Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan dari bulan September – Nopember 2013. Pembuatan ekstrak dan pengujian fitokimia kulit batang R. mucronata di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. Pengujian efektivitas antibakteri di Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan II. Pengujian Brine Shrimp dilakukan di Unit Pelayanan Teknis (UPT) Budidaya Ikan, Dinas Perikanan dan Kelautan Kota Medan.
Alat dan Bahan
Alat yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah pisau, timbangan analitik, stoples kaca, gelas ukur, corong, blender, erlenmeyer, vortex, aluminium foil, rotary evaporator, spatula, cawan petri, karet gelang, pipet tetes, tabung reaksi, rak tabung reaksi, hot plate, ayakan, beaker glass, cotton bud, autoclave, laminar air flow, refrigerator/lemari es, sprayer, api bunsen, jarum ose, pinset, magnetic stirrer, tisu, kapas, kertas cakram, mikropipet, jangka sorong, inkubator, waterbath (penangas air), botol vial, plat TLC, kamera digital dan alat tulis.
Adapun bahan yang digunakan adalah pelarut n-heksana (non polar), etil asetat (semi polar), metanol (polar), kulit batang R. mucronata, akuades steril, alkohol 70%, spiritus, biakan A. hydrophila diperoleh dari Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan II, S. agalactiae diperoleh dari Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar Bogor dan jamur Saprolegnia sp. diperoleh dari Laboratorium
Mikrobiologi, Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara, kista Artemia salina, besi (III) klorida (FeCl3) 1%, cerium sulfat (CeSO4
Persiapan dan Ekstraksi Kulit Batang R. mucronata
) 1%, pereaksi dragendorf, pereaksi bouchardat, pereaksi mayer, pereaksi wagner, standar triterpenoid dan ß-sitosterol, HCl 2 N, air laut, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Potato Dextrose Agar (PDA), Tryptic Soy Agar (TSA), kloramfenikol, nistatin, larutan Mc. Farland 0.5, larutan NaCl 0,9 %.
Kulit batang tumbuhan R. mucronata dikumpulkan sebanyak 9 kg dalam berat basah dari kawasan hutan mangrove desa Denai Kuala, Kec. Pantai Labu, Kab. Deli Serdang. Kulit batang R. mucronata dicuci dengan air mengalir dan dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan selama 7 hari dengan cara diangin-anginkan untuk mengurangi penguapan yang mengikutkan senyawa yang terkandung di dalamnya. Proses pengeringan ini bertujuan menurunkan kadar air sehingga tidak mudah ditumbuhi kapang dan bakteri serta menghilangkan aktivitas enzim yang dapat menguraikan lebih lanjut kandungan zat aktif yang terdapat di kulit batang tumbuhan tersebut (Gunawan dan Sri, 2004). Kulit batang yang sudah kering selanjutnya dipotong menjadi potongan yang lebih kecil agar mudah dihaluskan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk selanjutnya diayak menggunakan ayakan hingga diperoleh serbuk yang halus dan seragam. Serbuk hasil ayakan sebanyak 1,47 kg kemudian disimpan ke dalam stoples kaca karena tidak langsung digunakan untuk proses selanjutnya (Lampiran 1).
Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Ekstraksi merupakan suatu proses penarikan komponen atau zat aktif menggunakan pelarut tertentu (Harborne, 1987 diacu oleh Sudirman, 2011). Ekstraksi dalam penelitian ini
dilakukan dengan metode maserasi yaitu proses pengambilan senyawa zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam pelarut yang sesuai dengan kepolarannya. Dalam penelitian ini digunakan tiga pelarut dengan kepolaran berbeda yaitu n-heksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Serbuk sampel masing-masing sebanyak 300 g direndam dengan 1 liter pelarut etil asetat dan 1 liter pelarut metanol dan sebanyak 870 g direndam dengan 1,5 liter n-heksana di dalam erlenmeyer. Erlenmeyer yang berisi rendaman tersebut kemudian ditutup dengan alumunium foil selama 24 jam sambil sesekali diaduk untuk mempercepat kontak antara sampel dengan pelarut. Setelah itu sampel disaring dengan kapas sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh kemudian pelarutnya dievaporasi menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental dari kulit batang R. mucronata. Ekstrak kental yang diperoleh tersebut dipekatkan dengan penangas air (water bath) agar seluruh pelarutnya habis menguap dan diperoleh ekstrak pekat/kering. Ekstrak tersebut kemudian disimpan di dalam botol vial tertutup (Lampiran 1).
Uji Fitokimia
Analisis fitokimia merupakan uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa-senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak kulit batang R. mucronata. Analisis fitokimia dilakukan berdasarkan metode Depkes (2009) yang diacu oleh Tirtana dkk. (2013). Identifikasi kandungan kimia dalam ekstrak kulit batang R. mucronata dilakukan terhadap senyawa-senyawa:
a. Saponin
Larutan ekstrak sebanyak 2 ml ditambahkan akuades, kemudian dikocok kuat-kuat. Senyawa saponin akan menghasilkan busa setinggi 1 – 10 cm yang
stabil dan tidak kurang dari 10 menit. Pada penambahan 1 tetes HCl 2 N, busa tidak hilang.
b. Steroid/ triterpenoid
Sebanyak 2 ml larutan ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan pereaksi Lieberman-Burchard. Senyawa steroid menimbulkan warna hijau dan triterpenoid menimbulkan warna ungu.
Untuk pengujian menggunakan CeSO4 1% dilakukan dengan metode Thin Layer Chromatography (TLC). Plat TLC diberi tanda sesuai dengan nama pelarut yang digunakan dalam ekstraksi. Plat TLC kemudian dibagi menjadi 3 bagian
untuk diteteskan ekstrak sampel, standar triterpenoida dan β-sitosterol. Selanjutnya tetesan ekstrak tersebut disemprot dengan penampak noda atau pereaksi CeSO4
c. Senyawa golongan fenolik (tanin dan flavanoid)
1% dan plat TLC dipanaskan di atas hot plate. Selanjutnya diamati perubahan warna yang terjadi dan bandingkan dengan standar
triterpenoida dan β-sitosterol.
Larutan ekstrak sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2 tetes pereaksi besi (III) klorida 1%. Tanin akan menghasilkan warna biru atau hitam kehijauan. Untuk senyawa flavonoid maka sampel dengan pelarut etil asetat sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan di tambahkan 2 tetes pereaksi FeCl3 1%. Larutan positif mengandung flavonoid apabila terjadi perubahan warna menjadi warna biru atau hitam kehijauan.
d. Alkaloid
Larutan ekstrak sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diperiksa adanya senyawa alkaloid dengan pereaksi Dragendorff, Bouchardat, Mayer dan pereaksi Wagner sebagai berikut:
1. Larutan ekstrak ditambah 2 tetes pereaksi Dragendorf. Larutan positif mengandung alkaloid jika terbentuk endapan berwarna merah jingga atau cokelat muda sampai kuning/oranye.
2. Larutan ekstrak ditambah 2 tetes pereaksi Bouchardat. Larutan positif mengandung alkaloid jika terbentuk endapan berwarna cokelat sampai hitam. 3. Larutan ekstrak ditambah 2 tetes pereaksi Mayer. Larutan positif mengandung
alkaloid jika terbentuk endapan berwarna putih/kuning.
4. Larutan ekstrak ditambah 2 tetes pereaksi Wagner. Larutan positif mengandung alkaloid jika terbentuk endapan berwarna cokelat.
Uji Aktifitas Antibakteri
Prosedur pengujian aktivitas antibakteri, meliputi :
Pembuatan media pertumbuhan
Media pertumbuhan untuk bakteri A. hydrophila dan S. agalactiae dibuat dengan menggunakan bubuk TSA sebanyak 24 gram yang dilarutkan dengan 600 ml akuades di dalam Erlenmeyer ukuan 1 liter. Batang magnetic stirrer dimasukkan ke dalam larutan media agar media teraduk sempurna saat pemanasan di atas hot plate. Erlenmeyer kemudian ditutup rapat dengan kapas yang dibungkus alumunium foil. Setelah media mendidih dan berubah menjadi bening, media dibagi ke dalam 2 erlenmeyer yang berukuran 500 ml dan ditutup rapat menggunakan kapas yang dibungkus dengan alumunium foil. Selanjutnya media
TSA disterilkan di dalam autoklaf selama 15 – 20 menit pada suhu 1210
Untuk pertumbuhan jamur Saprolegnia sp. media yang digunakan adalah bubuk PDA sebanyak 11,7 gram yang dilarutkan dalam 300 ml akuades. Untuk proses pembuatannya sama dengan pembuatan media TSA di atas.
C dan tekanan 1 atm. Setelah media disterilkan, media selanjutnya didiamkan sebentar di dalam laminar air flow sampai hangat-hangat kuku untuk kemudian dituang kedalam 30 cawan petri steril. Proses penuangan ini dilakukan di dalam laminar air flow dan dekat dengan api Bunsen untuk menjaga kesterilan media. Media TSA kemudian dibiarkan memadat selama 24 jam. Media yang tidak terkontaminasi selanjutnya dibungkus dengan kertas steril dan disimpan di dalam lemari pendingin untuk digunakan dalam proses selanjutnya.
Sterilisasi alat dan bahan
Cawan petri, tabung reaksi, cotton bud, kertas cakram, termasuk seluruh alat dan bahan kecuali ekstrak kulit batang R. mucronata yang akan digunakan disterilisasi di dalam autoklaf selama 20 menit dengan mengatur tekanan sebesar 15 dyne/ cm3 (1 atm) dan suhu sebesar 1210
Peremajaan bakteri dan jamur
C setelah sebelumnya dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas (Kusuma, 2012).
Bakteri A. hydropila dan S. agalactiae diremajakan masing-masing pada media TSA dengan cara menggoreskan jarum ose yang mengandung bakteri A. hydropila pada 1 cawan petri yang berisi media TSA dan S. agalactiae pada petri yang lainnya. Penggoresan dilakukan secara aseptis yaitu membakar jarum ose dengan api Bunsen sampai berpijar sebelum dan sesudah penggoresan, selalu dekat dengan api Bunsen selama proses penggoresan berlangsung dengan
mengatur jarak jarum ose yang mengandung bakteri dengan api Bunsen agar bakteri yang akan diremajakan tidak mati. Setelah itu media yang berisi bakteri tersebut dinkubasi selama 24 – 48 jam pada suhu 370
Untuk peremajaan jamur Saprolegnia sp. dilakukan dengan mengambil sebagian dari koloni dengan blade dan menanamnya secara aseptis pada media PDA. Setelah itu diinkubasi pada suhu 27
C.
0
Pembuatan suspensi bakteri dan konsentrasi uji
C sampai hifa tumbuh penuh pada media tersebut.
Setelah bakteri tumbuh saat peremajaan, bakteri siap untuk dilakukan uji antibakteri. Tahap pertama yang dilakukan adalah pembuatan suspensi bakteri dengan cara mengambil biakan menggunakan sengkelit (ose) `dan disuspensikan dengan cara dimasukan ke dalam tabung berisi 3 ml larutan NaCl 0,9%. Suspensi yang terbentuk disetarakan dengan larutan baku Mc. Farland 0.5 yang ekuivalen dengan suspensi sel bakteri dengan konsentrasi 1,5 × 108
Pada penelitian ini konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 20%, 40% dan 60% (b/v). Istilah persen larutan diartikan untuk menunjukkan pengertian gram dari zat terlarut per 100 ml larutan (Waluyo, 2010). Larutan dibuat dengan cara menimbang ekstrak kulit batang R. mucronata sebanyak 0,6 g yang dilarutkan dengan DMSO sebanyak 1 ml. Larutan dengan konsentrasi 40% dan 20% dibuat dengan cara pengenceran dari konsentrasi 60% dengan DMSO 0,5 ml (lampiran 11). Untuk kontrol negatif digunakan DMSO dan kontrol positif digunakan kloramfenikol (30 µg/ml) untuk bakteri dan nistatin (100 µg/ml) untuk jamur.
cfu/ml. (Andrews, 2008).
Pengujian daya antibakteri
Pengujian antibakteri dilakukan dengan metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer). Prinsipnya adalah pirinngan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar (Pratiwi, 2008).
Pada penelitian ini pengujian antibakteri menggunakan blank disc (kertas cakram kosong) berdiameter 6 mm. Cutton buds steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri dan diguncang sedikit agar bakteri teraduk rata kemudian Cutton buds yang mengandung bakteri dioleskan pada media TSA. Setelah olesan bakteri mengering, kertas cakram yang telah direndam selama 1 jam pada berbagai konsentrasi ditiriskan dan diletakkan di atas media yang berisi olesan bakteri dengan sedikit ditekan agar cakram menempel pada permukaan media. Semuan pengerjaan dilakukan dengan aseptis. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 370
Uji terhadap Saprolegnia sp. dilakukan dengan cara mengambil potongan kecil miselium dengan bentuk kubus dan menanamkannya di media PDA dengan posisi di tengah. Kertas cakram kosong yang telah berisi ekstrak dengan berbagai konsentrasi diletakkan di sekitar potongan jamur tersebut dengan jarak yang sama. Setelah itu diinkubasi pada suhu 27
C selama 24 jam di inkubator.
0 Penentuan zona hambatan
C selama 3 hari.
Aktivitas antibakteri dinyatakan positif apabila terbentuk zona hambat berupa zona bening disekeliling paper disc dan aktivitas antibakteri dinyatakan
negatif apabila tidak terbentuk zona bening. Diameter zona hambat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Gambar 6. Perhitungan diameter zona hambat antibakteri Keterangan:
a = Diameter kertas cakram (mm)
b = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm) c = Daerah yang ditumbuhi bakteri
b + a = Diameter Zona hambat
Untuk aktifitas antifungi ditentukan dengan cara mengukur jari-jari pertumbuhan hifa normal dikurang dengan jari-jari pertumbuhan hifa yang terhambat oleh ekstrak.
Gambar 7. Perhitungan jari-jari zona hambat jamur Saprolegnia sp. Keterangan:
a = Pertumbuhan koloni jamur
b = Zona hambat ekstrak R. mucronata terhadap koloni jamur
b c a
d
c = Blank disc yang telah berisi ekstrak d = Letak koloni jamur yang ditanam
x = Koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya y = Koloni jamur yang pertumbuhannya normal y – x = Jari-jari zona hambat
Uji Toksisitas
Uji Toksisitas ini dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality test (BST) (Kelana, 2007). Kista Arthemia salina Leach ditetaskan di dalam bejana yang sudah diisi 3 liter air laut buatan bersalinitas 35 ppt. Bejana kemudian dilengkapi dengan alat aerasi dan kista dibiarkan menetas pada suhu 250
Larutan induk setiap uji dibuat dengan melarutkan 20 mg sampel dalam 2 ml DMSO. Larutan uji 1000 ppm dibuat dengan memipet larutan induk sebanyak 500 μl, sedangkan larutan uji 100 ppm dan 10 ppm dibuat dengan memipet 50 μl dan 5 μl dari larutan induk. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 ulangan, 3 vial untuk kontrol positif (DMSO) dan 3 vial untuk kontrol negatif (air laut). Pada setiap konsentrasi ditambahkan air laut kurang lebih 2 ml kemudian masukkan 10 ekor anak udang ke dalam setiap vial dan cukupkan volumenya sampai 5 ml dengan air laut. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan terhadap kematian A. salina.
C, setelah 48 jam hewan uji siap untuk digunakan.
Analisis Data
Pada pengujian aktivitas antibakteri data hasil pengukuran zona bening dirata-ratakan dan dianalisis dengan metode deskipstif dalam bentuk tabel dan gambar. Pengaruh pemberian ekstrak kulit batang R. mucronata pada berbagai
konsentrasi uji terhadap toksisitas A. salina dapat dihitung dengan analisis probit untuk menetukan LC50. Perhitungan LC50 dilakukan dengan persamaan regresi linear y = a + bx yang didapatkan dari grafik hubungan antar log konsentrasi dengan mortalitas probit menggunakan program Microsoft excel.