OYDV PADA BAWANG MERAH Abstract
3.3 Hasil dan Pembahasan
Pertumbuhan awal meristem tip pada 1 MST menunjukkan adanya respon pertumbuhan berupa pemanjangan primordia daun dan pembengkakan pada bagian cakram umbi (basal plate).Keberhasilan tumbuh eksplan dilihat dari kemampuan eksplan untuk tumbuh dan membentuk daun. Persentase tumbuh eksplan Bima Brebes yang paling tinggi diperoleh dari perlakuan kinetin (M4) serta kombinasi 2- ip dan IAA (M5), dengan persentase tumbuh yang mencapai 100% (Gambar 4). Sementara itu, persentase tumbuh eksplan yang paling rendah (58%) terdapat pada perlakuan GA3 (M3) serta kombinasi kinetin dan IAA (M7). Persentase eksplan
tumbuh yang paling tinggi pada Tiron yaitu 91% terdapat pada perlakuan BAP (M2) dan kombinasi kinetin dengan IAA (M7).
Rata-rata persentase eksplan Bima Brebes dan Tiron yang mengalami gagal tumbuh masing-masing sebesar 19% dan 28%. Kegagalan pertumbuhan eksplan yang diisolasi dari meristem tip (0.6 - 1.0 mm) bawang putih sebesar 29% juga dilaporkan Verbeek et al. (1995). Gagalnya eksplan yang tumbuh tidak disebabkan oleh media, akan tetapi dipengaruhi oleh kontaminasi, perlukaan akibat isolasi eksplan, maupun akibat proses sterilisasi.
Eksplan yang tumbuh rata-rata mulai terbentuk daun pada 1 hingga 2 MST (Tabel 5). Waktu munculnya daun yang paling cepat terlihat pada eksplan Tiron yang dikulturkan pada media tanpa ZPT (kurang dari 2 minggu). Pembentukan daun dapat dipengaruhi oleh aktivitas sitokinin dalam menginduksi pembelahan sel. Eksplan meristem tip yang dikulturkan diduga memiliki sitokinin endogen yang cukup untuk dapat menginduksi pembelahan sel dan menginisiasi pembentukan daun pada meristem. Sementara itu, eksplan yang mengalami defisiensi sitokinin saat pertumbuhan meristem akan memberikan pengaruh yang sebaliknya dan menyebabkan terhentinya diferensiasi sel daun (Werner et al. 2003).
Eksplan Bima Brebes berhasil tumbuh dan dapat membentuk daun, sedangkan persentase berdaun eksplan Tiron 13% lebih rendah dari Bima Brebes (Gambar 5). Analisis statistik terhadap kultivar Tiron menunjukkan bahwa perlakuan ZPT tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap persentase eksplan berdaun.
Gambar 4 Persentase eksplan tumbuh dua kultivar bawang merah pada 3 MST.
0 20 40 60 80 100 120 140 M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 E k sp lan tu m b u h ( %) Media
Bima Brebes Tiron M0 = Kontrol
M1 = 0.25 mg L-1 2-ip M2 = 0.25 mg L-1 BAP M3 = 0.25 mg L-1 GA 3 M4 = 0.25 mg L-1 kinetin M5 = 0.25 mg L-1 2-ip + 0.1 mg L-1 IAA M6 = 0.25 mg L-1 BAP + 0.1 mg L-1 IAA M7 = 0.25 mg L-1 kinetin + 0.1 mg L-1 IAA
18
Selama tiga minggu pengamatan ditemukan eksplan dengan morfologi yang tidak normal seperti vitrifikasi maupun klorosis pada cv. Tiron. Persentase eksplan abnormal antara 0 - 22%. (Gambar 5). Sebagian besar eksplan mengalami vitrifikasi atau disebut juga dengan hyperhidricity mempelihatkan morfologi daun yang tembus cahaya. Eksplan cenderung mengalami pertumbuhan yang lambat dan bahkan tidak mampu bertahan hidup. Wu et al. (2009) menyatakan bahwa tanaman yang mengalami hyperhydric memiliki kandungan air yang lebih tinggi, sehingga menyebabkan kandungan oksigen, protein dan klorofil pada tanaman rendah.
Respon pertumbuhan eksplan Bima Brebes dan Tiron terhadap perlakuan media menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata pada jumlah daun dan jumlah tunas. Perlakuan memberikan pengaruh yang nyata pada tinggi tunas cv. Tiron yang ditunjukkan pada Tabel 6. Eksplan yang dikulturkan pada media tanpa ZPT (kontrol) memiliki tinggi tunas yang nyata lebih tinggi dibandingkan dengan eksplan pada media yang mengandung 2-ip + IAA dan BAP + IAA, namun tinggi tunas eksplan kontrol tidak berbeda nyata dengan eksplan yang dikulturkan pada media yang diberi 2-ip, BAP, GA3, kinetin, dan kombinasi kinetin + IAA. Gull et al. (2014) melaporkan bahwa meristem tip bawang putih yang dikulturkan pada MS tanpa ZPT tetap dapat tumbuh dan membentuk tunas. Haque et al. (2003) juga melaporkan bahwa eksplan memperlihatkan pertumbuhan yang lebih baik dan tingkat regenerasi tunas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekspan yang dikulturkan pada media yang mengandung ZPT. Bhojwani dan Dantu (2013)
Gambar 5 Persentase eksplan berdaun dan abnormal pada eksplan bawang merah cv. Bima Brebes dan Tiron.
0 20 40 60 80 100 M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 E k sp lan b er d au n d an ab n o rm al (%) Media
Eksplan berdaun (Bima Brebes) Eksplan berdaun (Tiron) Eksplan abnormal (Tiron) M0 = Kontrol M1 = 0.25 mg L-1 2-ip M2 = 0.25 mg L-1 BAP M3 = 0.25 mg L-1 GA 3 M4 = 0.25 mg L-1 kinetin M5 = 0.25 mg L-1 2-ip + 0.1 mg L-1 IAA M6 = 0.25 mg L-1 BAP + 0.1 mg L-1 IAA M7 = 0.25 mg L-1 kinetin + 0.1 mg L-1 IAA
Tabel 5 Waktu muncul daun pada eksplan bawang merah cv. Bima Brebes dan Tiron.
No. Media Waktu muncul daun (MST)
*) Bima brebes Tiron
1 Kontrol 1.67 ± 0.33 1.33 ± 0.58 2 0.25 mg L-1 2-ip 1.67 ± 0.38 2.17 ± 0.29 3 0.25 mg L-1 BAP 1.89 ± 0.19 2.08 ± 0.14 4 0.25 mg L-1 GA3 1.67 ± 0.58 1.67 ± 0.58 5 0.25 mg L-1 kinetin 1.92 ± 0.14 1.75 ± 0.35 6 0.25 mg L-1 2-ip + 0.1 mg L-1 IAA 2.08 ± 0.52 2.00 ± 0.00 7 0.25 mg L-1 BAP + 0.1 mg L-1 IAA 1.92 ± 0.14 1.75 ± 0.35 8 0.25 mg L-1 kinetin + 0.1 mg L-1 IAA 1.67 ± 0.58 2.00 ± 0.00 Keterangan : MST (minggu setelah tanam); *)data merupakan rataan dan standar deviasi.
19 menyatakan eksplan dapat tumbuh dan berkembang menjadi planlet disebabkan oleh meristem tip memiliki 1 - 2 primordia daun yang dapat mensuplai auksin dan sitokinin untuk mendukung pertumbuhan eksplan yang normal.
Tinggi tunas Bima Brebes pada semua perlakuan ZPT tidak berbeda nyata. Penambahan IAA dalam kombinasi ZPT diperkirakan dapat menghambat pemanjangan tunas (Tabel 6). Ma et al. (1994) menyatakan bahwa pemberian auksin dengan konsentrasi rendah pada kombinasi auksin-sitokinin pada bawang putih dapat mendukung pertumbuhan tunas, akan tetapi menyebabkan tunas menjadi pendek dan tebal.
Eksplan yang diberi perlakuan media dengan komposisi ZPT yang berbeda mampu menginduksi pertumbuhan tunas utama tanpa diikuti proses pembentukan kalus. Ashnayi et al. (2012) melaporkan bahwa aplikasi GA3 0.5 mg L-1 pada kultur meristem tip tanaman anyelirdapat mempercepat pertumbuhan tunas dan tunas yang dihasilkan tumbuh normal tanpa disertai multiplikasi, diduga karena konsentrasi ZPT yang diberikan cukup rendah. Menurut Gull et al. (2014), aplikasi sitokinin berpotensi menginduksi multiplikasi tunas pada konsentrasi 0.5 mg L-1.
Eksplan Bima Brebes yang dikulturkan pada media perlakuan memperlihatkan pertumbuhan akar yang tidak merata (Gambar 6). Pembentukan akar terlihat pada eksplan yang diberi sitokinin dan GA3 (M1-M4), begitu juga
dengan kombinasi kinetin + IAA (M7). Hal yang sama juga dilaporkan oleh Gull et al. (2014), bahwa akar pada planlet bawang putih terbentuk pada MS yang mengandung sitokinin dan bahkan dilaporkan bahwa kombinsi kinetin dan IAA memiliki respon yang paling baik. GadEl-Hak et al. (2011) menambahkan bahwa kombinasi tersebut dapat meningkatkan jumlah akar per eksplan. Hal yang sebaliknya didapat dari penelitian ini, bahwa eksplan yang dikulturkan pada media tanpa ZPT (M0) memperlihatkan persentase berakar yang paling tinggi
Tabel 6 Respon eksplan (meristem tip) bawang merah cv. Bima Brebes dan Tiron terhadap perlakuan ZPT.
No. ZPT
Bima Brebes Tiron
Jumlah tunas Jumlah daun (Helai) Tinggi tunas (cm) Jumlah tunas Jumlah daun (Helai) Tinggi tunas (cm)*) 1 Kontrol 0.89 2.11 2.46 0.56 1.89 1.58 a 2 0.25 mg L-1 2-ip 0.67 1.75 2.18 0.81 1.67 1.32 ab 3 0.25 mg L-1 BAP 0.89 2.22 2.11 1.00 2.14 1.23 ab 4 0.25 mg L-1 GA3 0.67 1.75 2.74 0.67 1.83 1.20 ab 5 0.25 mg L-1 Kinetin 0.83 2.00 2.68 0.75 1.88 1.45 a 6 0.25 mg L-1 2ip + 0.1 mgL-1 IAA 0.75 2.00 1.73 0.67 1.50 0.68 bc 7 0.25 mg L-1 BAP + 0.1 mg L-1 IAA 0.83 2.17 1.43 0.83 1.33 0.56 c 8 0.25 mg L-1 kinetin +0.1 mg L-1 IAA 0.72 1.89 1.97 0.64 1.47 0.86 abc Uji F tn tn tn tn tn *
Keterangan : tn = tidak berbeda nyata, * = berbeda nyata pada taraf α 5%, *)angka yang diikuti huruf kecil yang sama pada kolom yang sama artinya tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf α 0.05.
20
dibandingkan dengan media lainnya. Sementara itu, Tiron memperlihatkan respon yang berbeda, pembentukan akar tidak terlihat selama 3 minggu pengamatan.
Sitokinin dan auksin merupakan hormon yang aktivitasnya dapat mempengaruhi perkembangan akar (Gaba 2005). Aktivitas sitokinin selama perkembangan awal primordia daun dapat menghambat pertumbuhan akar (Werner et al. 2003) karena menekan produksi auksin. Namun selama perkembangan primordia daun dan tunas menyebabkan auksin terakumulasi (Aloni et al. 2003). Auksin selanjutnya menginduksi pembentukan dan pemanjangan akar (Gaba 2005). Pembentukan akar pada eksplan bawang merah yang dikulturkan pada media M0 diduga karena konsentrasi auksin endogen eksplan cukup tinggi pada Bima Brebes.
3.3.1 Aklimatisasi
Aklimatisasi planlet umbi mikro dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya ukuran umbi mikro, media, dan wadah tanam, pencahayaan serta intensitas penyiraman. Planlet yang berbentuk umbi mikro memiliki tingkat persentase keberhasilan aklimatisasi yang cukup tinggi, seperti yang dinyatakan oleh Dinarti (2012), sehingga pada penelitian ini planlet yang diaklimatisasi dalam bentuk umbi mikro. Ukuran umbi mikro yang besar cenderung akan menghasilkan diameter daun yang besar, begitu juga sebaliknya.
Busuk pada bagian pangkal batang dan umbi mikro merupakan hal yang sering terjadi saat aklimatisasi. Umbi mikro dan pangkal batang rentan dengan kondisi penanaman yang terlalu lembab, karena dapat memicu terjadinya kebusukan. Kondisi yang demikian dapat dihindari dengan mengatur intesitas penyiraman, yang dapat dilakukan 2 - 3 hari sekali. Penyiraman dapat dilakukan seperlunya tanpa membuat kondisi media tanam terlalu lembab. Tanaman aklimatisasi juga membutuhkan cahaya matahari agar dapat tumbuh dengan baik dan berfotosintesis. Penanaman dapat dilakukan di dalam kotak kasa dengan kondisi pencahayaan matahari secara tidak langsung atau ternaungi.
Planlet umbi mikro Bima Brebes dan Tiron yang diaklimatisasi masing- masing berjumlah 20 dan 10. Keberhasilan aklimatisasi planlet umbi mikro pada penelitian ini cukup baik. Tingkat keberhasilan tumbuh planlet Tiron pada minggu pertama dan kedua mencapai 100%, sementara itu planlet Bima Brebes pada minggu pertama keberhasilannya 90% dan minggu kedua menurun menjadi 85% (Gambar 7).
Gambar 6 Persentase planlet berakar pada bawang merah cv. Bima Brebes.
47.2 16.7 22.2 16.7 33.3 0.0 0.0 22.2 0 20 40 60 80 M0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 P lan let b er ak ar ( %) Media M0 = Kontrol M1 = 0.25 mg L-1 2-ip M2 = 0.25 mg L-1 BAP M3 = 0.25 mg L-1 GA 3 M4 = 0.25 mg L-1 kinetin M5 = 0.25 mg L-1 2-ip + 0.1 mg L-1 IAA M6 = 0.25 mg L-1 BAP + 0.1 mg L-1 IAA M7 = 0.25 mg L-1 kinetin + 0.1 mg L-1 IAA
21
3.3.2 Deteksi Virus
Pengujian awal virus menggunakan metode DIBA bertujuan untuk mengetahui persentase sampel tanaman yang terinfeksi. Hasil pendeteksian virus terhadap sampel daun bawang merah cv. Tiron yang ditanam menggunakan metode growing on test menunjukkan bahwa infeksi virus OYDV 100% (Gambar 8). Pendeteksian awal pada penelitian ini tidak dilakukan pada Bima Brebes, karena kultivar ini diasumsikan telah terinfeksi OYDV dengan persentase yang tinggi (100%) berdasarkan hasil deteksi yang dilaporkan Wulandari (2016).
Hasil deteksi virus terhadap sampel daun bawang merah cv. Tiron menunjukkan bahwa infeksi virus OYDV mencapai 100%. Deteksi virus terhadap tanaman hasil kultur in vitro menggunakan RT-PCR dikarenakan memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi, sehingga dapat mendeteksi jaringan tanaman dengan konsentrasi virus yang sedikit. Hasil RT-PCR tanaman yang terinfeksi oleh OYDV ditunjukkan oleh amplifikasi pita yang panjangnya 601 bp. Sampel daun yang digunakan untuk deteksi virus berasal dari tanaman kultur in vitro yang telah diaklimatisasi. Pendeteksian virus dilakukan pada cv. Bima Brebes dan Tiron dan setiap kultivar diambil tiga sampel daun komposit, yang masing-masing komposit mewakili 3 tanaman. Hasil deteksi memperlihatkan adanya pita DNA pada sampel yang dianalisis (Gambar 9), yang mengindikasikan adanya virus OYDV.
Hasil ini menunjukkan bahwa metode kultur meristem tip masih belum dapat mengeliminasi virus OYDV pada cv. Bima Brebes maupun Tiron, bagian meristem tip yang digunakan pada penelitian ini diduga masih mengandung virus. Ayabe dan Sumi (2001) menyatakan bahwa virus yang telah menginfeksi sel dapat menyebar ke sel lainnya melalui plasmodesmata, seperti yang dilaporkan oleh
Gambar 7 Kondisi aklimatisasi umbi mikro bawang merah di dalam kotak kasa (kiri) dan persentase tumbuh umbi mikro selama dua minggu aklimatisasi (kanan). 0 20 40 60 80 100 1 MSA 2 MSA T an am an h id u p ( %)
Minggu setelah aklimatisasi Bima Brebes Tiron
Gambar 8 Hasil deteksi awal sampel bawang merah cv. Tiron dengan metode DIBA. B (buffer); P (kontrol positif); N (kontrol negatif); 1 - 6 (sampel daun).
22
Pramesh dan Baranwal (2015). Wang et al. (2008) menyatakan bahwa virus tidak terdeteksi pada sel muda yang belum mengalami diferensiasi yang terdapat pada kubah apikal, sedangkan pada sel yang lebih berkembang telah memiliki plasmodesmata. Namun, Taşkin et al. (2013) melaporkan bahwa 100% tanaman bawang putih bebas virus berhasil diperoleh melalui kultur meristem tip.
Keberhasilan eliminasi virus dipengaruhi oleh beberapa hal, seperti ukuran meristem tip (Verbeek et al. 1995; Ashnayi et al. 2012; Hu et al. 2012), konsentrasi virus di dalam jaringan tanaman (Pramesh dan Baranwal 2015), genotipe tanaman, metode eliminasi (Bhojwani dan Dantu 2013), dan jenis ZPT yang digunakan pada kultur in vitro (Ashnayi et al. 2012). Oleh karena itu, efisiensi eliminasi virus menggunakan kultur meristem tip dapat ditingkatkan dengan mengkombinasikan beberapa metode, agar dapat mengeliminasi OYDV secara efektif pada tanaman yang terinfeksi.
3.4 Kesimpulan
Media tanpa penambahan ZPT merupakan media yang paling efisien untuk pertumbuhan tunas meristem tip. Tunas utama yang tumbuh tanpa disertai pembentukan kalus. Hasil analisis RT-PCR menunjukkan bahwa seluruh sampel yang dideteksi masih terinfeksi virus OYDV. Hal ini menunjukkan bahwa kultur meristem tip belum dapat mengeliminasi virus OYDV, sehingga metode kultur meristem tip perlu dikombinasikan dengan metode lainnya agar dapat mengeliminasi virus secara efektif.
Gambar 9 Amplifikasi fragmen DNA sampel bawang merah dengan RT-PCR menggunakan spesifik primer OYDV. M (1 kb DNA Ladder); P (kontrol positif); N (kontrol negatif); 1 - 3 (sampel komposit hasil kultur meristem tip).
23