Amplifikasi Virus Hepatitis B Regio Pre-S1
Hasil amplifikasi dari9 sampel DNA owa jawa yang telah berstatus serologis positif terhadap antigen virus hepatitis B menggunakan pasangan primer hepSF-1 dan hepSR-out menghasilkan fragmen pita DNA sekitar 459 pasang basa (Tabel 3). Hal ini menunjukkan bahwa ke-9 individu owa jawa tersebut terinfeksi dengan virus hepatitis B (VHB).
Tabel 3 Hasil pemeriksaan serologis HbsAg (data sekunder) dan hasil PCR atas regio Pre-S1 dari virus hepatitis B pada owa jawa
No. ID HBsAg Hasil PCR VHB
regio pre-S1 Tempat Asal Satwa 1 A1 Positif Positif A 2 A2 Positif Positif A 3 A3 Positif Positif A 4 A5 Positif Positif A 5 A6 Positif Positif A 6 A8 Positif Positif A 7 A9 Positif Positif A 8 C1 Positif Positif B 9 C2 Positif Positif B
Sebagai pembanding dalam amplifikasi digunakan kontrol positif yang berasal dari pasien manusia dan orangutan penderita hepatitis B. Gambar 4 dan 5 menunjukkan hasil amplifikasi virus hepatitis B gibbon yang dilalukan pada gel agarosa menggunakan elektroforesis horizontal. Pada kontrol positif pasien manusia, terlihat bahwa pita DNA isolat VHB manusia berada di atas pita DNA dari isolat kontrol positif DNA VHB orangutan maupun sampel penelitian. Posisi pita isolat kontrol positif VHB orangutan berada di antara pita isolat VHB sampel dan kontrol positif VHB manusia. Hasil PCR memperlihatkan bahwa ketujuh (Gambar 4) dan kedua (Gambar 5) sampel DNA owa jawa teramplifikasi dengan baik menggunakan pasangan primer untuk regio pre-S1 VHB dengan ukuran sekitar 459 pasang basa.
Gambar 4 Visualisasi PCR VHB Regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies owa jawa pada lokasi A. (1)Penanda DNA 1kpb, (2) isolat A1, (3) A2, (4) A3, (5) A5, (6) A6, (7) A8, (8) A9, (9) kontrol positif VHBGi, (10) kontrol positif VHBHu, (11) kontrol positif VHBOu
100 pb 300 pb 200 pb 400 pb 500 pb 1 2 3 4 5 6 459 pb
Gambar 5 Visualisasi PCR VHB Regio Pre-S1 yang menginfeksi spesies owa jawa pada lokasi B.(1) marker DNA 1kbp, (2) isolat C1, (3) C2, (4) kontrol positif VHBHu, (5) kontrol positif VHBOu1 dan (6) kontrol positif VHBOu2.
Menurut Warren et.al (1999), dengan menggunakan pasangan primer hepSF-1 dan hepSR-out, akan menghasilkan amplikon VHB Regio Pre-S1 sebesar 455 pasang basa. Jika mengacu pada hasil sekuensing beberapa sampel yang
3 4 6 1 9 10 1 2 3 5 7 8 11 12 300 200 100 500 pb 459 pb
dilakukan di Macrogen (Korea), didapatkan bahwa besar masing-masing amplikon berbeda-beda (Tabel 4). Dengan melakukan pensejajaran sekuens terhadap semua sekuens isolat sampel VHB menggunakan program ClustalW2 (Larkin MA, et al. 2007) terlihat adanya keragaman pada besar amplikon, hal ini mungkin disebabkan adanya insersi ataupun delesi nukleotida dari masing-masing produk PCR. Data sekuen isolat VHB bervariasi antara 457pb, 458pb dan 459 pb, berbeda dengan target produk yang diharapkan sebesar 455pb.
Tabel 4 Data sekuens produk PCR VHBGi regio Pre-S1 dan situs pemotongan dari enzim restriksi BSt2UI
ID Besar amplikon Hasil Pemotongan Situs Pemotongan Posisi Situs Pemotongan (nukleotida ke-) Besar Fragmen A1 459 1 situs CCAGG 198 198pb 261pb A6 459 1 situs CCAGG 198 198pb 261pb C2 459 1 situs CCAGG 198 198pb 261pb C1 459 3 situs CCTGG CCAGG 68 198 68pb 130pb 261pb A2 459 3 situs CCTGG CCAGG 157 198 406 157pb 41pb 208pb 53pb A3 458 3 situs CCTGG CCAGG 157 198 406 157pb 41pb 208pb 52pb A5 458 3 situs CCTGG CCAGG 157 198 406 157pb 41pb 208pb 52pb A8 457 3 situs CCTGG CCAGG 157 198 406 157pb 41pb 208pb 51pb A9 457 3 situs CCTGG CCAGG 157 198 406 157pb 41pb 208pb 51pb
Restriction Fragment Length Polymorphism
Pemotongan produk PCR regio Pre-S1 dari VHB menggunakan enzim restriksi Bst2UI menghasilkan fragmentasi produk PCR dengan situs pemotongan tertentu (CCA/TGG) sehingga dapat diidentifikasi isolat virus hepatitis B dari
spesies tertentu. Hasil potongan enzim restriksi (Gambar 6 dan 7) memperlihatkan bahwa pada 9 isolat owa jawa terjadi fragmentasi DNA, demikian pula pada kontrol positif VHB gibbon dan orangutan. Namun pada kontrol VHB manusia tidak terjadi pemotongan regio Pre-S1.
10 11 500 pb 300 pb 200 pb 100 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 261 pb 208 pb 198 pb 157 pb 8 6 (a) (b) (c)
Gambar 6 Visualisasi produk DNA menggunakan enzim restriksi BSt2UI. (a). Baris 1(penanda DNA 1kpb Invitrogen, USA), Baris 2-8 (isolat hasil studi), Baris 9 kontrol positif VHBGi, Baris 10 kontrol positif VHBHu, Baris 11 kontrol positif VHBOu1, Baris 12 kontrol positif VHBOu2. (b). Isolat A6. (c). Isolat A9
Gambar 6a memperlihatkan adanya keragaman posisi pemotongan produk PCR regio Pre-S1 VHB yang diisolasi. Sampel A1 dan A6, selanjutnya dikelompokkan sebagai kelompok I, memperlihatkan posisi pemotongan yang hampir sama dengan kontrol positif VHB regio Pre-S1orangutan. Sedangkan sampel A2, A3, A5, A8 dan A9, selanjutnya dikelompokkan sebagai kelompok II, mempunyai posisi pemotongan yang berbeda dengan kontrol positif VHB regio pre-S1gibbon maupun orangutan. Kelompok I terlihat terpotong menjadi 2 fragmen yaitu 198 pb dan 261 (Gambar 6b), pada kelompok II juga terlihat
terpotong menjadi 2 fragmen namun dengan besar fragmen yang berbeda dengan kelompok I yaitu 208 pb dan 157 pb (Gambar 6c).
Dengan menggunakan enzim restriksi yang sama untuk isolat C1 dan C2, terlihat pula pola pemotongan yang berbeda untuk kedua isolat tersebut (Gambar 7). Isolat C2 mempunyai gambaran pemotongan yang mirip dengan isolat kontrol positif VHBOu dengan besar 261 pb dan 198 pb. Isolat C1 pada hasil elektroforesis RFLP hanya terlihat satu pita tebal (261 pb) dan satu pita tipis (130 pb). 500 pb 200 pb 400 pb 300 pb 100 pb 261 pb 130 pb 198 pb 2 1 3 4 5 6
Gambar 7 Visualisasi pemotongan produk DNA menggunakan enzim restriksi BSt2UI. (1) Penanda DNA sebesar 100pb, (2) isolat C1, (3) C2, (4) kontrol positif VHBOu1, (5) kontrol positif VHBOu2, (6) kontrol positif VHBHu
Data sekuen nukleotida VHBGi regio Pre-S1 yang ditampilkan pada tabel 3 juga memperlihatkan bahwa ke-9 isolat VHBGi hasil studi mempunyai jumlah dan posisi situs pemotongan yang berbeda, sehingga dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok. Isolat A1, A6 dan C2, hanya mempunyai satu situs pemotongan yaitu pada nukleotida ke 198 sehingga produk PCR ketiga isolat tersebut terfragmentasi menjadi dua fragmen. Besar fragmen yang dihasilkan
adalah 198 pb dan 261 pb. Isolat C1 mempunyai 2 situs pemotongan yaitu pada nukleotida ke 68 dan 198, dengan besar fragmen 68 pb, 130 pb dan 261 pb.
Produk PCR isolat A2, A3, A5, A8 dan A9 mempunyai 3 situs pemotongan dan terfragmentasi menjadi 4 fragmen. Hasil pemotongan pada kelima isolat tersebut berada pada situs nukleotida ke 157, 198 dan 406. Besar fragmen yang terbentuk adalah 157 pb, 41 pb, 208 pb dan 53 pb. Hasil elektroforesis RFLP (Gambar 6a) tidak terlihat dua fragmen terkecil dari kelompok ini (41 pb dan 53 pb). Hal ini disebabkan karena dua fragmen tersebut mempunyai ukuran di bawah 100 pb, sehingga dengan menggunakan elektroforesis agarosa diduga mungkin bermigrasi melewati batas bawah gel.
Pembuatan Pohon Filogenetik
Pensejajaran sekuens nukleotida VHBGi regio Pre-S1 untuk membangun pohon filogenetik menggunakan perangkat lunak ClustalW dan Mega (versi 5) dengan menyandingkan data sekuens nukleotida HBVGi Pre-S1 isolat hasil studi. Menggunakan data sekuens nukleotida VHBGi Pre-S1 isolat hasil studi (459 nukleotida) dan hasil pemotongan sekuens menggunakan enzim restriksi BSt2UI dapat dibentuk dua pohon filogenetik.
(a) (b)
Gambar 8 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae berdasarkan (a) sekuens nukleotida VHB regio Pre-S1 (459 pb)
(b) situs pemotongan sekuens nukleotida VHBregio Pre-S1 menggunakan enzim restriksi BsT2UI.
Hubungan kekerabatan virus hepatitis B regio Pre-S1 pada isolat owa jawa hasil studi diperlihatkan pada Gambar 8a. Menggunakan metode rekonstruksi filogeni neighbour-joining dengan model substitusi kimura 2-paramater (MEGA 5, 2011) terbentuk dua cluster besar yang memisahkan isolat-isolat VHBGi Pre- S1 hasil studi. Isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa C2 dan A1 bersama-sama dengan isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa C1 serta A6 membentuk kelompok besar terpisah dari isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A5, A3, A9, A8 dan A2. Dari 459 urutan basa nukleotida didapatkan situs conserved sebanyak 375 (81,6%), situs variable 85 (18,4%), situs singleton 7,2 % dan situs parsim-info sebanyak 11,2%.
Menggunakan situs-situs restriksi yang dihasilkan oleh enzim restriksi BsT2UI pada sekuens nukleotida isolat VHBGi hasil studi (lampiran 2) dapat dibentuk pohon filogeni menggunakan konstruksi unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA, metode tanpa pembobotan). Pada pohon filogenetik yang terbentuk (Gambar 8 b), isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A1, C2, A6, C1 dan A2 membentuk cluster tersendiri, diikuti oleh percabangan yang dibentuk oleh isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A3 dan A5. Cabang terluar dibentuk oleh isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A8 dan A9.
Terdapat perbedaan antara gambar 8a dan 8b yaitu pada gambar 8a isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A2 berada pada cluster yang sama dengan A8 sementara pada gambar 8b isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A2 berada pada percabangan bersama isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa C1, A6, C2 dan A1 terpisah dari isolat VHBGi Pre-S1 owa jawa A8.
Gambar 9 memperlihatkan pohon filogenetik yang menunjukkan hubungan kekerabatan berdasarkan sekuens nukleotida antara isolat VHBGi regio Pre-S1 owa jawa di Indonesia dengan data isolat satwa primata lainnya dari GeneBank. Isolat owa jawa hasil studi membentuk cluster besar tersendiri, terpisah dari cluster isolat Hylobates lar (no. akses HQ603076), orangutan (no. akses AF193864) dan H. pileatus (no. akses AY781187). Hal ini memperlihatkan bahwa virus hepatitis B yang menginfeksi owa jawa berbeda dengan orangutan dan spesies Hylobates lainnya. Di dalam kelompok isolat hasil studi juga terbentuk pengelompokan, kelompok isolat C1, A6, C2 dan A1 berada pada percabangan yang berbeda dengan kelompok isolat A2, A8, A9, A5 dan A3. Isolat
C1 dan A6 mempunyai kekerabatan sekitar 100% demikian pula antara isolat C2 dan A1. Isolat Hylobates agilis terpisah membentuk cluster terluar pada phon filogentik tersebut.
Gambar 9 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae dan orangutan berdasarkan sekuens sekuens nukleotida VHB regio Pre-S1(459 nukleotida).
Data sekuens nukleotida VHB gibbon region Pre-S1 isolat hasil studi (459 bp) dan data isolat dari genBank di atas ditranlasikan ke dalam bentuk sekuens asam amino menggunakan program MEGA (Kumar, et al. 2011).
Gambar 10 Pohon filogenetik VHB Hylobatidae dan orangutan berdasarkan sekuens asam amino VHB regio Pre-S1 (459 nukleotida).
Hubungan kekerabatan berdasarkan sekuens asam amino diperlihatkan pada Gambar 10. Pohon filogenetik yang terbentuk sama dengan pohon
filogenetik yang dibentuk oleh sekuens nukleotida (Gambar 9). Isolat owa jawa hasil studi tetap berada pada cluster tersendiri seperti pada gambar 9. Namun
cluster isolat A6 dan C1 berada pada percabangan yang berbeda dengan kelompok owa jawa hasil studi lainnya. Analisa asam amino menunjukkan bahwa isolat VHBGi owa jawa C1 dan A6 mempunyai kemiripan komposisi asam amino dengan isolat VHBGi dari orangutan, H. lar dan H. agilis. Perbedaan pohon filogenetik dapat terjadi karena perbedaan pembacaan basa nukleotida yang ditranslasikan menjadi asam amino. Perbedaan urutan basa nukleotida akan mempengaruhi komposisi asam amino yang terbentuk.
Dari kedua pohon filogenetik yang terbentuk dapat diperlihatkan bahwa isolat virus hepatitis B yang menginfeksi owa jawa hasil studi berbeda dengan virus hepatitis B yang menginfeksi orangutan dan dapat terdeteksi dini menggunakan primer yang mengamplifikasi regio pre-S1 dari VHB.
Sekuens Genom Lengkap Virus Hepatitis B Gibbon Amplifikasi Virus Hepatitis B Gibbon
Untuk mendapatkan sekuens genom lengkap dari virus hepatitis B Gibbon (VHBGi), dilakukan amplifikasi DNA menggunakan empat pasangan primer. Masing-masing pasangan primer mempunyai daerah overlapped pada ujung 5’
dengan ujung 3’ pada primer lainnya. Dari kesembilan isolat owa jawa hasil studi yang digunakan adalah isolat C1 dan C2.
Mengacu pada sekuens genom lengkap VHBGi (Sa-Nguanmoo et al., 2008), target produk PCR yang diharapkan pasangan primer pertama adalah sebesar 1383 pasang basa, pasangan primer II sebesar 1027 pb, pasangan III sebesar 927 pb dan pasangan primer IV sebesar 1115 pb.
Isolat C1 dan C2 diambil untuk mendapatkan data sekuens genom lengkap VHBGi karena seluruh produk PCR dapat teramplifikasi dengan baik menggunakan keempat pasangan primer tersebut (Gambar 11). Hasil sekuens masing-masing produk PCR dari Macrogen Inc. (Korea) menggunakan primer yang sama dengan yang digunakan dalam amplifikasi kemudian dianalisa menggunakan program BioEdit versi 7 (2005) dan MEGA versi 5 (2011).
R1 1397 pb 1030 pb 1121 pb 921 pb 100 pb 850 pb 1650 pb 300 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Gambar 11 Visualisasi hasil amplifikasi genom lengkap VHBGi. Baris1 Ladder DNA1 kb, Baris 2-5 isolat C1 primer set 1, 2, 3, 4. Baris 6-9 isolat C2 primer set 1, 2, 3,4
Data sekuens dari masing-masing primer dipetakan untuk mendapatkan rekonstruksi genom lengkap VHBGi dan dibuat secara linear (Gambar 12). Area hijau menunjukkan posisi hasil amplifikasi set primer I (1397 pb), area tersebut terlihat seperti terpotong dikarenakan rekonstruksi yang dibuat adalah secara linear bukan melingkar yang merupakan bentuk asli genom VHB. Area merah adalah posisi hasil amplifikasi pasangan primer kedua (1030 pb).
Gambar 12 Rekonstruksi genom lengkap VHBGi linear berdasarkan posisi primer yang digunakan.
Posisi pasangan primer ketiga ditunjukkan oleh area kuning (921 pb). Sekuens nukleotida hasil amplifikasi pasangan primer keempat (1121 pb) ditunjukkan oleh warna biru dan terlihat seperti terpotong. Hal ini karena posisi
CORE2 CORE1 X101 R5 1 201 741 1021 1559 1770 2273 2479 2817 3192 F6 X102 PreS1F
primer keempat, seperti halnya primer pertama, dimulai dari nukleotida ke 2273 dan melingkar kembali ke posisi ke 201. Hasil rekonstruksi dan pensejajaran keempat pasang primer tersebut didapatkan ukuran VHB owa jawa sebesar 3192 pb (isolat C1) dan 3188 pb (isolat C2).
Data sekuens dari masing-masing pasangan primer VHBGi (3192 pb) hasil studi disejarkan dengan data yang didapat dari GenBank yaitu isolat Ttblack (3182 pb) dengan nomor akses GenBank AY330916 (Tabel 5). Pada Tabel 5 terlihat lokasi masing-masing gen VHBGi pada genom linearnya. Gen P dan S mempunyai posisi tumpang tindih pada nukleotida ke-1 sampai 835.
Tabel 5 Data lokasi gen VHB pada isolat Ttblack (GenBank, AY330916)
Gen Posisi nukleotida Ukuran gen (bp) P 2307 – 3182 1 – 1623 2499 S 2848 – 3182 1-835 1170 X 1374 – 1838 465 C 1814 – 2542 729
Mengacu pada sekuens isolat Ttblack tersebut didapatkan posisi masing- masing pasangan primer dari urutan nukleotidanya dalam mengkode gen-gen VHBGi seperti yang tertera pada Tabel 6. Masing-masing pasangan primer mempunyai daerah yang tumpang tindih (overlapped) dengan pasangan primer lainnya. Pada primer set pertama, dengan membandingkan posisi isolat hasil studi (174-757) dengan isolat Ttblack (Tabel 5), dapat terlihat bahwa nukleotida pada posisi tersebut berada pada daerah yang mengkode gen P dan sekaligus gen S. Posisi primer set II mengkode sebagian daerah gen P dan S. Demikian pula primer set 3 dan 4, mempunyai daerah yang tumpang tindih dengan gen lainnya.
Potongan-potongan sekuens primer kemudian dirangkaikan untuk mendapatkan daerah-daerah yang mengalami overlapping pada ujung-ujung 5’ dan 3’. Dengan mengacu pada sekuens genom lengkap VHBGi pada Hylobates pilleatus data GenBank (nomor akses AY781186) dapat dilihat posisi overlapping
1374
2848 1835
Tabel 6 Daerah gen VHBGi berdasarkan pasangan primer yang digunakan
Primer Set Primer Target produk Gen Besar isolat C1 Besar isolat C2 I PreS1F R5 1397 pb S/P 1397 pb 1317 pb II F6 X102 1030 pb P/S 1030 pb 999 pb III X101 CORE2 921 pb C/P X/C 921 pb 891 pb IV CORE1 R1 1121 pb P/S 1121 pb 1071 pb
Gambar 13 memperlihatkan posisi masing-masing open reading frame (ORF)
dari genom lengkap VHBGi berdasarkan data sekuens nukleotida dari isolat C1. Area hijau menunjukkan ORF S yang mengkode gen S (pre-S1, pre-S2 dan S), terbagi menjadi dua bagian karena genom VHB yang sebenarnya berbentuk sirkular dibuat menjadi linear, demikian pula area kuning yang menunjukkan ORF P yang mengkode gen P. Warna merah menunjukkan ORF X yang mengkode gen X. Sedangkan posisi pasangan primer ketiga yang mengkode gen C (Core dan pre- Core) ditunjukkan oleh area biru.
S S
C X
P P
Gambar 13 Prediksi genom linier sekuens sampel C1 dibandingkan dengan sekuens H. pileatus dari GenBank (no akses AY781186)
berdasarkan posisi open reading frame.
Hasil penggabungan empat pasang primer menghasilkan genom lengkap VHBGi isolate C1 yang terdiri dari 3192 nukleotida, sedangkan pada isolat C2 dihasilkan genom lengkap VHBGi yang terdiri dari 3188 nukleotida. Dengan menggunakan sekuens genom lengkap VHBGi, isolat C1 dibandingkan dengan C2 mempunyai perbedaan sebesar 1%. Hal ini disebabkan adanya insersi maupun delesi nukleotidabaik pada sekuens isolat C1 maupun isolat C2.
1623 1 1000 2000 3182 1 1 1838 1814 2542 3182
Pohon Filogenetik
Menggunakan data sekuens VHBGi genom lengkap yang didapatkan dari GeneBank dan perangkat lunak komputer MEGA dapat dikonstruksi pohon filogenetik yang memperlihatkan hubungan kekerabatan VHB antar spesies. Data GeneBank yang digunakan adalah sekuens VHB genom lengkap dari isolat VHB asal manusia (no. akses GQ 358158, HM 750156, GQ 358157, GQ 358156), orangutan (no. akses AF 193864, AF 193863), Hylobates pileatus (no. akses AY 781187, AY 781187, AB 037928), H. agilis (no. akses FM209513), dan gorila (FJ798097) serta isolat HBV dari woolly monkey (AF 046996). Pohon filogenetik yang digunakan adalah neighbour-joining dengan model substitusi kimura-2 paramater menggunakan bootsrap 1000 kali (MEGA, 2011).
Gambar 14 Pohon filogenetik VHB genom lengkap asal satwa primata dan manusia (3129 nukleotida)
Gambar 14 memperlihatkan bahwa isolat VHBGi hasil studi (H. moloch C1 dan C2) berada pada satu percabangan dan mempunyai kedekatan genetik sebesar 99% di antara keduanya. Kedua isolat tersebut mempunyai kekerabatan yang lebih dekat dengan isolat dari orangutan karena berada pada percabangan pohon yang sama dibandingkan dengan isolat dari spesies Hylobates lainnya. Isolat
orangutan berada pada cluster tersendiri bersama dengan isolat H. agillis. Isolat VHB manusia membentuk cluster tersendiri, terpisah dari cluster VHB pada satwa primata. Hal ini menunjukkan bahwa kekerabatan VHB manusia jauh dari VHB yang berasal dari satwa primata. Isolat Lagothrix lagothrica (woolly monkey) digunakan sebagai outgroup dalam pembentukan pohon filogenetik ini.
Lagothrix lagotricha sampai saat ini diketahui sebagai satu-satunya spesies satwa primata dari golongan monyet yang dapat terinfeksi VHB.