Pertahankan suhu larutan lisis (botol C) pada suhu kamar (22 ° C). • Encerkan sampel cairan semen dalam medium kultur atau PBS dengan konsentrasi 5-10 juta per mililiter. Baik sampel segar ataupun beku langsung dari nitrogen cair dapat digunakan.
• Masukkan tabung A mengapung di air dengan batas harus setinggi batas atas tabung, dan biarkan mengapung di air 5 menit pada suhu 90 - 100 ° C, sampai agarosa mencair. Atau, agarosa dapat dicairkan dalam microwave.
• Transfer tabung A, dengan kondisi mengapung ke dalam water bath dipertahankan pada suhu 37 ° C dan biarkan selama 5 menit .
• Tambahkan 60 mikro-liter sampel cairan semen ke dalam tabung A dan campurkan
• Tempatkan slide pada permukaan yang dingin suhu 4 ° C (misalnya, pelat logam atau kaca).
• Setelah slide didinginkan, taruhlah suspensi sel dari tabung A ke slide (permukaan yang ditandai dengan titik merah) dan tutup cover glass kaca, berhati-hati untuk menghindari gelembung udara. Tetesan dengan ukuran 14, 20 atau 59 mikro-liter dianjurkan memakai cover glass sesuai urutan ukuran 18x18mm 24x60mm 22x22mm. Disarankan bahwa slide disimpan dalam posisi horizontal selama seluruh proses.
• Masukkan pelat dingin dengan slide ke dalam kulkas dan tinggalkan sampel menjadi gel selama 5 menit.
b. Pengolahan sperma.
• Siapkan solusi denaturasi. Untuk melakukan hal ini, tambahkan 80 liter mikro-liter dari tabung B dengan 10 mililiter air destillasi, campurkan dan tempatkan di baki inkubasi.
masukkan slide ke dalam larutan denaturasi dalam posisi horizontal, dan tinggalkan untuk inkubasi selama 7 menit pada suhu kamar (22 ° C). • Dengan memakai sarung tangan, mengambil slide dengan bantuan sebuah lanset. Tahan secara horizontal dan tempatkan tetap horizontal, pada nampan inkubasi lain yang berisi 10 ml larutan lisis (tabung C yang dipanaskan). Inkubasi selama 25 menit.
• Ambil slide dan letakkan secara horizontal ke dalam nampan yang berisi air suling yang berlimpah dalam rangka untuk mencuci larutan lisis. Tinggalkan untuk inkubasi selama 5 menit.
• Masukkan slide horizontal ke dalam nampan yang berisi etanol 70% (2 menit), diikuti dengan etanol 90% (2 menit) dan akhirnya, etanol 100% (2 menit).
• Biarkan kering secara alami, setelah dikeringkan, slide diproses dapat disimpan dalam kotak arsip pada suhu kamar, selama berbulan-bulan. c. Pewarnaan sampel.
Pewarnaan dilakukan ketika slide harus divisualisasikan dan dianalisis dengan observasi melalui mikroskop lapangan terang.
• Campur larutan pewarnaan Wright dengan larutan buffer Phospate (1:1 vol / vol) dan endapkan sebagai satu lapisan secara horizontal untuk menutupi mikro- gel kering.
• Biarkan pewarnaan berlangsung selama 4 - 10 menit, tiup sesekali. Cuci pewarnaan yang berlebihan dan cuci di bawah air mengalir dengan lembut dan biarkan kering.
• Jika slide diwarnai berlebihan, maka warna mungkin sebagian dapat di lunturkan dengan mencuci di air yang mengalir berlimpah.
• Hal ini juga mungkin dapat dilakukan untuk menghapus pewarnaan dengan etanol, biarkan kering dan diwarnai lagi.
• Dalam hal pewarnaan terlalu lemah, khususnya di wilayah lingkaran halo dispersi kromatin, memungkinkan untuk kembali diwarnai dengan menggunakan larutan pewarnaan Wright.
• Jika preparat permanen diharapkan, ini dapat menggunakan Eukitt. d. Visualisasi mikroskopik dan klasifikasi inti.
d.1. Analisis visual langsung
deproteinisasi massif, yang terdiri dari dua bagian: inti spermatozoa silhoutte, yang disebut sebagai inti, diposisikan di tengah, dan halo perifer dari kromatin / DNA dispersi. Ekor spermatozoa dapat terlihat.
Awalnya, studi minimal 500 spermatozoa per sampel dianjurkan untuk selanjutnya 200 spermatozoa sudah mencukupi, mengadopsi kriteria berikut:
Gambar 5. Halosperm (Direproduksi dari Teknologi Konsepsi, 2007)
Gambar 6. Normal & Sperma yang berfragmentasi (Direproduksi dari Teknologi Konsepsi, 2007)
Spermatozoa tanpa fragmentasi DNA
• Spermatozoa dengan halo besar: Spermatozoa dimana ketebalan halo sama dengan, atau lebih besar dari ukuran diameter terkecil dari inti (Gambar1). • Spermatozoa dengan halo ukuran menengah : Ketebalan halo berada antara: lebih besar dari 1 / 3 diameter terkecil dari inti dan kurang dari diameter terkecil inti (Gambar 2).
normal
fragmented abnormal
Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Figure 5
Spermatozoa dengan DNA fragmentasi
• Spermatozoa dengan halo kecil: Ketebalan halo sama dengan atau lebih kecil dari 1 / 3 diameter terkecil dari inti. Ini mungkin memiliki bentuk tidak teratur atau bisa dibilang hampir tak terlihat (Gambar 3).
• Spermatozoa tanpa halo (Gambar 4).
• Spermatozoa tanpa halo dan dengan tanda-tanda kerusakan: Mereka yang tidak menunjukkan tanda-tanda halo dan menyajikan inti terpecah menjadi butiran atau menunjukkan pewarnaan sangat lemah (Gambar 5).
• "Lainnya": inti sel yang tidak mirip dengan spermatozoa. Salah satu karakteristik morfologi yang membedakan mereka adalah tidak adanya ekor.
Gambar 7. Pandangan umum lapangan dengan berbagai jenis spermatozoa (Direproduksi dari Teknologi Konsepsi, 2007)
d.2 Slide dibaca oleh dua personel dan hasil dari keduanya dijumlahkan dan kemudian dibagi dua untuk menghindari bias interobserver.
N N f f N f N N f f N f N N
plasma seminalis homosistein
Semen sampel untuk pengujian homosistein cairan semen dikirim ke Laboratorium Prodia.
Metode pengolahan dan prosedur laboratorium sebagai berikut:
a. Sampel semen yang terlikuedasi akan disentrifugasi pada 3000rpm selama 5 menit, plasma seminalis supernatan kemudian dengan hati-hati diambil dan dipindahkan ke tabung Eppendorf.
b. Usahakan tabung tegak setiap saat.
c. Bekukan sampel hanya sekali dan dicampur menyeluruh setelah pencairan.
d. Jangan simpan pada suhu kamar.
e. Tutup erat tutupan tabung dan masukkan ke kulkas spesimen pada suhu 2 sampai 8 °C sampai pengujian.
f. Bekukan sampel pada atau di bawah -20 °C jika sampel tidak diuji dalam waktu 48 jam. Sampel dapat disimpan pada atau di bawah -20°C sampai 13 minggu.
g. Sebelum menempatkan sampel pada sistem ,pastikan bahwa sampel bebas dari partikulat dan gelembung.
h. Uji Centaur ADVIA HCY membutuhkan 20μL sampel untuk penentuan sekali .
i. Taruhlah Sampel pada sistem dan secara otomatis akan berjalan sebagai berikut:
- campurkan 50μL agen reduksi dan inkubasi selama 3 menit pada 37°C.
- Campurkan 50μL reagen enzim dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
- Campurkan 250μL fase padat dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
- Campurkan 100μL reagen lite dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
memulai reaksi chemiluminescent.
- Laporan hasil berdasarkan opsi yang dipilih seperti yang dijelaskan dalam instruksi sistem operasi atau dalam sistem bantuan online.
j. Sistem akan melaporkan dalam ukuran umol / L
3.6.1.4 Metode dan prosedur laboratorium pemeriksaan kadar plasma homosistein paternal
Sampel darah dikirim ke Laboratorium Prodia untuk tes homosistein serum.
Metode pengumpulan darah dan pengujian sebagai berikut:
a. Kumpulkan semua sampel darah dengan memperhatikan pencegahan universal untuk venipuncture.
b. Biarkan sampel serum untuk membeku secara memadai sebelum sentrifugasi
c. Tutup tabung dan tegakkan tabung setiap saat.
d. Bekukan sampel hanya sekali dan dicampur menyeluruh setelah pencairan.
e. Jangan simpan pada suhu kamar.
f. Tutup erat tutupan tabung dan masukkan ke kulkas spesimen pada suhu 2 sampai 8 ° C sampai pengujian.
g. Bekukan sampel pada atau di bawah -20 ° C jika sampel tidak diuji dalam waktu 48 jam. Sampel dapat disimpan pada atau di bawah -20 ° C sampai 13 minggu.
h. Sebelum menempatkan sampel pada system ,pastikan bahwa sampel bebas dari partikulat dan gelembung.
i. Uji Centaur ADVIA HCY membutuhkan 20μL sampel untuk penentuan sekali .
j. Taruhlah Sampel pada sistem dan secara otomatis akan berjalan sebagai berikut
- campurkan 50μL agen reduksi dan inkubasi selama 3 menit pada 37°C.
- Campurkan 50μL reagen enzim dan inkubasi selama 2,5 menit pada
37°C.
- Campurkan 100μL reagen lite dan inkubasi selama 2,5 menit pada 37°C.
- Pisahkan, aspirasi dan cuci cuvettes dengan reagen air . - Campurkan masing-masing 300μL reagen asam dan basa untuk memulai reaksi chemiluminescent.
- Laporan hasil berdasarkan opsi yang dipilih seperti yang dijelaskan dalam instruksi sistem operasi atau dalam sistem bantuan online.
k. Sistem akan melaporkan dalam ukuran umol / L
