Penelitian ini dilakukan dari bulan Januari sampai dengan bulan Juni 2011, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat, Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB), Jalan Lodaya II/5, Bogor 16151.
Sampel Penelitian
Sampel yang dimanfaatkan dalam penelitian ini adalah plasma owa jawa yang merupakan koleksi sampel Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi PSSP LPPM-IPB, sebagai bagian dari pemeriksaan rutin kesehatan satwa dari beberapa fasilitas konservasi eks-situ satwa primata. Semua sampel yang digunakan dalam penelitian ini, berasal dari 9 ekor satwa owa jawa yang memiliki status positif atas pemeriksaan terhadap antigen permukaan virus hepatitis B (HBsAg) melalui uji ELISA (data sekunder).
Ekstraksi DNA
Pemurnian DNA virus dilakukan dari sampel plasma owa jawa menggunakan kit QIAmp DNA Mini Blood Kit (Qiagen, USA) sesuai dengan petunjuk dari pedoman penggunaan dari perusahaan. Sebanyak 200µl sampel plasma ditambahkan ke dalam tabung mikro yang telah berisi 20µl (20mg/ml)
proteinase K. Larutan penyangga pelisis (lisis buffer) ditambahkan sebanyak 200µl ke dalam masing-masing tabung mikro. Untuk menghomogenkan campuran tersebut dilakukan homogenisasi menggunakan vortex dan dilanjutkan dengan inkubasi selama 10 menit pada suhu 560 C. Prosedur selanjutnya dilakukan sentrifugasi, pencucian dan elusi sesuai dengan prosedur baku dari kit ekstraksi DNA QiAmp DNA Miniblood Kit.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Daerah Pre-S1 VHB
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR) dengan memanfaatkan primer yang dirancang untuk
mengamplifikasi daerah Pre-S1 yang merupakan daerah variabel dan karakteristik untuk VHB yang berasal dari spesies yang berbeda. Set primer forward dan
reverse disintesa dari sekuens bagian paling conserved di daerah yang variabel di antara berbagai strain VHB.
Sebanyak 50 µl reagen PCR yang terdiri dari, masing-masing 1µl primer
forward dan reverse (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl dNTPs (10 mM),
0,5µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X (500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O (23,5 ul) dimasukkan ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan menggunakan vortex.
Merujuk kepada penelitian yang dilakukan oleh Warren et al. (1999) yang telah berhasil mengamplifikasi VHB daerah Pre-S1 dari isolat orangutan, digunakan pasangan primer yang sama untuk mengamplifikasi VHB daerah Pre- S1 dari isolat DNA owajawa yaitu hepB-SF1 dengan sekuens 5’- TGYGGGTCACCWTATTCTTGGG-3’ dan hepB-SRout yang memiliki sekuens 5’-CACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’. Pasangan primer tersebut memiliki target produk kurang lebih 455 pasang basa.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer, Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu 940C selama 30 detik, annealing pada suhu 620C selama 30 detik, dan tahap elongasi pada suhu 720C selama 1 menit. Tahapan ini dilakukan selama 30 kali dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa 2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb (Invitrogen, USA) dan produk PCR yang telah ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA) digunakan untuk memvisualisasikan hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif PCR digunakan DNA positif VHB gibbon (VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB orangutan (VHBOu).
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Terhadap produk PCR yang memberikan hasil positif pada uji PCR dilakukan digesti menggunakan enzim restriksi BSt2UI (1 U/µl) yang bekerja pada sekuens spesifik yaitu CC(A/T)GG dari sekuens nukleotida sampel. Enzim restriksi ini telah diketahui dapat memotong sekuens nukelotida dari VHBOu namun tidak dapat memotong sekuens nukleotida dari VHBHu. Sebanyak 20µl campuran reagensia yang terdiri dari 1µl enzim BSt2UI (1IU/ul), buffer pereaksi 10 x sebanyak 1,5µl, dan produk PCR sebanyak 3,5µl. Ditambahkan air destilasi sampai volume mencapai 20µl. Kemudian dilakukan inkubasi pada suhu 600C selama 1 jam.
Untuk memvisualisasikan hasil restriksi enzim, produk PCR yang telah diinkubasi dengan enzim restriksi tersebut dijalankan melalui gel agarosa menggunakan elektroforesis horizontal dengan berkonsentrasi 2% yang ditambahkan ethidium bromida sebagai pewarna (staining), selama 1,5 jam, 100V. Pembacaan hasil eletroforesis dilakukan melalui alat GelDoc.
Amplifikasi DNA untuk Sekuens Genom Lengkap VHB
Amplifikasi DNA untuk mendapatkan sekuens genom lengkap VHBGi merujuk kepada Sa-Nguanmoo et al. (2008) yang menggunakan empat set primer seperti tertera pada tabel 2 di bawah ini.
Tabel 2 Pasangan primer untuk amplifikasi genom lengkap VHBGi Primer
set
Primer Sekuens primer Posisi nukleotida Target produk (pb) 1 PreS1F 5’-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3’ 2814 -2835 1840 R5 5’-AGCCCAAAAGACCCACAATTC-3’ 1015 - 995 2 F6 5’-ATATGGATGATGTGGTATTGGG-3’ 737-758 1027 X102 5’-ACCTTTAACCTAATCTCC-3’ 1764 - 1748 3 X101 5’-TCTGTGCCTTCTCATCTG-3’ 1552 - 1569 924 CORE2 5’-CCCACCTTATGAGTCCAAGG-3’ 2476 - 2457 4 CORE1 5’-GAGTGTGGATTCGCACTCCTCC-3’ 2268 - 2289 2109 R1 5’-TGTAACACGAGCAGGGGTCCTA-3’ 201 - 180
Sebanyak 50 µl reagensia PCR yang terdiri dari, masing-masing satu pasang primer forward dan reverse sebanyak 1µl (10 pmol/µl), 4 µl MgCl2 (25mM), 5 µl
dNTPs (10 mM), 1µl Taq Gold Polymerase (5 U/µl), 5 µl PCR Buffer 10X (500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 8,3), sampel DNA (10 ul) dan ddH2O (23ul) dimasukkan ke dalam tabung mikro 200µl dan dihomogenkan menggunakan vortex.
Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan mesin PCR (Perkin Elmer, Model 9700), melalui beberapa tahapan. Pada tahap awal dilakukan pre-PCR untuk mengaktifkan enzim polymerase pada suhu 940C selama 10 menit. Tahapan selanjutnya adalah amplifikasi PCR yang terdiri atas denaturasi sampel pada suhu 940C selama 30 detik, annealing pada suhu 550C selama 30 detik, dan tahap elongasi pada suhu 720C selama 2 menit. Tahapan ini dilakukan selama 40 kali dengan siklus yang berulang. Tahap akhir adalah post-PCR dengan suhu 720C selama 10 menit.
Produk PCR yang telah diamplifikasi tersebut dijalankan pada gel agarosa 2% yang mengandung ethidium bromida 1 µg/ml dalam bufer TAE menggunakan elektroforesis horizontal. Penanda DNA 1 kb dan produk PCR yang telah ditambahkan pewarna (loading dye) dimasukkan ke dalam sumur gel. Alat dokumentasi Gel Doc 2000 (BioRad, USA) digunakan untuk memvisualisasikan hasil elektroforesis. Sebagai kontrol positif digunakan DNA positif VHB gibbon (VHBGi), VHB manusia (VHBHu) dan VHB orangutan (VHBOU).
Pemurnian Produk PCR
Pemotongan gel produk PCR dilakukan dengan memotong gel yaitu tepat pada bagian gel yang memiliki pita yang berpendar saat diradiasi sinar UV. Potongan gel hasil amplifikasi kemudian dilakukan pemurnian menggunakan kit ekstraksi gel QiaQuick (Qiagen, USA). Untuk mendapatkan sekuens nukleotida, hasil pemurnian produk PCR dilakukan di Macrogen Inc, Korea. Sekuensing dilakukan baik terhadap produk PCR VHBGi regio Pre-S1 maupun genom lengkap VHBGi.
Analisa Hasil Sekuensing
Pembacaan hasil sekuensing mengunakan perangkat lunak komputer BioEdit. Pensejajaran urutan nukleotida dianalisa menggunakan program BLAST
2.0 (BLAST, 2011) dan ClustalW2 (Kumar et al. 2011). Pembuatan pohon filogenetik menggunakan perangkat lunak komputer MEGA versi 5.0 (Kumar et al. 2011). Sebagai pembanding dimasukkan urutan nukleotida virus Hepatitis B asal spesies Gibbon lainnya di luar Indonesia, orangutan, manusia , woolly monkey, simpanse dan gorilla dari data GeneBank.
Alur Penelitian
Seleksi owa jawa yang terdeteksi positif dari hasil uji serologi HBsAg akan dilanjutkan dengan uji karakteristik diagnostik cepat melalui PCR dengan primer daerah Pre-S21 VHB.
Isolat yang memberikan karakteristik spesifik dengan sediaan material DNA yang memadai maka akan dilakukan karakteristik nukleotida penyusun virus hepatitis B pada owa jawa secara utuh.
Kemungkinan terjadinya transmisi VHB secara interspesies maupun
intraspesies pada owa jawa
Sampel darah owa jawa penangkaran eksitu
Karakteristik diagnostik cepat melalui PCR dengan primer
spesifik VHB daerah pre- S1dari sampel positif serologi owa jawa yang positif secara
uji serologi HBsAg
Rekonstruksi pohon filogenetik dengan satwa
primata lain
Karakteristik molekular secara utuh VHB pada owa jawa Rekonstruksi pohon
filogenetik dengan manusia dan satwa primata lain