BAHAN DAN METODE
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Analisis Kualitatif Bacillus pumilus
Isolat B. pumilus dari stok gliserol diremajakan pada media ASW padat yang mengandung substrat spesifik manan (LBG). Isolat yang tumbuh setelah inkubasi selama 72 jam memiliki bentuk koloni dengan warna putih kekuningan (Gambar 6a). Isolat yang telah tumbuh tersebut diuji kemampuannya untuk mendegradasi manan secara kualitatif.
Kemampuan isolat B. pumilus mendegradasi manan secara kualitatif dapat dilihat dari nilai indeks mananolitik hasil uji kualitatif menggunakan pewarnaan merah kongo. Hasil pengamatan menunjukkan isolat B. pumilus memiliki indeks mananolitik sebesar 4,33 (Gambar 6b).
Gambar 6 (a) Hasil peremajaan isolat B. pumilus pada media ASW padat dengan penambahan substrat spesifik manan (LBG). (b) Zona Bening
B. pumilus yang ditumbuhkan pada media ASW padat menggunakan LBG sebagai substrat dengan waktu inkubasi selama 5 hari.
Optimasi Waktu Produksi
Setelah diketahui kemampuan isolat menghasilkan enzim mananase secara kualitatif, selanjutnya isolat dikultur pada media ASW cair agar bisa diukur secara kuantitatif aktivitas enzim mananase yang dihasilkannya. Produksi enzim ini dilakukan sekaligus mengukur waktu produksi enzim yang paling tinggi dengan cara membuat kurva pertumbuhan berdasarkan turbiditas sel isolat B. pumilus. Uji
kuantitatif terhadap kemampuan B. pumilus menghasilkan enzim mananase dapat dilihat dari kurva aktivitas enzim dan turbiditas sel bakteri (Gambar 7).
Gambar 7 Kurva aktivitas enzim dan turbiditas B. pumilus yang diinokulasi pada media ASW pH 7 pada suhu 30°C dengan LBG 0,5 % (b/v) sebagai substrat. (-▲-) Pengukuran OD sel pada panjang gelombang 660nm. (-♦-) Aktivitas enzim mananase (U/mL).
Aktivitas enzim mananase dari jam ke-0 terus mengalami peningkatan tiap 24 jam hingga aktivitas enzimatis tertinggi didapat pada jam ke-72 sebesar 7,7 U/mL. Setelah jam ke-72 aktivitas enzimatis kembali menurun hingga jam ke- 120. Jumlah sel hasil pengukuran OD sel pada panjang gelombang 660 nm juga menunjukkan peningkatan dari jam ke-0 hingga jam ke-96. Fase eksponensial pertumbuhan isolat terlihat dimulai dari jam ke-24 hingga jam ke-96 sebelum memasuki fase stasioner. Dengan membandingkan antara grafik aktivitas enzimatis dengan kurva pertumbuhan, ditentukan waktu optimal untuk inkubasi isolat yang akan digunakan pada saat produksi enzim mananase adalah pada jam ke-72.
Produksi dan Pemekatan Enzim Mananase
Enzim mananase diproduksi pada skala 1 liter yang akan digunakan untuk pemurnian dan karakterisasi. Isolat dikultur pada media ASW cair dengan substrat LBG dengan menggunakan hasil optimasi waktu produksi sebagai patokan waktu inkubasi. Hasil perhitungan aktivitas enzim ekstrak kasar hasil produksi pada
0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 0 24 48 72 96 120 OD sel 660 n m A kt iv itas (U/m L) Jam ke-
skala 1 liter sebesar 3,24 U/mL dengan jumlah protein sebesar 3,55 mg/ml. Aktivitas spesifik enzim ekstrak kasar sebesar 0,91 U/mg.
Enzim ekstrak kasar didialisis untuk mengurangi garam – garam yang ada di media. Enzim hasil dialisis dipekatkan menggunakan ultrafiltrasi dan didapat nilai aktivitas enzimatis sebesar 5,1 U/mL dengan jumlah protein sebesar 3,54 mg/ml. Aktivitas spesifik enzim mananase hasil pemekatan dengan ultrafiltrasi sebesar 1,44 U/mg.
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah uji kualitatif yang dilakukan untuk mengetahui pola pemotongan enzim mananase isolat B. pumilus terhadap substrat manan tertentu. Noda dari sampel enzim mananase yang telah direaksikan dengan LBG pada berbagai waktu inkubasi yang berbeda dibandingkan dengan standar yang ada (Gambar 8). Hasil hidrolisis enzim mananase terhadap LBG tidak menunjukkan terbentuknya monomer manosa (M). Spot noda yang terbentuk menunjukkan pola pemotongan yang menghasilkan dimer dan oligomer manosa yaitu manobiosa, manotetraosa hingga manoheksaosa.
Gambar 8 Hasil KLT enzim mananase dengan substrat LBG (1:2) menggunakan standar manosa (M), manobiosa (M2), manotriosa (M3), manotetraosa (M4) dan manoheksaosa (M6). Perlakuan dengan perbedaan waktu inkubasi enzim yaitu 30 menit (1), 60 menit (2), 90 menit (3), 2 jam (4), 6 jam (5) dan 24 jam (6).
1 2 3 4 5 6 M M2 M3 M4 M6 M M2 M3 M4 M6
Kromatografi Gel Filtrasi
Pemurnian enzim dilakukan dengan menggunakan kromatografi gel filtrasi dengan matrik kolom sephadex G-75, dimana diharapkan protein pada enzim akan terpisah berdasarkan ukuran molekulnya. Jumlah protein fraksi enzim hasil gel filtrasi dihitung dari nilai absorbansi pada panjang gelombang 280 nm dan aktivitas enzimatis dihitung dengan menggunakan metoda Miller (Gambar 9). Fraksi yang ditampung mulai memperlihatkan aktivitas enzimatis pada fraksi ke- 21, hingga puncak tertinggi didapat pada fraksi ke 31. Hal yang sama ditunjukkan oleh kadar protein yang terhitung, dimana fraksi dengan kadar protein tertinggi ada pada fraksi ke-30. Tiga fraksi hasil koleksi dengan aktivitas enzimatis dan kadar protein tertinggi dikumpulkan. Aktivitas enzimatis fraksi tertinggi yang didapat sebesar 4,2 U/mL dengan kadar protein sebesar 1,05 mg/mL. Aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian dengan kromatografi gel filtrasi sebesar 4,0 U/mg.
Gambar 9 Kurva fraksi hasil kromatografi gel filtrasi B. pumilus pada kolom matrik sephadex G-75, dengan laju alir bufer fosfat 0,02 M pH 7,2 1mL/menit. (----) aktivitas enzimatis enzim hasil kolom untuk masing- masing fraksi. ( ) jumlah protein hasil pengukuran OD 280 nm.
Hasil pemurnian enzim mananase B. pumilus dari tiap tahap pemurnian dapat dilihat di Tabel 3. Aktivitas spesifik mengalami peningkatan dari tiap tahap pemurnian dimana setelah mengalami tahap gel fitrasi enzim memiliki aktivitas spesifik sebesar 4,0 U/mg. Kromatografi gel filtrasi meningkatkan kemurnian enzim mananase sebesar 4,38 x dibanding enzim ekstrak kasar. Perolehan enzim
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1 21 41 61 81 A kt iv itas (U/m L) OD 280 n m Fraksi ke-
hasil pemurnian menggunakan kromatografi gel filtrasi sebesar 4,44% dari enzim ekstrak kasarnya.
Tabel 3 Pemurnian enzim mananase dari B. pumilus Tahap Pemurnian Volu me (mL) Aktivitas Mananase (U/mL) Aktivitas Total (Unit) Konsentrasi Protein (mg/mL) Protein Total (mg) Aktivitas Spesifik (U/mg) Perolehan (%) Tingkat Kemurnian Ekstrak Kasar 20 3,2 64,81 3,55 71,02 0,91 100 1,00 Ultrafiltrasi 7,5 5,1 38,19 3,54 26,56 1,44 37,39 1,58 Gel Filtrasi 3 4,2 12,60 1,05 3,15 4,00 4,44 4,38 SDS-PAGE
Berat molekul protein enzim mananase hasil pemurnian kromatografi gel filtrasi ditentukan menggunakan metode SDS-PAGE dengan pewarnaan perak untuk menampilkan hasilnya. Hasil pemisahan protein dapat dilihat pada gambar 10. Kolom A adalah penanda protein dengan ukuran 10-200 kDa, kolom B adalah hasil pemurnian dengan kromatografi, kolom C enzim hasil pemekatan dengan ultrafiltrasi dan kolom D enzim ekstrak kasar. Terdapat 1 pita yang jelas dengan beberapa pita yang smear. Menggunakan perbandingan nilai Rf dengan penanda maka diperkiraan ukuran pita protein tersebut 30,17 kDa.
Gambar 10 SDS PAGE (12,5% poliakrilamid) pemurnian enzim mananase dari
B. pumilus. A adalah penanda protein dengan ukuran 200 kDa. B adalah enzim mananase hasil pemurnian kromatografi gel filtrasi (4,72 µg/mL). C enzim mananase hasil ultrafiltrasi (3,96 µg/mL). D enzim ekstrak kasar (0,72 µg/mL). Penanda protein yang digunakan sebanyak 15 µL sedangkan untuk sampel B, C dan D digunakan 20 µL sampel. 20 50 25 10 10 A B C D
Pengaruh pH dan Suhu
Karakterisasi terhadap enzim dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum enzim mananase isolat B. pumilus hasil pemurnian pada substrat LBG.
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim dapat dilihat pada gambar 11a sedangkan pengaruh suhu pada gambar 11b. Enzim memperlihatkan aktivitas tertinggi pada pH 5,0 (Gambar 11a). Aktivitas tertinggi enzim pada suhu 40°C, walaupun masih menunjukkan aktivitas yang baik hingga suhu 60°C (Gambar 11b).
Gambar 11 Pengaruh pH (A) dan suhu (B) terhadap aktivitas enzim mananase dari
B. pumilus hasil kromatografi gel filtrasi. (A) Reaksi enzimatis di lakukan pada pH antara 3,0 – 9,0 ( 0,02 M sitrat pH 3,0 – 5,5; 0,02 M fosfat pH 6,0 – 8,0; 0,02 glycine-NaOH pH 8,5 – 9,0) pada suhu 30°C selama 30 menit. (B) Reaksi enzimatis dilakukan pada berbagai temperatur dari 30°C hingga 80°C selama 30 menit pada pH 7,2.
Kinetika Reaksi (Km dan Vmax)
Konstanta Michaelis Menten (Km) dan kecepatan reaksi maksimum (Vmax) didapat dengan mereaksikan enzim mananase hasil kromatografi gel filtrasi pada kondisi pH dan suhu optimumnya. Reaksi enzimatis dilakukan menggunakan substrat spesifik manan (LBG) pada berbagai tingkatan konsentrasi. Data perhitungan untuk berbagai tingkat konsentrasi substrat (Tabel 4) kemudian diplot kedalam persamaan garis regresi antara nilai 1/[S] terhadap nilai 1/V sehingga diperoleh persamaan linearnya (Gambar 12).
Persamaan regresi yang didapat Y = 4,558X + 46,585 dengan nilai R2 = 0,8309 diplot ke dalam resiprokal Lineweaver-Burk untuk mendapatkan nilai Km dan Vmax. Menggunakan plot resiprokal Lineweaver-Burk didapat nilai konstanta Michaelis (Km) dan kecepatan reaksi maksimum (Vmax) sebesar 0,10 mg/mL dan 0,02 U/mg secara berurutan.
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 Ak tiv it a s (U/m L ) pH 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 30 40 50 60 70 80 Ak tiv it a s (U/m L ) Suhu
B
A
Tabel 4 Data perhitungan penentuan nilai Km dan Vmaks
No [S] 1/[S] Vi 1/Vi Persamaan Regresi
1 0,10 10,0 0,0113 88,50 Y=0,0113x + 0,923 2 0,25 4,0 0,0134 74,63 Y=0,0185x + 0,923 3 0,50 2,0 0,0170 58,82 Y=0,0170x + 2,315 4 0,75 1,3 0,0185 54,05 Y=0,0134x + 1,929 5 1,00 1,0 0,0247 40,49 Y=0,0247x + 4,784
Gambar 12 Persamaan linear antara 1/[S] terhadap 1/Vi
Pembahasan
B. pumilus adalah salah satu spesies Bacillus yang banyak terdapat di lautan (Parvathi et al. 2009), karena B. pumilus memiliki daya tahan yang tinggi terhadap kondisi lingkungan ekstrim seperti ketersediaan nutrisi rendah, intensitas sinar tinggi, kandungan H2O2 dan paparan bahan kimia (Nicholson et al. 2000). Bacillus pumilus mampu menghasilkan enzim protease pada kondisi garam tinggi (NaCl 4 M, KCl 4 M) dan tetap mempertahankan aktivitasnya hingga 80% (Suhartono et al. 1997).
Isolat B. pumilus yang digunakan sebagai mikroorganisme penghasil enzim mananase adalah hasil isolasi dari pulau Pari di Teluk Jakarta dengan tujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri laut menghasilkan enzim mananase (Djohan 2012). Hasil penapisan awal secara kualitatif menunjukkan kemampuan isolat ini untuk mendegradasi manan. Araujo dan Ward (1990), Aurora et al.
(2003) sebelumnya juga telah melaporkan kemampuan B. pumilus dari isolat darat y = 4.558x + 46.585 R² = 0.8309 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 1 /Vi 1/[S]
untuk menghasilkan enzim mananase. Kemampuan isolat B. pumilus dari laut menghasilkan enzim mananase lebih lanjut belum diketahui.
Nilai indeks mananolitik B. pumilus asal laut ini hampir sama dengan nilai indeks yang dilaporkan oleh Seftiono (2008) dari Streptacidiphilus luteoalbus
dengan nilai indeks sebesar 4, Setianingrum (2009) dari Streptomyces purpurascens dengan nilai indeks 5 dan Sari (2011) dari Saccharopolyspora flava
dengan nilai indeks sebesar 4,63. Hasil analisis kualitatif yang menunjukkan terbentuknya zona bening dan nilai indeks yang cukup besar mengindikasikan bahwa isolat mampu menghasilkan enzim khususnya endo mananase.
Uji kualitatif menggunakan pewarna merah kongo adalah uji kualitatif yang baik, karena penggunaan merah kongo dengan konsentrasi 1% (b/v) selama 15 menit akan memunculkan zona bening yang kontras. Uji kualitatif dengan pewarna merah kongo adalah uji spesifik untuk endo-enzim karena tidak terbentuknya zona bening saat menggunakan α-galaktosidase sebagai substrat dan hanya terjadi sedikit peningkatan intensitas warna dengan β-manosidase sebagai substrat. Konsentrasi substrat juga mempengaruhi terbentuknya zona bening dimana diameter zona akan berkurang secara linear seiring dengan penambahan konsentrasi 0,1–1,0% (b/v) pada substrat galaktomanan (Downie et al. 1994).
Kurva aktivitas enzimatis menunjukkan kemampuan isolat menghasilkan enzim mananase secara kuantitatif. Hasil perbandingan kurva aktivitas enzimatis dengan kurva turbiditas pertumbuhan akan menunjukkan waktu produksi enzim yang optimum. LBG digunakan selain untuk sumber karbon, juga berfungsi sebagai substrat spesifik manan. Kurva turbiditas pertumbuhan isolat sejalan dengan aktivitas enzimatis yang dihasilkan. Dari jam ke-0 hingga jam ke-72 (Gambar 7) terlihat penambahan jumlah sel seiring dengan peningkatan aktivitas enzim. Seiring dengan pertumbuhan sel maka akan semakin banyak sel yang akan memproduksi enzim untuk mendegradasi substrat sebagai sumber karbon bagi pertumbuhan isolat. Peningkatan aktivitas enzim akan menemui titik jenuh pada saat konsentrasi substrat semakin berkurang tetapi sel tetap memproduksi enzim. Akhirnya enzim akan menjadi lambat aktivitasnya (Bintang 2010). Hal tersebut terlihat pada jam ke-72 dimana aktivitas enzim turun saat kurva pertumbuhan masih mengalami peningkatan.
Aktivitas enzim terukur yang didapat dinyatakan dalam satuan unit (U) dengan tingkat kemurnian enzim yang dapat dilihat dari nilai aktivitas spesifiknya (Bintang 2010). Aktivitas enzimatis dan aktivitas spesifik enzim akan sangat beragam tergantung asal isolat dan jenis substrat yang digunakan. Aktivitas enzimatis dan aktivitas spesifik dari sesama B. pumilus yang telah dilaporkan oleh Araujo dan Ward (1990) sebesar 78 U/mg serta Aurora et al. (2003) sebesar 0,2 U/mg. Aktivitas spesifik tersebut menunjukkan nilai yang berbeda walaupun menggunakan LBG sebagai substrat. Laporan lain juga menunjukkan nilai aktivitas enzimatis dan aktivitas spesifik yang berbeda pada golongan Bacillus
seperti B. Stearothermophilus (Talbot & Sygusch 1990) sebesar 97 U/mg pada substrat LBG dan B. amylolequifaciens (Mabrouk & El Ahnawy 2008) sebesar 61,5 U/mg pada substrat limbah kulit kentang.
Analisis kualitatif hidrolisis LBG menggunakan enzim mananase isolat B. pumilus mengindikasikan bahwa enzim termasuk ke dalam tipe enzim endo- mananase. Noda pada KLT menunjukkan hasil hidrolisis LBG sebagai sumber manan menghasilkan manobiosa dan manotetraosa hingga manoheksaosa, tapi tidak menunjukkan ada terbentuknya molekul manosa. Sebagian besar laporan menunjukkan enzim mananase yang bersifat endo pada substrat LBG (Talbot & Sygusch 1990, Blibech et al. 2010, 2011), meskipun ada juga laporan mengenai mananase dengan tipe ekso-mananase (Jones & Ballou 1969).
Hasil karakterisasi enzim mananase dari isolat B. pumilus menunjukkan bahwa enzim ini aktif bekerja pada kondisi pH sedikit asam, sehingga sedikit berbeda dengan beberapa bakteri lain penghasil enzim mananase yang pernah dikarakterisasi (Tabel 5). Umumnya enzim mananase dari bakteri memiliki pH optimum pada kisaran pH normal, tapi pH optimum enzim mananase B. pumilus
mirip dengan enzim mananase dari Rhodotermus marinus yaitu pada pH 5,4 dimana bakteri ini juga berasal dari laut seperti isolat B. pumilus. Piontek et al.
(2009) menunjukkan bahwa degradasi polisakarida oleh enzim ekstraseluler bakteri secara signifikan dipercepat selama simulasi percobaan pengasaman samudra. Optimasi suhu memperlihatkan bahwa enzim mananase dari isolat B. pumilus bukanlah enzim termostabil dimana enzim mananase dari isolat tersebut
memiliki aktivitas tertinggi pada suhu 40 °C, walaupun aktivitasnya masih tinggi hingga suhu 60 °C.
Tabel 5 Perbandingan karakter beberapa enzim mananase asal bakteri Nama Bakteri BM (kDa) pH Optimum Suhu Optimum Asal Bakteri Acuan
Vibrio sp. Strain MA-138 49 6,5 40 Rumput Laut Tamaru et al. 1995
Thermotaga neapolitana 5068 61 7,1 92 DSMa Duffaud et al. 1997
Bacillus stearothermophilus 74 6,5 70 ATCCb Ethier et al. 1998
Bacillus subtilis KU-1 40 7,0 55 Kyoto Univ. Zakaria et al. 1998
Rhodotermus marinus 45 5,4 75 ATCCb Politz et al. 2000
a
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Germany
b
American Type Culture Collection
Hasil SDS-PAGE menunjukkan adanya sebuah pita protein yang jelas terbentuk. Berat molekul dari pita protein tersebut berdasarkan nilai Rf terhadap penanda protein adalah sebesar 30,17 kDa. Pita tunggal ini didapat dari enzim hasil pemurnian menggunakan kromatografi gel filtrasi. Berat molekul dari isolat
B. pumilus ini termasuk kecil jika dibandingkan dengan beberapa isolat lain penghasil enzim mananase (Tabel 5) dimana berat molekul enzim mananase dari
B. stearothermophilus adalah 74 kDa dan bakteri penghasil mananase yang lain rata-rata memiliki berat molekul 45 kDa. Pita tunggal ini walaupun dengan nilai berat molekul kecil, merupakan enzim mananase yang aktif pada substrat LBG.
Hasil dari SDS-PAGE juga menunjukkan adanya pita protein yang smear, artinya pita tersebut ada tapi hanya berupa bayangan pada gel hasil SDS-PAGE. Pita smear ini terlihat pada kolom enzim hasil pemurnian gel filtrasi, dimana pita smear tersebut mengindikasikan ada enzim mananase dari isolat B. pumilus hasil pemurnian kromatografi gel filtrasi belum terlalu murni. Kromatografi gel filtrasi hanya mampu memurnikan secara parsial enzim mananase yang diperoleh.
Hasil perhitungan kinetika reaksi menunjukkan enzim mananase dari
B.pumilus ini kurang mampu memanfaatkan substrat LBG secara maksimal. Grafik persamaan linear antara nilai konsentrasi substrat (1/[S]) dengan kecepatan reaksi (1/Vi) memperoleh nilai R2 sebesar 0,8309. Nilai R2 berfungsi menjelaskan keselarasan model regresi yang dibuat, dimana nilai R2 yang semakin dekat ke angka 1 berarti model regresi semakin baik. Nilai R2 dari persamaan linear enzim
mananase menunjukkan bahwa konsentrasi substrat hanya bisa menjelaskan kecepatan reaksi sebesar 0,8309 atau 83,09%. Hal ini berarti substrat LBG belum mampu digunakan oleh isolat B. pumilus secara maksimal, dimana ada beberapa faktor yang belum mampu dijelaskan oleh model persamaan regresi linear yang telah dibuat.
Kurang baiknya nilai persamaan regresi linear yang dibuat dalam menjelaskan hubungan antara konsentrasi substrat dengan kecepatan reaksi juga dapat dilihat dari nilai Km dan Vmax yang diperoleh. Nilai Km dan Vmax yang kecil dibanding bakteri lain penghasil enzim mananase (Tabel 6) memberi indikasi bahwa LBG belum mampu dimanfaatkan secara maksimal. Penggunaan substrat lain yang lebih sederhana seperti b-manan atau manan murni mungkin akan memperlihatkan kemampuan optimal enzim mananase isolat ini dalam mendegradasi manan.
Tabel 6 Perbandingan nilai Km dan Vmax beberapa enzim mananase asal bakteri
Nama Bakteri Acuan Km
(mg/mL)
Vmax
(U/mg) Substrat
Vibrio sp. Strain MA-138 Tamaru et al. 1995 10 450 b-manan
Thermotaga neapolitana 5068 Duffaud et al. 1997 0,55 3,8 LBG
Rhodotermus marinus Politz et al. 2000 1,9 3524 LBG