DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 4 Hasil analisis beta karoten standar dengan HPLC
139 Lampiran 5 Prosedur analisis nilai biologis a. Analisis kadar pati resisten
Sampel setara 1 gram pati ditambahkan 25 ml buffer posfat 0.08 M pH 6, kemudian ditambahkan 0.2 ml enzim termamil dan diinkubasi (T = 95oC selama t = 30 menit) sambil dilakukan pengadukan setiap 5 menit. Sampel didinginkan hingga suhu ruang, kemudian pH diatur hingga 6.8 dengan larutan NaOH dan tambahkan 125 µl enzim pankreatin. Sampel diinkubasi (T = 40oC selama t = 60 menit), setelah itu dinginkan hingga suhu ruang. Sampel diatur kemabali pH nya hingga 4.5 dengan HCL, kemudian ditambahakan 400µl enzim amiloglukosidase dan diinkubasi (T = 60oC selama t = 30 menit). Sampel disaring, kemudian residu dicuci dengan aquades 2 kali dan aseton:alkohol (1:1) 2 kali. Filtrat dipisahkan, kemudian residu dicuci kembali dengan 100 ml KOH 2 M untuk melarutan pati resisten. Filtrat diatur pH nya dengan HCL, kemudian ditambahkan 100 µl enzim amiloglukosidase dan diinkubasi (T = 60oC selama t = 30 menit). Filtrat diambil 2 ml untuk analisa glukosa dengan metode glukosa oksidase.
Penentuan glukosa dengan metode glukosa oksidase (Rohman dan Sumantri, 2007)
Penentuan glukosa dengan metode glukosa oksidase menggunakan campuran enzim glukosa oksidase sebanyak 0.4 ml (1000 unit/ml) dalam baffer asetat pH 5, peroksidase sebanyak 40 mg, dan odianisidin sebanyak 40 mg. Campuran tersebut dilarutkan dalam 100 ml buffer asetat pH 5
Pembuatan kurva baku
Larutan baku induk (Li) glukosa disiapkan dengan konsentrasi 1mg/mL. Li dibuat seri konsentrasi dengan mengencerkan larutan induk dalam labu takar 100mL hingga diperoleh konsentrasi akhir glukosa sebesar 2;4;6;8; dan 10 mg/100mL. Tiap 2mL larutan tersebut dimasukkan kedalam tabung reaksi (sebagai blanko digunakan 2mL aquades). Larutan tersebut dimasukkan ke dalam penangas air yang dijaga suhunya 30oC selama 5 menit, kemudian masing-masing tabung yang masih dalam penangas air ditambahkan 1mL larutan enzim dan diinkubasi selama 30 menit. Larutan ditambahkan dengan larutan asam sulfat (asam sulfat:air = 1:3). Larutan dikocok dan didinginkan sampai suhu ruang lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540nm. Kurva baku dibuat dengan menghubungkan antara konsentrasi glukosa (x) dengan absorbansi (y).
140 Penentuan glukosa pada sampel
Sampel ditimbang dan dilarukan secukupnya hingga mengandung glukosa antara 2.5-9 mg/100mL aquades. Sampel sebanyak 2mL dimasukkan kedalam tabung reaksi lalu dimasukkan dalam penangas air yang dijaga suhunya pada 30oC selama 5 menit. Tabung yang masih dalam penangas air ditambahkan 1mL larutan enzim dan diinkubasi selama 30 menit. Larutan ditambahkan dengan larutan asam sulfat (asam sulfat:air = 1:3). Larutan dikocok dan didinginkan sampai suhu ruang lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540nm. Kadar glukosa dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah di peroleh di atas.
Pati resisten = kadar glukosa (mg) x 0.9
b. Analisis kadar serat pangan
Pengukuran serat pangan dibagi menjadi tiga tahap yaitu persiapan sampel, pengukuran serat pangan tidak larut, dan pengukuran serat pangan larut. Persiapan sampel
Sampel yang telah diekstraksi lemaknya ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan kedalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan larutan buffer. Sampel ditambahkan 100 μl termamyl lalu dipanaskan sambil ditutup dan diinkubasi (T = 100oC selama t = 15 menit) sambil sesekali diaduk. Sampel didinginkan kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ditambahkan HCl 4 M hingga pH 1,5. Sampel ditambahkan 100 mg pepsin, lalu erlenmeyer ditutup dan ditempatkan pada suhu 40 oC sambil diaduk selama 60 menit, kemudian sampel ditambahkan 20 ml akuades dan diatur pH-nya hingga 6,8 dengan cara ditambahkan NaOH. Sampel ditambahkan enzim pankreatin, lalu erlenmeyer ditutup dan diinkubasi pada suhu 40 oC selama 60 menit sambil diaduk, kemudian sampel ditambahkan HCl kembali hingga pH 4,5. Sampel disaring melalui, kemudian endapan dicuci dengan 10 ml akuades sebanyak dua kali.
Pengukuran serat makanan tidak larut
Residu dari hasil persiapan sampel dicuci dengan 10 ml etanol 95 % sebanyak 2 kali, dan 10 ml aseton sebanyak dua kali. Residu dikeringkan pada suhu 105 oC hingga diperoleh berat yang tetap, kemudian dimasukkan kedalam
141
desikator dan ditimbang (D1). Suensi yang telah kering diabukan dengan suhu 500 oC selama 5 jam, didinginkan, dimasukkan dalam desikator dan ditimbang (L1).
Pengukuran serat makanan larut
Volume dari filtrat yang didapat dari persiapan sampel ditambahkan akuades hingga 100 ml. Filtrat ditambahkan etanol 95 % dengan suhu 60 oC sebanyak 400 ml, kemudian diendapkan selama 1 jam. Filtrat disaring, kemudian dicuci dengan 10 ml etanol 95 % dan 10 ml aseton sebanyak dua kali. Sampel dikeringkan pada suhu 105 oC selama 24 jam, kemudian dimasukkan kedalam desikator dan ditimbang (D2). Sampel yang telah kering diabukan dengan suhu 500 oC selama 5 jam, didinginkan, dimasukkan dalam desikator dan ditimbang (L2).
Penetapan blanko
Analisis ini menggunakan blanko yang diperoleh dengan cara yang sama tetapi tanpa adanya sampel (akuades). Nilai blanko harus diperiksa ulang terutama jika menggunakan enzim dari kemasan yang baru.
Total serat makanan
Total serat makanan diperoleh dengan menjumlahkan serat makanan larut dan tidak larut.
Perhitungan
% (bk) serat pangan tidak larut = D1 – L1 – B1 x 100% W
% (bk) serat pangan larut = D2 – L2 – B2 x 100% W
Total serat makanan = nilai serat pangan larut + nilai serat pangan tidak larut
Keterangan : Angka 1 menunjukkan berat sampel pada analisis serat pangan larut dan angka 2 menunjukkan berat sampel pada analisis serat pangan tidak larut.
W = Berat sampel (g)
B = Berat blanko bebas serat (g)
D = Berat setelah analisis dan dikeringkan (g) L = Berat setelah diabukan (g)
c. Analisis daya cerna pati
Suspensi sampel dibuat sebanyak 1% berdasarkan kadar pati. Sampel dipanaskan pada suhu 90oC selama 30 menit, kemudian didinginkan. Sampel
142
dipipet sebanyak 2 ml kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 3 ml aquades dan 5 ml buffer fosfat 0,1M pH 7. Inkubasi pada suhu 37oC selama 15
menit. Sampel ditambahkan 5 ml larutan α-amilase dan inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Sampel dipipet sebanyak 1 ml dan ditambahkan 2 ml laruran DNS, kemudian dipanaskan pada suhu 100oC selama 10 menit. Warna oranye – merah yang terbentuk dari campuran reaksi diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm.
Daya cerna pati (%) = Kadar maltosa sampel x 100 Kadar matosa pati
d. Analisis Daya cerna protein
Pengukuran daya cerna protein dengan teknik multienzim dilakukan dengan mempersiapkan preaksi, kemudian melakukan pengukuran daya cerna protein. Nilai pH pada menit ke-10 dicatat untuk menghitung daya cerna protein sampel menggunakan persamaan regresi Y = 210.464 – 18.103 X. Pengukuran pH dilakukan pada menit ke-10 karena menurut Hsu et al (1997) dalam Muchtadi et al (1992), pH suspensi protein pada menit ke-10 setelah dihidrolisis dengan larutan multienzim berkolerasi baik dengan daya cerna protein yang ditetapkan secara biologis menggunakan tikus.
Persiapan preaksi Larutan HCL 0.1 N. Larutan NaOH 0.1 N.
Larutan multienzim dalam aquades: campuran 1.6 mg tripsin; 3.1 mg kimotripsin; dan 1.3 mg peptidase per ml. Larutan enzim dibuat secukupnya, kemudian ditempatkan pada ice bath dan diatur pH-nya menjadi 8 dengan larutan NaOH atau HCL 0.1 N.
Prosedur
Sampel disuspensikan dalam aquades sampai diperoleh konsentrasi 6.25 mg protein/ml. Sebanyak 50 ml suspensi sampel ditempatkan pada gelas piala dan diatur pH-nya menjadi 8 dengan menambahkan larutan NaOH atau HCL 0.1 N. Sampel diletakan dalam penangas air bersuhu 37oC selama 5 menit sambil diaduk. Larutan multienzim sebanyak 5 ml ditambahkan ke dalam sampel, kemudian ukur
143
pH-nya setelah 10 menit. Daya cerna protein sampel diukur dengan rumus sebagai berikut:
Y = 210.464 – 18.103 x
144
Lampiran 6 Perhitungan jumlah sampel yang diberikan untuk pengukuran