GENE SEQUENCES ANALYSIS RELATED TO GROWTH AND IMMUNITY OF WHITE SHRIMP
HASIL Ekspresi Gen
Gen Terkait Pertumbuhan
Ekspresi gen yang disajikan pada Gambar 6 dengan prediksi bahwa udang dalam kondisi normal karena sampel diambil pada waktu dan kondisi yang bersamaan, walaupun tidak berasal dari keturunan yang sama. Ekspresi gen SIBD pada beberapa stadia udang vaname menunjukkan bahwa pada stadia PL2 ekspresinya belum muncul, tetapi pada PL10 sudah meningkat, dan menurun lagi setelah PL20, dan PL30. Pada sampel hepatopankreas dan udang ganti kulit ekspresi SIBD juga muncul. Level ekspresi gen CHH pada PL10 terjadi peningkatan, kemudian menurun pada PL20 dan naik lagi pada PL30. Naik turunnya level CHH berkaitan dengan proses metabolisme udang vaname. Level ekspresi pada hepatopankreas dan udang ganti kulit cukup tinggi. Level ekspresi gen MIH pada PL2, PL10, PL20, dan PL30 cukup tinggi, yang mengindikasikan bahwa udang akan melakukan aktivitas ganti kulit tetapi dihambat oleh MIH. Selanjutnya pada hepatopankreas gen MIH tidak terekspresi (level 0), dan pada udang yang sudah ganti kulit, MIH tidak terekspresi lagi. Level ekspresi gen CypA rendah pada semua stadia pasca larva, bahkan nilainya 0,00 untuk PL2, PL20, PL ganti kulit, dan hepatopankreas. Hal ini mengindikasikan bahwa gen CypA tidak terdeteksi atau rendah sekali pada udang vaname, kemungkinan lain primer yang digunakan kurang sesuai.
Gen Terkait Imunitas
Level ekspresi gen lektin dan proPO pada stadia PL2, PL10, dan PL20 meningkat terus dan menurun pada PL30. Sementara pada hepatopankreas dan udang ganti kulit ekspresi lektin dan proPO rendah, bahkan 0 pada hepatopankreas untuk ekspresi proPO (Gambar 7).
Verifikasi Gen Target
Hasil verifikasi pada gel elektroforesis, terdeteksi band/pita masing-masing sampel pada 200 bp untuk SIBD, 196 bp untuk CHH, 200 bp untuk MIH, 170 bp untuk CypA, 210 bp untuk lektin, dan 220 bp untuk proPO (Gambar 8). Hal ini menunjukkan bahwa gen yang terekspresi pada sampel-sampel yang dianalisis dengan qPCR tersebut adalah benar.
Gambar 6 Ekspresi gen single insulin binding domain (SIBD), crustacean hyperglycemia hormone (CHH)), molt inhibiting hormone (MIH), dan cyclophilin A (CypA) pada sampel udang vaname stadia PL2(1), PL10(2), PL20(3), PL30(4), hepatopankreas PL30(5), dan PL30 ganti kulit (6). Total RNA diekstraksi dari 50 ekor PL2, 10 ekor PL14, 6 ekor PL20, 3 ekor PL30 ganti kulit, 6 ekor untuk hepatopankreas, masing-masing dari satu populasi bak pemeliharaan. Tingkat ekspresi gen dianalisis menggunakan metode real-time PCR dan dinormalisasi dengan ekspresi gen β-aktin.
Gambar 7 Ekspresi gen lektin, dan profenoloksidase (proPO) pada sampel udang vaname stadia PL2(1), PL10(2), PL20(3), PL30(4), hepatopankreas PL30(5), dan PL30 ganti kulit (6). mRNA diekstraksi dari 50 ekor PL2, 10 ekor PL14, 6 ekor PL20, 3 ekor PL30 ganti kulit, 6 ekor untuk hepatopankreas, masing-masing dari satu populasi bak pemeliharaan. Tingkat ekspresi gen dianalisis menggunakan metode
real-timePCR dan dinormalisasi dengan ekspresi mRNA β-aktin. 0,00 1,57 0,36 0,01 0,08 0,01 1 2 3 4 5 6 Eks pr e si re la ti f SIBD 0,02 0,04 0,01 0,02 0,12 0,05 0 1 2 1 2 3 4 5 6 CHH 0,29 0,02 0,03 0,11 0,00 0,00 0 1 2 1 2 3 4 5 6 Eks presi rel a ti f MIH 0,00 0,03 0,00 0,01 0,00 0,00 0 1 2 1 2 3 4 5 6 CypA 0,01 0,53 0,89 0,55 0,01 0,01 0 1 2 1 2 3 4 5 6 Eks pr e si re la ti f Lektin 0,19 1,00 1,53 0,41 0,00 0,02 0 1 2 1 2 3 4 5 6 proPO
Gambar 8 Elektroforegram produk amplifikasi primer spesifik qPCR gen single insulin binding domain (SIBD), crustacean hyperglycemia hormone
(CHH), molt inhibiting hormone (MIH), cyclophilin A (CypA), lektin,
profenoloksidase (proPO), dan β-aktin udang vaname. M = marker DNA (Vivantis Inc, California-USA); PL2, PL10, PL20, PL30, Hepato, Molt = sampel-sampel udang vaname yang diidentifikasi.
Kemiripan Sekuen mRNA Udang Vaname
Hasil sekuensing dari produk qPCR sampel udang yang disejajarkan dengan sekuen yang telah ada pada BankGen dengan metode BLAST-N. menunjukkan bahwa kemiripan atau similaritas sampel dengan mRNA SIBD protein Litopenaeus vannamei (nomor aksesi EU664996.1) sebesar 97%; similaritas sampel dengan mRNA CHH L.vannamei (nomor aksesi HM748790.2) sebesar 83%; similaritas sampel dengan mRNA MIH1 L.vannamei (nomor aksesi DQ412566.1) sebesar 99%; similaritas sampel dengan mRNA Cyclophilin A
P.monodon (nomor aksesi EU164775.1) sebesar 91%; similaritas sampel dengan mRNA C-type lectin L.vannamei (nomor aksesi EF583939.1) sebesar 92%; similaritas sampel dengan mRNA proPO L.vannamei (nomor aksesi AY723296.1)
sebesar100%; similaritas sampel dengan mRNA β-actin L.vannamei (nomor aksesi AF300705.2) sebesar 82% (Tabel 4).
Tabel 4 Similaritas sekuen mRNA yang diisolasi dari udang vaname dengan mRNA yang terdapat pada BankGen
Deskripsi Nomor aksesi Pemenuhan query (%) Similaritas (%) mRNA SIBD L.vannamei EU664996.1 100 97 mRNA CHH L.vannamei, HM748790.2 98 83 MIH1 L.vannamei DQ412566.1 88 99
CypA P.monodon EU164775.1 97 91
mRNA C-type lectin
L.vannamei EF583939.1 98 92 mRNA proPO L.vannamei AY723296.1 85 100 mRNA β-actin L.vannamei AF300705.2 99 82
Kemiripan sekuen mRNA SIBD pada sampel udang vaname dengan mRNA SIBD L.vannamei di BankGen dengan nomor aksesi EU664996.1 pada Gambar 9. Kemiripan sekuen mRNA CHH pada sampel udang vaname dengan mRNA CHH
L.vannamei di BankGen dengan nomor aksesi HM748790.2 pada Gambar 10. Kemiripan sekuen mRNA MIH pada sampel udang vaname dengan mRNA MIH1
L.vannamei di BankGen dengan nomor aksesi DQ412566.1 pada Gambar 11. Kemiripan sekuen mRNA CypA pada sampel udang vaname dengan mRNA CypA
P.monodon di BankGen dengan nomor aksesi EU164775.1 pada Gambar 12. Kemiripan sekuen mRNA lektin pada sampel udang vaname dengan mRNA C- type lectin L.vannamei di BankGen dengan nomor aksesi EF583939.1 pada
Gambar 13. Kemiripan sekuen mRNA proPO pada sampel udang vaname dengan mRNA proPO L.vannamei di BankGen dengan nomor aksesi AY723296.1pada Gambar 14. Kemiripan sekuen mRNA β-aktin pada sampel udang vaname dengan mRNA β-aktin L.vannamei di BankGen dengan nomor aksesi AF300705.2 pada Gambar 15.
Gambar 9 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA single insulin binding domain
(SIBD) yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen SIBD (kode aksesi EU664996.1). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus-putus =
primer reverse
Gambar 10 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA crustacean hyperglycemia hormone (CHH) yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen CHH referensi dari BankGen (kode aksesi HM748790.2). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus-putus = primer reverse
SIBD SAMPEL.gnu 0 --- 0 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 241 CTTTACTGCAAGCTGCACCCCGTCTCCTATGGTAATGGTATCTGCACGGCCACACCGCAG 300 SIBD SAMPEL.gnu 1 ---GTTTCGTGATTCTGGGACAAGGTTTCATGATGATG 35 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 301 AAATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCGTGATTCTGGGACAAGGTTTCATGATGATG 360 SIBD SAMPEL.gnu 36 GTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCA 95 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 361 GTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCA 420 SIBD SAMPEL.gnu 96 TGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACA 155 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 421 TGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACA 480 SIBD SAMPEL.gnu 156 AGGTCTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATTCTTGGTAGTAGTA 215 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 481 AGGTCTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATTCTGGG-ACAAGGT 539 SIBD SAMPEL.gnu 216 CTTTGGAACAGGGT-CTTAGTGCTTTG--- 241 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 540 TTCATGATGATGGTACTGATTCCTGGGACAAGGTTTCATGATGATGGTACTGATTCCTGG 599 SIBD SAMPEL.gnu 241 --- 241 mRNA SIBD - L.vannamei.gnu 600 GACAAGGTTTCATGATGATGGTACTGATTCCTAGGACAAGGTTTCAGGATGAGTCTCATC 659 SIBD SAMPEL.gnu 241 --- 241
mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 121 TCGCGGCGTCGTCCGCTGCCCCCGCCGACGCCTTATCCGCCCCTGCGGCAGGCCTCACCA 180 CHH Sampel.gnu 0 --- 0 mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 181 AACGCTCGCTCTCCGACCCTTCCTGCACCGGCGTCTTCGACCGGCAGCTCTTGCGGAGGC 240 CHH Sampel.gnu 1 ---ATTCCCAACGTATCTACTGAAT 22 mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 241 TGCGTCGAGTGTGTGACGACTGTTTCAACGTATTCAGGGAACCCAACGTATCTACTGAAT 300 CHH Sampel.gnu 23 GCAGAAGTAACGGGTACAACAAGGAAGTGTTCCCGCCCGGTGGTATGGGAATACCCTCCT 82 mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 301 GCAGAAGTAACTGTTACAACAATGAAGTGTTCC--GCCAGTG-TATGG-AATACC-TCCT 355 CHH Sampel.gnu 83 CCCGCCTTCACCTTTCACGAAAGAGCACAGAACTAGCCTGTCCAAAATGGGTTTCGGAAA 142 mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 356 CCCGCCT-CACCTT-CACGAA-GAGCACAGA-CTAGC-TGTCCAGA---TGGTCGGGAAA 407 CHH Sampel.gnu 143 AAGATTCACGGGTTTAGACGCTTCAACCCTAATATCTCGACGACAGGGAATCCGGATGA- 201 mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 408 TAGATTCACGG-TTAAGACGCTGCAACCCACTTCGCT-GACGACAGG-AATCCG-ATGAT 463 CHH Sampel.gnu 201 --- 201 mRNA CHH L.vannamei complete.gnu 464 AGTAAAAGGCACCCTAATTCCACTTATTCTACAGCATAGCACTGAGTCCTCGATCGCTGT 523
Gambar 11 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA molt inhibiting hormone
(MIH) yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen MIH referensi dari BankGen (kode aksesi DQ412566.1). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus-putus = primer reverse
Gambar 12 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA cyclophilin A (CypA) yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen CypA referensi dari BankGen (kode aksesi EU164775.1). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus- putus = primer reverse
MIH Sampel.gnu 1 ---TTATTATACACTCATGTATCGGCTGGCAAAGGGAAGAGACTGAGAGTTTT 50 MIH 1 - L.vannamei.gnu 1 CTCCGTCCCTACATTATACACTCATGTATCGGCTGGCAATGGTAAGAGACTGAGAGTTTT 60 MIH Sampel.gnu 51 TTGGAGGTGGATATTTGGCTTTTTGCACTTCAGTAGCCATCGCAGGGTTGTTTATTTTT- 109 MIH 1 - L.vannamei.gnu 61 TTGGAGGTGGATATTTGGCTTTTTGCACTTCAGTAGCCATCGCAGGGTTGTTTATTTTTT 120 MIH Sampel.gnu 110 CTAGATTTGATCCTCGCTTTTATTTATTTTTCCTCCTCTTCGTTGCAGAAGACATGGCAA 169 MIH 1 - L.vannamei.gnu 121 CTAGATTTGATCCTCGCTTTTATTTATTTTTCTTCCTCTTCGTTGCAGAAGACATGGCTA 180 MIH Sampel.gnu 170 GCCAAGGGGATTGTAGTTGTTGGGACAAGCCTCTAA--- 205 MIH 1 - L.vannamei.gnu 181 GCTATAGTGATTGTAGTTGTTGGGACAAGCCTCTTCTTTGACACTACTTCCGCCAGTTTC 240 MIH Sampel.gnu 205 --- 205 MIH 1 - L.vannamei.gnu 241 ATAGACGGAACTTGTCGAGGCGTAATGGGTAATCGTGACATTTACAAGAAGGTTGTGCGC 300 CypA Sampel.gnu 0 - - - 0 CypA - P.monodon.gnu 361 G GC C C CG GCAC C CTGTC CATG GC CA ACGC CG GC C C CA ACAC CA ACG G GTCGCA AT TCT TC 420 CypA Sampel.gnu 1 - - - -T TA AT T T TCNGC CGANT T 18 CypA - P.monodon.gnu 421 ATCTGCAC CGTCA A A AC C C C CTG GCTG GACA ACA AGCACGTG GT T T TCG GCTC CGTG GTG 480 CypA Sampel.gnu 19 TA ACACTGA AGTGC CA ATACAGCA A AGAT TATATC CTG GATC CTCA AT TACATCAGA A A A 78 CypA - P.monodon.gnu 481 GAG G GCATG GACATCGTGCGC CAG GTCGAG G GT T TCG GCAC C C C CA ACG GCTCT TGCA AG 540 CypA Sampel.gnu 79 A- -A A A ATG G G G G G G G GTA A AG G G GA A AG GTCTGA A ACGT T TCAGA ACATC C C C C CT TAC 136 CypA - P.monodon.gnu 541 CG GA A AGTGATGATCGC CA ACTGCG GC CAG-CTGTA A AGT T TCAGA ACAT TC C C C CT TAG 599 CypA Sampel.gnu 137 C C C C C C-C CAT T T T T T T T TCTGATGTA AT TGAG GATC CAG GATATA ATCT T TGCTGTAT T 195 CypA - P.monodon.gnu 600 C CGC C CAC C C CT T T T T T T T T TGATGTA AT TGAG GATC CAG GATATA AT T T T TGCTGTAT T 659 CypA Sampel.gnu 196 G GCACT TCAGTGT TA A AT T-CG GCTGA- - - 221 CypA - P.monodon.gnu 660 G GCACT TCAGTGT TA A AT T TCG GCT TGA A A A A A AGT TA A ATGCTATATA ACGTA A AG GTG 719 CypA Sampel.gnu 221 - - - 221 CypA - P.monodon.gnu 720 GTGA A ACA AGATAG GTGT TCT TC CAT T T T T T T T TGT T T TAT TAGT T TCATA AGTG GTCAT 779
Gambar 13 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA lektin yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen lektin referensi dari BankGen (kode aksesi EF583939.1). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus-putus =
primer reverse
Gambar 14 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA profenoloksidase (proPO) yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen proPO referensi dari BankGen (kode aksesi AY723296.1). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus-putus = primer reverse
Lektin sampel.gnu 0 -- -- --- --- --- --- --- -- --- --- --- -- --- --- --- -- --- 0
C-type lectin-L. vannamei.gnu 301 GTCACACAAG GCA AGCACTTCCGGTTAGGAGCAACAGATGA AGTAGAAGAAG GCACTTGG 360
Lektin sampel.gnu 0 -- -- --- --- --- --- --- -- --- --- --- -- --- --- --- -- --- 0
C-type lectin-L. vannamei.gnu 361 AA AT TTGTAA ACA ACAGGGCAGTTCCAC-AGG GTGTACCTT TCTGG GGTAAAGGCGAGCC 419
Lektin sampel.gnu 1 -- -- --- --ACAA ACAGGGCAGTTCCACTAGG GGGTTCCTT TCTGG GGT TAAGGCGAGCC 51
C-type lectin-L. vannamei.gnu 420 TA ATAGTGGGAATACGCACAACTGCGC CATTATGCATGCTAGT TATAAC C-ATTATTGGT 478
Lektin sampel.gnu 52 TA ATAGTGGGAATACGCACAACTGCGC CATTATGCATGCTAGT TATAAC CCATTATTGGT 111
C-type lectin-L. vannamei.gnu 479 ATGATATCC-AGTGTGAAAA---CAAGTATAACCC C--ATT TGCC- ---TCA AGAAA-TA 527
Lektin sampel.gnu 112 ATGATATCCCAGTGTGAAAAACACAAGTATAACCC CCCATT TGCCCTTCTCA AGAAAATA 171
C-type lectin-L. vannamei.gnu 528 TTAA A--TAGTACTGTACATCGGCGAG GTAGCATTCTGATGAA AGACAGAACTTGGAAAT 585
Lektin sampel.gnu 172 TTAA AAT TAGTACTGTACATCGGCGAG GTAGCATTCTGATGAA AGACAGA-- -- --- 221
C-type lectin-L. vannamei.gnu 586 GA AGATAGAGCAA ATAAAAAAAAA AAA AA AA 616
Lektin sampel.gnu 221 -- -- --- --- --- --- --- -- -- 221 proPO sampel.gnu 0 - - - 0 proPO-1 L.vanname.gnu 1381 T TC CT TC C CG GCGTGAG GATCGA A AG G GCTG GCGTG GTGAG G GACGACGAG GCTGACGTC 1440 proPO sampel.gnu 1 - - - -TGC C CGCT TGC CG G GT T TA AG GTGA ACAGT T TCA ACG GT 39 proPO-1 L.vanname.gnu 1441 CTC CTCACAG GCTG GA ACACA AG G GA AT TCGA AGC CAGC CGCG GCATCGACT TCA ACG GT 1500 proPO sampel.gnu 40 AGAC C CGTGAT TCT TCGC CTCACGCATCTCGAC CACA AGC C CT TCGACTAC CATATACAG 99 proPO-1 L.vanname.gnu 1501 AGAC C CGTGAT TCT TCGC CTCACGCATCTCGAC CACA AGC C CT TCGACTAC CATATACAG 1560 proPO sampel.gnu 100 ATCA ACA ACGAC CTGCGAGAGC CGA AG GA A ATGACTGTGAG GATATACT TG GCTA A A A AG 159 proPO-1 L.vanname.gnu 1561 ATCA ACA ACGAC CTGCGAGAGC CGA AG GAG GTGACTGTGAG GATATACT TG GCTC CGA AG 1620 proPO sampel.gnu 160 T TACA ATG GTCGAGA ACA AGAGACGA ACTGTCATG GAGCAGCG GATC CTCTG GTG-GAGA 218 proPO-1 L.vanname.gnu 1621 T T-CA ATG GTCGAGA ACA AGAGATGA ACT-TCATG GAGCAGCG GATC CTCTG GTGTGA AT 1678 proPO sampel.gnu 219 AG GACA AGT TCACTGT TCAC C C CG GA AGA A A A AC CG G GTC C C CT T T TA A A A- - - 269 proPO-1 L.vanname.gnu 1679 TG GACA AGT TCACTGT TCAC CT TA A AC C CG GCACGA AC CACGTCGTCAG GTCGTC CA AG G 1738 proPO sampel.gnu 269 - - - 269 proPO-1 L.vanname.gnu 1739 AGTC CTC CATCAC CA AC CTCGAG GA ACTGAC CT TCA AG GAC CTG GAGA ACTCTG G GC C CG 1798
Gambar 15 Penyejajaran sekuen nukleotida mRNA β-aktin yang diisolasi dari udang vaname dengan sekuen β-aktin referensi dari BankGen (kode aksesi AF300705.2). Nomor pada awal dan akhir nukleotida menunjukkan urutan nukleotida. A=adenin, C=sitosin, T=timin, G=guanin. Kotak penuh = primer forward; kotak putus-putus =
primer reverse
Filogenetik
Sekuen sampel udang vaname disejajarkan (alignment) dengan sekuen spesies lainnya yang ada di BankGen dengan program Genetyx Versi 7, memperlihatkan kekerabatan terhadap SIBD (Gambar 16), terhadap CHH (Gambar 17), terhadap MIH (Gambar 18), terhadap CypA (Gambar 19), terhadap lektin (Gambar 20), terhadap proPO (Gambar 21), dan terhadap β-aktin (Gambar 22).
Gambar 16 Filogenetik mRNA single insulin binding domain (SIBD) yang diisolasi dari udang vaname Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan L.vannamei SIBD (kode aksesi EU664996.1), dengan
Cupiennius salei SIBD-2 / IGFBP (kode aksesi HE580154.1), dan dengan Eriocheir sinensis SIBD / IGFBPs (kode aksesi FJ607954.1)
Beta actin - L.vannamei.gnu 961 ACACCGTGCTGTCCGGAGGCACCACCATGTACCCTGGCATCGCCGACAGGATGCAGAAGG 1020 Beta aktin sampel.gnu 0 --- 0 Beta actin - L.vannamei.gnu 1021 AAATCACTGCCCTCGCTCCCTCCACCATGAAGATCAAGATCATCGCCCCACCC-GAGCGC 1079 Beta aktin sampel.gnu 1 ---GTCCCTCCACCATGAAGATCAAGCTCCGTGCACCGCGGAGAGCGC 45 Beta actin - L.vannamei.gnu 1080 AAG-TACTCCG--TGTGG-ATCGG--CGGCTCCATCC--TGGCCTCGC-TCTCCACCTT- 1129 Beta aktin sampel.gnu 46 AAGGTACTCCGGTGGTGGGATCGGGCGGGCTCCATCCCTGGGCCTCGCCTCTCCACCTTT 105 Beta actin - L.vannamei.gnu 1130 CCAGCAGA-TGTGG-ATCAGC--AAGCAGGAGTACGACGAG--TCTGGACCATCAATTGT 1183 Beta aktin sampel.gnu 106 CCAGCAGAATGTGGGATCAGCCAAAGCAGGAGTACGACGAGGTTCTGGACCA--- 157 Beta actin - L.vannamei.gnu 1184 TCACAGGAAGTGCTTCTAATTAACAAAATGTACATGATATAGGCTACACTTTTTACATTT 1243 Beta aktin sampel.gnu 157 --- 157
0,3755
L.vannamei SIBD (Sampel)
L.vannamei SIBD
Cupiennius salei SIBD-1/IGFBP
Gambar 17 Filogenetik mRNA crustacean hyperglycemia hormone (CHH) yang diisolasi dari udang vaname Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan L.vannamei CHH partial (kode aksesi FJ598023.1), Penaeus vannamei CHH (kode aksesi X99731.1), L.vannamei CHH A gen partial (kode aksesi AY434016.1), L.vannamei CHH complete (kode aksesi HM748790.2), dan P.monodon CHH homolog PmSGP (kode aksesi AF104386.1)
Gambar 18 Filogenetik mRNA molt inhibiting hormone (MIH) yang diisolasi dari udang vaname Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan
Penaeus semisulcatus MIH (kode aksesi AB810255.1), P.monodon
MIH (kode aksesi AY496454.1), L.vannamei MIH1 (kode aksesi DQ412566.1), dan L.vannamei MIH2 (kode aksesi DQ412567.1). 0,024
L.vannamei CHH partial
P.vannamei CHH
L.vannamei CHH A gen partial
L.vannamei CHH complete P.monodon CHH homolog PmSGP L.vannamei CHH (sampel) 0,0439 P.semisulcatus MIH P.monodon MIH1 L.vannamei MIH1 L.vannamei MIH2
Gambar 19 Filogenetik mRNA cyclophilin A (CypA) yang diisolasi dari udang vaname Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan L.vannamei
CypA (kode aksesi JN546074.1), Penaeus monodon CypA (kode aksesi EU164775.1), dan Danio rerio CypA (kode aksesi AY391451.1).
Gambar 20 Filogenetik mRNA lektin yang diisolasi dari udang vaname
Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan L.vannamei C-type lectin clone c002 (kode aksesi DQ858900.1), L.vannamei C-type lectin (kode aksesi EF583939.1), Fenneropenaeus chinensis C-type lectin (kode aksesi DQ167572.1), dan Penaeus monodon C-type lectin (kode aksesi AB197373.1).
L.vannamei CypA
P.monodon CypA
Danio rerio CypA
L.vannamei CypA (sampel)
0,036
0,0932
L.vannamei C-type lectinclone c002
L.vannamei C-type lectin
L.vannamei C-type lectin (sampel)
Fenneropenaeus chinensis C-type lectin
Gambar 21 Filogenetik mRNA profenoloksidase (proPO) yang diisolasi dari udang vaname Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan
Fenneropenaeus chinensis proPO (kode aksesi AB374531.1),
Penaeus semisulcatus proPO (kode aksesi AF521949.1),
Macrobracium rosenbergii proPO (kode aksesi AY947401.1),
P.monodon proPO (kode aksesi AF099741.1), L.vannamei microsatellite proPO (kode aksesi EF115296.1), L.vannamei proPO (kode aksesi AY723296.1), dan L.vannamei proPO1 (kode aksesi EU284136.1),
Fenneropenaeus chinensis proPO
P.semisulcatus proPO M.rosenbergii proPO
P.monodon proPO
L.vannamei microsatellite proPO
L.vannamei proPO
L.vannamei proPO1
L.vannamei proPO (sampel)
Gambar 22 Filogenetik mRNA β-aktin yang diisolasi dari udang vaname
Litopenaeus vannamei disejajarkan dengan Fenneropenaeus chinensis β-aktin (kode aksesi DQ205426.1), Penaeus monodon β- aktin (kode aksesi JN808449.1), dan L.vannamei β-aktin (kode aksesi AF300705.2)
PEMBAHASAN
Single Insulin Binding Domain (SIBD)
Gen SIBD telah berhasil diidentifikasi dari DNA complementer (cDNA) sampel udang vaname L.vannamei dengan gel elektroforesis pada posisi 200 bp (Gambar 8). Selanjutnya dengan analisis BLAST-N diperoleh similaritas sekuen sampel udang vaname sebesar 97% dan pemenuhan query sebesar 100% (Tabel 4) dengan mRNA SIBD Litopenaeus vannamei complete (nomor aksesiEU664996.1).
Keberadaan SIBD pada udang vaname dibuktikan dengan ekspresi gen pada beberapa stadia pasca larva, hepatopankreas, dan udang ganti kulit (Gambar 6). Pada penelitian ini level ekspresi SIBD udang vaname meningkat pada PL10 kemudian menurun lagi pada PL20 dan PL30, hal ini mengindikasikan bahwa secara alami SIBD terekspresi untuk memacu pertumbuhan dan metamorphosis atau perkembangan stadia. Selanjutnya keberadaan SIBD pada hepatopankreas membuktikan bahwa di hepatopankreas ada aktivitas SIBD. Sementara udang ganti kulit level ekspresi sama dengan udang tidak ganti kulit pada stadia yang sama (PL30). Hal ini mengindikasikan bahwa untuk aktivitas ganti kulit perlu induksi SIBD yang akhirnya menginduksi pertumbuhan.
Sesuai dengan fungsinya sebagai pemacu pertumbuhan, keberadaan IGF juga telah dibuktikan pada moluska dan insect. Pada vertebrata, insulin dan IGF-I
Fenneropenaeus chinensis β-aktin
P.monodon β-aktin
L.vannamei β-aktin
L.vannamei β-aktin (sampel)
memegang peran penting dalam regulasi proses anabolik dalam metabolisme. Gutie´rrez et al. (2007) menunjukkan adanya insulin in vivo pada krustase, sedangkan Castellanos et al. (2008) menunjukkan adanya SIBD dari L. vannamei
yang mempunyai similaritas tinggi dengan IGF binding protein.
Selain pada udang vaname, SIBD juga teridentifikasi pada kepiting dan laba- laba, seperti yang dilakukan oleh Gai et al. (2010) yaitu IGFBPs dikarakterisasi sebagai insulin binding (IB) domains yang diidentifikasi dari kepiting Eriocheir sinensis (EsSIBD), yang merupakan komponen penting untuk system endokrin dan memegang peran penting dalam metabolisme serta pertumbuhan. Sedangkan Trachsel et al. (2012) menemukan SIBD-1 dari laba-laba Cupiennius salei
termasuk dalam IGFBP superfamily karena similaritas sekuen tinggi dan mempunyai peran penting dalam sistem imun. Penentuan IGFBP superfamily didasarkan pada similaritas struktur dan fungsi untuk IGF dengan afinitas tinggi (Hwa et al. 1999). Sekuen mRNA SIBD sampel udang vaname mempunyai kedekatan atau kekerabatan dengan mRNA SIBD L.vannamei dengan nomor aksesi EU664996.1, dengan mRNA SIBD/IGFBPs Eriocheir sinensis dengan nomor aksesi FJ607954.1 dan dengan SIBD-1/IGFBP Cupiennius salei dengan nomor aksesi HE580154.1
Crustacean Hyperglycemia Hormone (CHH)
Gen CHH telah berhasil diidentifikasi dengan gel elektroforesis pada posisi 196 bp dari cDNA sampel udang vaname sebagai templat/cetakan (Gambar 8). Dengan teridentifikasi pada cDNA sampel udang vaname, membuktikan CHH ada dalam tubuh udang vaname. Setelah dilakukan analisis BLAST-N terhadap sekuen sampel diketahui mempunyai similaritas dengan sekuen mRNA CHH L.vannamei complete dengan nomor aksesi HM748790.2 sebesar 83% dengan pemenuhan
query 98% (Tabel 4).
Tingkat ekspresi mRNA CHH yang ditunjukkan pada udang stadia PL2, PL10, PL20, PL30 terlihat adanya ekspresi yang meningkat pada PL10 dan menurun pada PL20 serta meningkat lagi pada PL30 (Gambar 6). Naik turunnya tingkat ekspresi gen ini membuktikan bahwa CHH berperan pada proses-proses yang berkaitan dengan pertumbuhan, metamorfosis, dan ganti kulit, karena pada stadia pasca larva adalah stadia perkembangan larva udang menuju juvenil yang telah sempurna secara morfologi maupun pencernaannya. Sementara pada hepatopankreas terlihat tingkat ekspresi CHH paling tinggi, ini membuktikan bahwa CHH berperan di organ tersebut. Selanjutnya pada udang ganti kulit terlihat tingkat ekspresi CHH cukup tinggi. Keterkaitan pelepasan CHH dan MIH krustase secara in vivo telah diteliti pada kepiting C. maenas (Chung & Wester 2005). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa pola pelepasan CHH umumnya terjadi pada saat setelah krustase mengalami stres khususnya pada saat ganti kulit.
Filogenetik yang dihasilkan dari penyejajaran sekuen sampel cDNA udang vaname dengan 4 sekuen mRNA CHH L.vannamei yaitu L.vannamei CHH partial (kode aksesi FJ598023.1), P.vannamei CHH (kode aksesi X99731.1), L.vannamei
CHH A gen partial (kode aksesi AY434016.1), L.vannamei CHH complete (kode aksesi HM748790.2), dan P.monodon CHH homolog PmSGP (kode aksesi AF104386.1)
Molt Inhibiting Hormone (MIH)
Gen MIH telah berhasil diidentifikasi dari DNA complementer (cDNA) sampel udang vaname L.vannamei dengan gel elektroforesis pada posisi 200 bp (Gambar 8). Selanjutnya dengan analisis BLAST-N diperoleh kemiripan/ similaritas sekuen sampel udang vaname sebesar 99% dan pemenuhan query
sebesar 88% (Tabel 4) dengan mRNA MIH1 Litopenaeus vannamei complete
(nomor aksesi DQ412566.1). Kemiripan dengan sekuen yang ada di BankGen sangat tinggi yaitu 99% artinya gen yang diidentifikasi sesuai dengan yang dirancang primernya. Kemiripan dengan sekuen spesies lain ditunjukkan pada hasil filogenetik yaitu dengan mRNA MIH1 L.vannamei (nomor aksesi DQ412566.1), mRNA MIH2 L.vannamei (nomor aksesi DQ412567.1), mRNA MIH1 P.monodon
(nomor aksesi AY496454.1) dan mRNA MIH P.semisulcatus (nomor aksesi AB810255.1).
Hasil ekspresi mRNA MIH1 L.vannamei pada PL2, PL10, PL20, dan PL30 cukup tinggi (Gambar 6). Hal ini menunjukkan adanya pertumbuhan dan perkembangan larva udang yang pesat, karena frekuensi ganti kulit pada fase pasca larva cukup tinggi sehingga ekspresi MIH cukup sering frekuensinya. Pada hepatopankreas tingkat ekspresi MIH 0,00, hal ini mengindikasikan bahwa MIH tidak diproduksi dan tidak bekerja di hepatopankreas. Sedangkan pada udang ganti kulit ekspresinya juga 0,00 karena MIH dilepaskan pada tahap intermolt atau sebelum molting sehingga pada sampel yang sedang ganti kulit MIH sudah dihentikan. Hal ini sesuai dengan pernyataan (Chung & Webster, 2005) bahwa pelepasan MIH hanya terbatas pada tahap intermolt yang akan berperan dalam menekan aktivitas ecdysteroid yang disintesis pada organ-Y pada krustase. Oleh karena itu pengurangan pelepasan MIH akan berdampak pada peningkatan sintesis
ecdysteroid yang menyebabkan berlanjutnya tahap premolt dan akhirnya ke tahap
molting.
Cyclophilin A (CypA)
Gen CypA telah berhasil diidentifikasi pada posisi 170 bp dari cDNA sampel udang vaname sebagai templat/cetakan (Gambar 8). Dengan teridentifikasi pada cDNA sampel udang vaname, membuktikan CypA ada dalam tubuh udang vaname. Setelah dilakukan analisis BLAST-N terhadap sekuen sampel diketahui mempunyai similaritas dengan sekuen mRNA CypA P.monodon dengan nomor aksesi EU164775.1 sebesar 91% dengan pemenuhan query 97% (Tabel 4).