Hasil
Uji fitokimia
Dari hasil uji fitokimia pada masing-masing pelarut diketahui bahwa secara keseluruhan ekstrak kulit batang Rhizophora mucronata mengandung senyawa metabolit sekunder seperti senyawa fenolik (tanin), steroid/ terpen, alkaloid dan saponin. Senyawa-senyawa tersebut akan terlarut pada pelarut yang mempunyai tingkat kepolaran yang sama dengan senyawa tersebut seperti yang terlihat pada Tabel 2 dan Gambar 8 berikut ini.
Tabel 2. Hasil identifikasi kandungan fitokimia pada ekstrak kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata
Keterangan :
H = ekstrak dengan pelarut n-Heksana ET = ekstrak dengan pelarut Etil asetat M = ekstrak dengan pelarut Metanol (+ +) = Kuat (+) = Sedang (-) = Tidak ada Kode Sampel METABOLIT SEKUNDER Fenolik / Flavonoid / Tanin
Terpen / Steroid Alkaloid
Saponin
Pereaksi Hasil Pereaksi Hasil Pereaksi Hasil Pereaksi Hasil
H FeCl3 (-) Liberman-Bouchard (-) Bouchardat (-) Ekstrak + Aqua + HCl (-) Cerium sulfat (CeSO4)/TL (-) C Wagner (-) Meyer (-) Dragendorf (-) ET FeCl3 (-) Liberman-Bouchard (+) Bouchardat (-) Ekstrak + Aqua + HCl (+) Cerium sulfat (CeSO4)/TL (+) C Wagner (-) Meyer (+) Dragendorf (+ +) M FeCl3 (+) Liberman-Bouchard (+) Bouchardat (-) Ekstrak + Aqua + HCl (+ +) Cerium sulfat (CeSO4)/TL (+) C Wagner (-) Meyer (-) Dragendorf (+ +)
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g)
Gambar 8. Hasil uji fitokimia; (a) ekstrak metanol positif saponin (b) ekstrak metanol positif tanin (c) ekstrak metanol positif alkaloid dengan pereaksi Dragendorf (d) ekstrak etil asetat positif alkaloid dengan pereaksi Dragendorf dan (e) dengan pereaksi Meyer (f) ekstrak etil asetat positif saponin (g) ekstrak metanol dan etil asetat positif steroid/terpen pada uji TLC.
Ekstraksi
Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi/perendaman serbuk kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata menggunakan pelarut n-heksana, etil asetat dan metanol. Hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata tersaji dalam Tabel 3 di bawah ini.
Tabel 3. Hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata.
No. Hasil Metanol Etil asetat n-Heksana
1. Berat sampel (gram) 300 300 870
2. Berat ekstrak (gram) 5,0505 1,2183 0,87
3. Bentuk Pasta Pasta kering Pasta agak cair
4. Warna Merah kehitaman Cokelat kemerahan Hijau kekuningan
Uji toksisitas artemia
Toksisitas ekstrak kulit batang R. mucronata dapat diketahui dengan melakukan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Data hasil uji BSLT ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana dari kulit batang R. mucronata disajikan pada Tabel 4 berikut ini.
Tabel 4. Data hasil uji BSLT ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana dari kulit batang Rhizophora mucronata
Perlakuan Konsentrasi (ppm) Total Populasi Jumlah Kematian Persen Mortalitas (%) Log Konsentrasi Probit LC (ppm) 50 Etil asetat 1000 30 30 100 3 8,09 21,06 100 30 20 66,66 2 5,41 10 30 13 43,33 1 4,82 Metanol 1000 30 30 100 3 8,09 24,59 100 30 16 53,33 2 5,08 10 30 13 43,33 1 4,82 N-heksana 1000 30 30 100 3 8,09 27,38 100 30 19 63,33 2 5,33 10 30 10 33,33 1 4,56
Uji aktifitas antimikroba
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram yang menggunakan blank disc ukuran 6 mm. Aktivitas antibakteri dapat terlihat dengan mengamati zona bening yang terbentuk disekitar cakram dan menghambat pertumbuhan bakteri setelah masa inkubasi selama 24 jam. Besarnya daya antibakteri dapat diketahui dengan mengukur zona bening yang terbentuk dan mengurangkannya dengan diameter blank disc. Zona bening dan Rata-rata diameter zona hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri A. hydrophila dan bakteri S. agalactiae disajikan pada Tabel 5, Gambar 9 dan Gambar 10 di bawah ini.
Tabel 5. Rata-rata diameter zona hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap bakteri A. hydrophila dan bakteri S. agalactiae
Bakteri Ekstrak dengan pelarut
Rata-rata diameter zona hambat (mm) 60% 40% 20% Kontrol A. hydrophila Metanol 0 0 0 N-heksana 10,91 7,36 0 Etil asetat 10,58 7,65 7,21 Kloramfenikol 34,88 DMSO 0 S. agalactiae Metanol 15,5 14,2 14,45 N-heksana 0 0 0 Etil asetat 23,81 18,56 19,25 Kloramfenikol 43,4 DMSO 0 (a) (b) (c) (d) (e)
Gambar 9. Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri A. hydrophila; (a) ekstrak dengan pelarut n-heksana (b) ekstrak dengan pelarut metanol (c) ekstrak dengan pelarut etil asetat (d) kontrol positif/kloramfenikol (e) kontrol negatif (DMSO)
(a) (b) (c)
(d) (e)
Gambar 10. Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri S. agalactiae; (a) ekstrak dengan pelarut n-heksana (b) ekstrak dengan pelarut metanol (c) ekstrak dengan pelarut etil asetat (d) kontrol positif/kloramfenikol (e) kontrol negatif (DMSO)
Sementara itu hasil pengujian ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan jamur Saprolegnia sp. menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mampu menghambat pertumbuhan hifa dari jamur tersebut. Besarnya daya hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan jamur Saprolegnia sp. dapat diketahui dengan menghitung jari-jari pertumbuhan normal hifa jamur yang dikurangi dengan jari-jari pertumbuhan hifa jamur yang terhambat oleh ekstrak kulit batang R. mucronata. Pengamatan terhadap pertumbuhan jamur Saprolegnia sp. dilakukan selama 3 hari sampai hifa normal tumbuh menutupi cawan petri. Rata-rata jari-jari zona hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap jamur Saprolegnia sp. dapat dilihat pada Tabel 6 dan Gambar 11 di bawah ini.
Tabel 6. Rata-rata jari-jari zona hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap jamur Saprolegnia sp.
Hari ke Konsentrasi Zona hambat (mm) ekstrak R. mucronata dengan berbagai pelarut
Metanol N-heksana Etil asetat Nistatin DMSO
1 60% 4,4 1 4 2 0 40% 3,4 0 3,7 20% 3,4 0 3 Kontrol 2 60% 21 2,6 21,7 2 0 40% 20,6 2,6 20 20% 19,6 1,3 19,4 Kontrol 3 60% 19 0 30,7 0 0 40% 8,7 0 29,4 20% 4,4 0 20 Kontrol (a) (b) (c) (d) (e)
Gambar 11. Hasil pengujian antibakteri terhadap jamur Saprolegnia sp.; (a) ekstrak dengan pelarut n-heksana (b) ekstrak dengan pelarut metanol (c) ekstrak dengan pelarut etil asetat (d) kontrol positif/kloramfenikol (e) kontrol negatif (DMSO)
Pembahasan Uji fitokimia
Uji fitokimia merupakan salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu ekstrak tanaman atau merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti senyawa alkaloid, fenolik (tanin dan flavonoid), terpen/steroid, dan saponin. Golongan senyawa dalam ekstrak dapat ditentukan dengan mengamati perubahan warna dan terbentuknya endapan setelah ditambahkan pereaksi yang spesifik untuk setiap uji kualitatif. Pemilihan pelarut dalam proses ekstraksi harus memperhatikan sifat kandungan kimia bahan yang akan diekstrak. Dengan mengetahui sifat metabolit yang akan diekstrak dapat dipilih pelarut yang sesuai berdasarkan kepolaran zatnya (Sari, 2008). Dalam penelitian ini digunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu pelarut metanol (polar), etil asetat (semi polar) dan n-heksana (nonpolar).
Dari hasil uji fitokimia (Tabel 2) diketahui bahwa senyawa alkaloid, terpen/steroid dan saponin terkandung di dalam ekstrak metanol dan etil asetat kulit batang R. mucronata. Sedangkan untuk senyawa golongan fenolik hanya terdapat pada ekstrak metanol. Flavonoid dan tanin merupakan bagian dari senyawa fenolik. Tertariknya senyawa golongan fenolik karena pelarut metanol merupakan pelarut yang bersifat universal yang dapat menarik sebagian besar senyawa kimia dalam tanaman. Hal ini disebabkan karena metanol memiliki gugus polar (-OH) dan gugus nonpolar (-CH3) sehingga dapat menarik analit-analit yang bersifat polar dan nonpolar (Astarina dkk., 2013). Diduga senyawa fenolik yang tertarik dalam ekstrak metanol adalah tanin karena pada saat
pengujian dengan FeCl3 1% ekstrak metanol menunjukkan reaksi positif dengan
berubahnya warna ekstrak menjadi hitam kehijauan. Marlinda dkk. (2012) menyatakan dalam penelitiannya bahwa ekstrak etanol biji buah alpukat (Persea americana Mill.) positif mengandung tanin yang ditandai dengan perubahan warna ekstrak menjadi hitam kehijauan setelah penambahan 2 – 3 tetes larutan FeCl3 1% . Pada penambahan larutan FeCl3
Menurut Lisdawati dkk. (2006), senyawa-senyawa yang larut dalam pelarut semi polar diantaranya adalah senyawa alkaloid, senyawa flavanoid, senyawa kumarin dan golongan asam lemak. Untuk melihat ada tidaknya senyawa flavanoid yang terkandung dalam ekstrak kulit batang R. mucronata maka dilakukan pengujian terhadap ekstrak etil asetat dengan pereaksi FeCl
1% diperkirakan larutan ini bereaksi dengan salah satu gugus hidroksil yang ada pada senyawa tanin.
3 1%.
Reaksi dengan besi (III) klorida (FeCl3) telah digunakan secara luas untuk
mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi tidak dapat dipakai untuk membedakan macam-macam golongan (Robinson, 1995). Penambahan pereaksi FeCl3
Senyawa alkaloid yang terkandung di dalam ekstrak metanol ditandai dengan adanya reaksi positif pada pereaksi Dragendorff yang menimbulkan endapan seperti pada Gambar 8 (c). Sedangkan pada pereaksi Bouchardat, Wagner dan pereaksi Mayer diperoleh hasil negatif (tidak terjadi perubahan warna dan endapan). Untuk ekstrak dengan pelarut etil asetat senyawa alkaloid ditandai dengan adanya perubahan warna dan endapan pada pereaksi Mayer (Gambar 8
1% dalam ekstrak etil asetat kulit batang R. mucronata tidak merubah warna ekstrak menjadi biru atau hitam kehijauan, hal ini mengindikasikan bahwa senyawa flavanoid tidak terdapat dalam ekstrak kulit batang R. mucronata.
(e)) dan pereaksi Dragendorff (Gambar 8 (d)). Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Ningsih dkk. (2006) yang melaporkan bahwa fraksinasi ekstrak kasar metanol kulit batang R. mucronata dihasilkan fraksi-fraksi yang mengandung senyawa golongan alkaloid.
Hasil positif alkaloid pada uji Dragendorff ditandai dengan terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning. Endapan tersebut adalah kalium-alkaloid yang terjadi akibat atom nitrogen yang mempunyai pasangan elektron bebas pada alkaloid membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion logam K+ dari kalium tetraiodobismutat membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap. Sedangkan hasil positif alkaloid pada uji Mayer ditandai dengan terbentuknya endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kalium-alkaloid. Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer, diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+
Uji senyawa saponin diperoleh hasil positif pada ekstrak metanol dan etil asetat yang ditandai dengan adanya buih stabil setinggi 1 – 10 cm selama 10 menit dan buih tidak hilang dengan penambahan 1 tetes HCl 2 N seperti Gambar 8 (a) untuk ekstrak metanol dan Gambar 8 (f) untuk ekstrak etil asetat. Saponin adalah senyawa polar yang keberadaanya dalam tumbuhan dapat diekstraksi dengan pelarut semi polar dan polar (Oesman dkk., 2010).
dari kalium tetraiodomerkurat(II) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Marliana dkk., 2005).
Senyawa terpen/steroid positif terkandung di dalam ekstrak metanol dan etil asetat yang ditandai dengan perubahan warna hijau untuk steroid dan warna ungu untuk triterpenoid dengan pereaksi Lieberman-Bouchard. Senyawa terpen/steroid kemudian diuji dengan metode TLC menggunakan pereaksi CeSO4
1%. Hasil positif terdapat pada ekstrak metanol dan etil asetat yang ditandai dengan perubahan warna ekstrak yang menyerupai warna standar triterpenoida
dan β-sitosterol. Diastuti dan Suwandri (2009) melaporkan dalam penelitiannya bahwa fraksi kloroform ekstrak metanol kulit batang R. mucronata positif terhadap terpenoid.
Untuk hasil uji fitokimia ekstrak n-heksana terhadap senyawa golongan alkaloid, fenolik (tanin dan flavonoid), terpen/steroid dan saponin didapatkan hasil yang negatif (Tabel 2). Hasil tersebut bukan berarti tidak ada senyawa apapun di dalam ekstrak n-heksana, sebab ekstrak tersebut masih berupa ekstrak kasar dan masih ada kemungkinan terdapatnya senyawa-senyawa nonpolar lainnya di dalam ekstrak n-heksana yang tidak diujikan dalam penelitian ini. Seperti yang diungkapkan oleh Lisdawati dkk. (2006), bahwa senyawa metabolit sekunder yang larut dalam pelarut nonpolar adalah golongan minyak atsiri, asam lemak tinggi, terpen/steroid dan karotenoid. Keberadaan senyawa-senyawa nonpolar yang tidak teridentifikasi tersebut akan nampak pengaruhnya pada uji selanjutnya.
Ekstraksi
Ekstraksi adalah pemisahan satu atau beberapa bahan dari suatu padatan atau cairan dengan menggunakan bantuan pelarut. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-komponen dalam campuran (Novia dkk., 2009). Ekstraksi pada penelitian ini menggunakan metode maserasi. Maserasi merupakan proses perendaman sampel menggunakan pelarut. Selama perendaman terjadi peristiwa plasmolisis yang menyebabkan terjadi pemecahan dinding sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel, sehingga senyawa
yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan proses ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang diinginkan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektivitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam dalam pelarut tersebut (Nurdiansyah dan Abdi, 2011). Dalam penelitian ini digunakan pelarut metanol (polar), etil asetat (semi polar) dan n-heksana (nonpolar) untuk menarik senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam kulit batang R. mucronata berdasarkan kepolarannya.
Lama waktu perendaman yang dimaksud dalam proses maserasi adalah lama waktu yang dibutuhkan untuk mencapai keseimbangan antara bahan/senyawa yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan bagian di luar sel/pelarut. Pada proses maserasi ini pengadukan secara berkala dapat mempercepat tercapainya keseimbangan antara pelarut dan sampel, memperbesar luas kontak dan meratakan proses ekstraksi (Akbar, 2012). Dalam penelitian ini maserasi dilakukan selama ± 24 jam dengan pengadukan berkala.
Setelah proses maserasi selesai senyawa yang terlarut dalam masing-masing pelarut kemudian dipisahkan dengan pelarutnya dengan rotary vacum evaporator. Vacum dalam rotary evaporator berfungsi untuk mempermudah poses penguapan pelarut dengan memperkecil tekanan dalam vacum dari pada di luar ruangan sehingga temperatur di bawah titik didih pelarut dapat menguap (Taofik dkk., 2010). Dengan alat ini maka senyawa metabolit sekunder yang telah diekstraksi dapat terhindar dari kerusakan yang disebabkan oleh panas yang tinggi saat proses penguapan pelarutnya. Setelah itu ekstrak dipekatkan dengan waterbath.
Dari hasil ekstraksi kulit batang tumbuhan Rhizophora mucronata (Tabel 3) didapatkan ekstrak n-heksana sebesar 0,87 gram dari 870 gram sampel, berbentuk pasta agak cair dan berwarna hijau kekuningan. Ekstrak etil asetat didapatkan sebesar 1,2183 gram dari 300 gram sampel, berbentuk pasta kering dan berwarna cokelat kemerahan. Untuk ekstrak metanol didapatkan sebesar 5,0505 gram dari 300 gram sampel dalam bentuk pasta dan berwarna merah kehitaman. Perbedaan jumlah sampel yang digunakan pada proses ekstraksi disebabkan oleh adanya perbedaan kemampuan pelarut dalam menghasilkan jumlah ekstrak yang dibutuhkan dalam proses uji toksisitas dan uji antimikroba selanjutnya. Ekstrak metanol kulit batang R. mucronata merupakan ekstrak dengan hasil tertinggi sedangkan ekstrak n-heksana merupakan ekstrak dengan hasil terendah yang menggunakan sampel dengan jumlah yang paling banyak. Hapsari dan Partomuan (2010) menyatakan bahwa banyaknya senyawa kimia yang tersari ke dalam pelarut sangat berpengaruh terhadap jumlah ekstrak yang dihasilkan. Elya dkk. (2009) menambahkan bahwa perbedaan kandungan pada ekstrak disebabkan karena perbedaan sifat kepolaran dari golongan senyawa-senyawa kimia tersebut. Hal inilah yang menyebabkan pelarut n-heksana menghasilkan ekstrak yang sedikit karena dari senyawa-senyawa yang diperiksa pada uji fitokimia, ekstrak n-heksana menunjukkan hasil negatif namun tidak menutup kemungkinan terdapatnya senyawa nonpolar lainnya yang tidak diperiksa dalam penelitian ini.
Uji toksisitas
Uji toksisitas pada penelitian ini menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yaitu suatu metode untuk menguji bahan-bahan/zat aktif tanaman yang bersifat sitotoksik dengan melihat kematian dari Artemia salina
Leach. Metode ini sering digunakan untuk penapisan awal terhadap senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak perlu kondisi aseptik) dan dapat dipercaya (Meyer dkk., 1982).
Dalam pelaksanaanya telur A. salina sebanyak 3 sendok teh ditetaskan dalam air laut buatan sebanyak 3 liter. Penggunaan air laut buatan ini untuk mengontrol bahwa air laut yang digunakan tidak terkontaminasi atau tercemar sebab jika menggunakan air laut asli dikhawatirkan terdapat cemaran atau kontaminasi. Air laut dibuat dengan cara melarutkan garam yang tidak beryodium sebanyak 105 gram ke dalam 3 liter air tawar untuk mendapatkan salinitas 35 ppt. Adi dkk. (2006) menyatakan bahwa sista A. salina akan menetas jika ada hidrasi dengan salinitas 30 – 35 ppt. Setelah 15 – 20 jam pada suhu 25°C telur akan menetas menjadi embrio. Dalam waktu beberapa jam embrio ini masih akan tetap menempel pada kulit telur. Pada fase ini embrio akan menyelesaikan perkembangannya kemudian berubah menjadi naupli yang sudah bisa berenang bebas. Pada awalnya naupli akan berwarna oranye kecoklatan akibat masih mengandung kuning telur.
Setelah 24 jam menetas, cadangan makanan larva habis. Seiring dengan itu organ-organ artemia sudah terbentuk lengkap termasuk mulut, saluran pencernaan dan dubur (Panjaitan, 2011). Atas dasar inilah maka A. salina yang digunakan dalam penelitian ini adalah yang berumur 48 jam sehingga kematian artemia benar-benar disebabkan oleh ekstrak kulit batang R. mucronata.
Artemia yang berumur 48 jam tersebut kemudian dimasukkan sebanyak 10 ekor ke dalam masing-masing vial uji 1000 ppm, 100 ppm dan 10 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 ulangan termasuk kontrol negatif (air laut) dan
kontrol positif (DMSO) karena dalam pembuatan konsentrasi uji, ekstrak dilarutkan dengan DMSO. Sulfoxide Dimetil (DMSO), adalah senyawa organosulfur dengan rumus (CH3)2SO. Cairan tidak berwarna ini merupakan
pelarut polar aprotik yang dapat melarutkan baik senyawa polar dan nonpolar serta larut dalam berbagai pelarut organik maupun air (BPOM, 2010). Tingkat toksisitas dari ekstrak dapat ditentukan dengan melihat harga LC50. Nilai LC50
dihitung dengan analisa probit. Perhitungan ini dilakukan dengan membandingkan antara larva yang mati terhadap jumlah larva keseluruhan, sehingga diperoleh persen kematian. Data persen kematian kemudian dikonversikan ke nilai probit untuk menghitung LC50
Dari pengujian toksisitas dengan metode BSLT didapatkan hasil yang menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi yang diujikan semakin banyak A. salina yang mati (Tabel 4). Dari hubungan antara log konsentrasi dan mortalitas A. salina (dikonversi ke dalam nilai probit) ekstrak etil asetat, ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana kulit batang R. mucronata (Lampiran 10), didapatkan persamaan regresi hubungan antara log konsentrasi dengan mortalitas A. salina dari ekstrak etil asetat (Y=1,365X+3,1733) ekstrak metanol (Y=1,765X+2,463) dan ekstrak n-heksana (Y=1,365X+2,726) dimana Y menunjukkan konsentrasi mortalitas dan X menunjukkan log konsentrasi. Persamaan regresi tersebut menjelaskan bahwa setiap penambahan konsentrasi sebesar 1 log (10 ppm) akan menyebabkan kenaikan mortalitas probit sebesar 1,365 untuk ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana serta 1,765 untuk ekstrak metanol. Dari persamaan regresi tersebut juga didapatkan nilai koefisien determinasi (R
dengan persamaan regresi linier y = a + bx (Lampiran 10).
2
0,904 yang berarti bahwa lebih dari 80% variasi tingkat mortalitas A. salina dapat dijelaskan dengan adanya perubahan log konsentrasi.
Nilai LC50 dapat dihitung dengan menggunakan regresi linear. Contoh
perhitungan penentuan LC50 dapat dilihat pada Lampiran 10. Nilai LC50
Meyer dkk. (1982) menyatakan bahwa hasil uji BSLT bersifat toksik/aktif terhadap A. salina bila ekstrak tumbuhan tersebut memiliki nilai LC
yang dihasilkan dari perhitugan masing-masing sebesar 21,06 ppm untuk ekstrak etil asetat, 24,59 ppm untuk ekstrak metanol dan 27,38 ppm untuk ekstrak n-heksana. Kontrol positif (DMSO) yang dibuat bersamaan dengan uji BSLT menunjukkan persen mortalitas yang cukup rendah dan hampir sama dengan kontrol negatif (air laut) sehingga dapat dikatakan bahwa DMSO yang digunakan untuk melarutkan ketiga ekstrak tersebut bukan penyebab kematian A. salina (Lampiran 9).
50
Dari ketiga ekstrak yang diujikan terhadap A. salina ekstrak etil asetat merupakan ekstrak yang memiliki tingkat toksisitas yang paling tinggi dan ekstrak n-heksana merupakan ekstrak yang paling rendah tingkat toksisitasnya. Perbedaan tingkat toksisitas tersebut disebabkan oleh senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam ekstrak tersebut. Dari hasil uji fitokimia terhadap senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, fenolik (tanin dan flavonoid),
< 1000 µg/ml. Berdasarkan hal itu maka hasil uji BSLT ekstrak kulit batang R. mucronata smuanya dikategorikan toksik/aktif terhadap A. salina. Hasil uji toksisitas ini sering dikorelasikan dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Hal ini dikarenakan larva udang A. salina tersebut sangat peka terhadap apapun yang berada di lingkungannya dan berkembang dengan sangat cepat menyerupai pertumbuhan sel kanker (Meilani, 2006).
terpen/steroid, dan saponin, ekstrak etil asetat positif mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, terpen/steroid, dan saponin sedangkan ekstrak n-heksana menunjukkan hasil yang negatif pada semua golongan senyawa tersebut tetapi kandungan senyawa metabolit sekunder yang lainnya bukan berarti tidak ada karena ekstrak n-heksana bersifat toksik pada uji BSLT. Kelana (2007) menyatakan bahwa jika dilakukan isolasi dan pemurnian terhadap senyawa murni bukan tidak mungkin dijumpai senyawa dari kelompok senyawa lain yang tidak tampak pada uji pendahuluan fitokimia.
Kematian A. salina pada uji BSLT diduga karena senyawa-senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam ekstrak mempengaruhi sistem metabolisme A. salina melalui saluran pencernaan. Artemia merupakan pemakan segalanya yang berukuran partikel dengan cara menyaringnya (filter feeder). Pada dasarnya mereka tidak akan peduli (tidak pemilih) jenis pakan yang dikonsumsinya selama bahan tersebut tersedia di air dengan ukuran yang sesuai (Adi dkk., 2006). Karena sifat A. salina yang filter feeder dan pemakan segalanya maka senyawa-senyawa dari ekstrak tersebut akan terakumulasi terus-menerus di dalam tubuh A. salina dan kadarnya akan meningkat seiring dengan waktu yang akhirnya menyebabkan kematian pada A. salina. Cahyadi (2009) menjelaskan bahwa cara kerja senyawa-senyawa tersebut adalah dengan bertindak sebagai stomach poisoning atau racun perut. Oleh karena itu, bila senyawa-senyawa ini masuk ke dalam tubuh larva, alat pencernaannya akan terganggu. Meilani (2006) menambahkan bahwa keadaan membran kulitnya yang sangat tipis memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya. Oleh karena itu, penambahan zat ekstraktif yang
diduga mengandung senyawa bioaktif yang juga berpotensi sebagai senyawa obat mampu mengganggu metabolisme dan menyebabkan kematian larva udang.
Uji aktivitas antimikroba
Dari pengujian aktivitas antimikroba terhadap bakteri A. hydrophila (gram negatif) dan bakteri S. agalactiae (gram positif) didapatkan hasil bahwa kontrol negatif (DMSO) tidak menunjukkan adanya aktivitas antibakteri karena tidak adanya zona bening ataupun zona keruh di sekitar cakram pada kedua bakteri uji. hal ini disebabkan karena DMSO yang dipakai untuk melarutkan ekstrak tidak mengandung senyawa-senyawa antibakteri. Sementara pengukuran zona hambat pada kontrol positif (kloramfenikol) didapatkan hasil bahwa kloramfenikol memiliki aktivitas antibakteri pada kedua bakteri uji. Zona hambat yang terbentuk dari kontrol positif (kloramfenikol) pada kedua bakteri uji memiliki diameter yang sangat besar yaitu sebesar 34,88 mm untuk bakteri A. hydrophila dan 43,4 mm untuk bakteri S. agalactiae.
Berdasarkan zona hambat yang terbentuk maka aktivitas antibakteri dapat digolongkan menjadi beberapa golongan yaitu antibakteri yang aktivitasnya tergolong lemah jika zona hambat kurang dari 5 mm, sedang jika zona hambat berkisar antara 5 – 10 mm, kuat jika zona hambat berkisar antara 10 – 20 mm, dan tergolong sangat kuat jika lebih dari 20 mm (Suryawiria, 1978 diacu oleh Indriani, 2007). Dari kriteria tersebut maka zona hambat yang terbentuk oleh kontrol positif (kloramfenikol) termasuk ke dalam golongan antibakteri yang memiliki aktivitas sangat kuat karena zona hambat yang terbentuk pada kedua bakteri uji tersebut berdiameter lebih dari 20 mm. Dapat dikatakan bahwa kloramfenikol efektif dalam menghambat pertumbuhan kedua bakteri tersebut. Hal ini sejalan dengan
pustaka yang menyatakan bahwa kloramfenikol merupakan antibiotik berspektrum luas yang aktif dalam menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Pelczar dan Chan 1988). Kloramfenikol merupakan