Hasil
Bakteri Potensial Probiotik pada Lambung dan Usus Ikan Patin Siam
Dari penelitian yang telah dilakukan, diperoleh hasil bahwa jumlah isolate
bakteri potensial probiotik dari isolasi lambung dan usus ikan Patin (Pangasius hypophthalmus) ditemukan sebanyak 4 isolat bakteri, yaitu terdapat 2
isolat bakteri dari hasil isolasi lambung dan 2 isolat bakteri dari hasil isolasi pada usus. Hasil tersebut diperoleh detelah dilakukan uji untuk menyeleksi seluruh isolate yang ditemukan dari lambung dan usus ikan Patin (P. hypophthalmus) sehingga diperoleh isolate bakteri yang memang merupakan potensial probiotik yaitu sebanyak isolate murni.
Morfologi Koloni dan Sel Bakteri Potensial Probiotik pada Ikan Patin
Isolate-isolat bakteri potensial probiotik yang ditemukan dari hasil isolasi lambung dan usus ikan Patin (P. hypophthalmus) dapat dilihat dari morfologi koloni meliputi tepian, elevasi dan warna koloni. Adapun cirri-ciri morfologi dari keempat koloni yang berhasil diperoleh dapat dilihat pada Tabel 1. Berdasarkan Tabel 1 dapat dijelaskan bahwa ke-4 jenis bakteri memiliki kemiripan pada tepian yaitu bertepi licin, sedangkan pada elevasi ada terbagi dua yaitu berelevasi datar dan cembung. Pada warna dan bentuk memiliki perbedaan yaitu ke-2 isolat ada berwarna kuning dan 2 isolat lainnya berwarna putih dengan bentuk batang ddan kokus.
Tabel 1. Morfologi Koloni Isolat Bakteri Potensial Probiotik pada Ikan Patin
Kode Isolat Koloni Morfologi Sel
Tepian Elevasi Warna Gram Bentuk
Pengamatan morfologi pada sel isolate bakteri potensial probiotik yang diperoleh dari ikan Patin perlu dilakukan dengan pewarnaan Gram dan Uji Biokimia untuk mengidentifikasi bakteri potensial probiotik pada ikan Patin.
Pewarnaan gram dilakukan secara mikroskopik dengan pembesaran 100x kemudian didapat hasil pewarnaan gram dari ke-4 isolat bakteri yaitu berwarna ungu yang merupakan bakteri Gram positif karena mampu mengikat kristal violet.
Dari ke-4 isolat bakteri yang didapat, terdapat 2 isolat bakteri yang berbentuk batang atau basil dan yang 2 lagi berbentuk kokus atau bulat. Hasil dari pewarnaan Gram dari isolate bakteri potensial probiotik yang sudah dilakukan dapat dilihat pada gambar 9.
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 9. Bentuk sel dari isolat (a) U103 (b) L105 (c) L103 (d) U105
Karakteristik dan Identifikasi Bakteri Potensial Probiotik pada Ikan Patin Hasil pengamatan morfologi sel baik pewarnaan Gram dan Uji Biokimia dari ke-4 isolat merupakan bakteri gram positif yang ditandai dengan sel bakteri yang mampu mengikat kristal violet (ungu) dapat dilihat pada Gambar 5. Terdapat 2 macam bentuk bakteri yang telah diamati yaitu basil (batang) seperti terlihat pada gambar Hasil uji Biokimia dari ke-4 bakteri yang diperoleh menurut buku Cowan and Steel’s (1974) Manual for The Identification of Medicall Bacteria.
Tabel 2. Karakterisasi Isolat Bakteri Potensisal Probiotik pada Ikan Patin
Uji biokimia U103 L105 L103 U105 Keterangan: (+) Positif, (-) Negatif, (F) Fermentatif, (O) Oksidatif
Hasil karakteristik dan iddentifikasi ke-4 isolat bakteri yang di dapat dengan kode U103 merupakan bakteri Bacillus badius, isolat dengan kode L105
merupakan bakteri Bacillus coagulans, isolat dengan kode L1 merupakan bakteri Streptococcus bovis type I sedangkan isolat yang terakhir engan kode G1 merupakan bakteri Micrococcus roseus.
Hidrolisis Pati (Amilum) dan Kasein (Protein) pada Isolat Bakteri
Uji hidrolisis pati (amilum) dan kasein (protein) dilakukan yaitu untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan enzim amylase dan protease yang merupakan tahap awal dalam seleksi seluruh isolasi bakteri untuk mendapatkan kandidat bakteri yang berpotensi probiotik pada ikan Patin. Uji hidrolisis dilakukan dengan menggoreskan masing-masing koloni bakteri pada media uji pati (amilum) dan kasein (protein). Pengamatan hasil uji hidrolisis pati dan kasein ditandai dengan adanya zona bening disekeliling isolat yang telah ditumbuhkan seperti pada Gambar 10 dan Tabel 3.
Tabel 3. Kemampuan Isolat Kandidat Probiotik Menghidrolisis Patin dan Kasein
Kode Isolat Hidrolisis
Keterangan : (+) Positif, (-) Negatif
Gambar 10. (a) Hidrolisis Pati (b) Hidrolisis Kasein
a
L103
U105
U103
L105
b
Dari semua isolat bakteri yang didapat mampu menghidrolisis pati dan kasein dapat dilihat pada gambar 6. Dimana hidrolisis kasein yang artinya adalah aktivitas enzim protease yang memecah protein menjadi asam amino. Bakteri mampu mengidrolisis amilum karena dapat menghasilkan enzim amylase yang memecah tepung menjadi glukosa, maltosa dan dekstrin.
Indikasi Penghambat Bakteri Aeromonas hydrophila
Isolat-isolat bakteri yang mampu menghidrolisis pati (amilum) dan kasein
(protein) tersebut selanjutnya dilakukan uji tantang pada bakteri Aeromonas hydrophila untuk mengetahui adanya indikasi penghambatan terhadap
A.hydrophila. Uji tersebut dilakukan untuk dapat memastikan bahwa ke-4 isolat bakteri tersebut merupakan isolat bakteri yang berpotensi probiotik pada ikan Patin karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen A.hydrophila.
Pengujian daya hambat dari ke-4 isolat bakteri yang didapat dapat dilihat pada Tabel 4 dan Gambar 11.
Gambar 10. Indikasi Penghambat Bakteri A.hydrophila
Tabel 4. Uji Daya Hambat
Nama Isolat Diameter Zona Hambat (mm)
U103 7
U105 7
L103 8
L105 9
Kemampuan penghambatan pertumbuhan patogen yang terdapat pada gambar 7 menunjukkan bahwa ke-4 isolat dari isolasi saluran pencernaan ikan Patin menghasilkan zona bening disekitar paper diskdan besarnya zona bening yang dihasilkan tiap isolat berbeda-beda berdasarkan tingkat daya hambat bakteri terhadap bakteri uji. Berdasarkan gambar 7, nilai indikasi hambatan pada bakteri Bacillus badius (U103) sebesar 7 mm, bakteri Micrococcus roseus(U105) sebessar 7 mm, bakteri bakteri Streptococcus bovis type I (L103) sebesar 8 mm dan Bacillus coagulans(L105) sebesar 9 mm. Menurut Pan et al. (2009) Zona penghambatan potensi probiotik ibagi menjadi tiga yaitu <11 mm potensi rendah, 9-11 mm moderat dan >11 mm potensi tinggi. Oleh karena itu, keempat isolat tersebut termasuk kedalam potensi moderat karena memilliki ukuran <11 mm.
Pembahasan
Bakteri Potensial Probiotik pada Saluran Pencernaan Ikan Patin
Probiotik akan berpengaruhterhadap kecepatan fermentasi pakandalam saluran pencernaan, sehinggaakan sangat membantu prosespenyerapan makanan dalampencernaan ikan. Beberapa bakteri telah terbuktimembentuk spora untuk melaksanakanseluruh siklus hidup, sporulasi danperkecambahan di saluran pencernaansehingga pembentukan spora atauperkecambahan dapat terjadi di
meningkatkanpencernaan dan penyerapan proteinpada saluran percernaan karenameningkatnya aktivitas protease usus. Aplikasiprobiotik ditampilkan untukmeningkatkan keseimbangan mikrobausus, sehingga menyebabkanpeningkatan penyerapan makanan danmengurangi masalah patogen
dalamsaluran pencernaan (Butar-butar et al., 2015)
Isolasi bakteri pada penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan bakteri potensial probiotik dari ikan Patin (Pangasius hypophthalmus). Isolasi dilakukan pada saluran pencernaan ikan Patin berupa lambung dan usus yang belum sama sekali terkena antibiotik atau bahan kimia lainnya yang telah diberikan melalui pakan ataupun kualitas air dalam proses pembudidayaan agar kandidat bakteri probiotik yang ditemukan bukan merupakan bakteri dari hasil penggunaan probiotik ataupun antibiotic melainkan bakteri potensial probiotik melalui pakan alami yang terdapat pada lambung dan usus ikan Patin.
Bakteri probiotik atau bakteri baik adalah bakteri asam laktat yang hidup di dalam usus, bersimbiosis dengan mikroflora usus yang mampu melawan bakteri patogen di dalam usus, oleh karena itu pemberian probiotik dapat berpengaruh menguntungkan bagi kesehatan.Bakteri probiotik menghasilkan enzim yang mampu mengurai senyawa kompleks menjadi sederhana sehingga siap digunakan ikan. Bakteri yang terdapat dalam probiotik memiliki mekanisme dalam menghasilkan beberapa enzim untuk pencernaan pakan seperti amylase, protease, lipase dan selulosa dalam meningkatkan nutrisi pada pakan. Enzim tersebut yang akan membantu menghidrolisis nutrien pakan (molekul kompleks), seperti memecah karbohidrat, protein dan lemak menjadi molekul yang lebih sederhana yang akan mempermudah pencernaan dan penyerapan dalam saluran
pencernaan ikan. Selain itu dapat menurunkan senyawa metabolit beracun, mempercepat pertumbuhan dan kestabilan plankton, menurunkan pertumbuhan bakteri yang merugikan, penyedia pakan alami dalam bentuk bakteri dan dapat menumbuhkan beberapa jenis bakteri pengurai. Bakteri probiotik dapat bekerja secara maksimal dalam pencernaan ikan, sehingga daya cerna ikan pun menjadi lebih tinggi dalam menyerap sari-sari makanan dan menghasilkan pertumbuhan yang baik.
Hasil isolasi maka didapatkan isolat murni sebanyak 4 isolat, yaitu terdapat 2 isolat bakteri dari lambung dan 2 isolat lainnya dari usus ikan Patin.
Dari hasil uji morfologi dan biokimia diperoleh bahwa bakteri yang berpotensi sebagai kanidat probiotik yang diperoleh dari saluran pencernaan ikan Patin adalah Bacillus badius, Micrococcus roseus, Streptococcus bovis type I dan Bacillus coagulans. Hal ini sesuai dengan Anggriani et al., (2012) yang menyatakan Bacillus sp. Berperan sebagai bakteri probiotik yang mampu merombak pakan relatif lebih singkat dan menekan bakteri pathogen yang ada dalam saluran pencernaan dan aktifitas bakteri dalam pencernaan akan berubah dengan cepat ketika ada mikroba yang masuk melalui pakan dan air.
Keseimbangan mikroflora di dalam saluran pencernaan akan sangat berpengaruh terhadap peran bakteri sebagai probiotik yang akan menekan bakteri pathogen lainnya sehingga saluran pencernaan lebih baik dalam mencerna makanan.
Morfologi Koloni dan Sel Bakteri Potensial probiotik pada Ikan Patin
Berdasarkan hasil pengamatan koloni dari ke-4 isolat bakteri potensial probiotik pada Tabel 1. diketahui bahwa morfologi pada ke-4 isolat bakteri
memiliki kesamaan pada tepian yaitu licin sedangkan pada elevasi, warna dan bentuk terbagi menjai 2 yaitu elevasi cembung dan datar, warna putih dan kuning serta pada bentuk bulat dan batang. Ke-4 isolat yang didapat yaitu berasal dari hasil isolasi usus dan lambung ikan Patin. Terdapat 2 isolat bakteri dari hasil isolasi dari lambung dan 2 isolat bakteri lainnya berasal dari hasil isolasi usus.
Untuk mengetahui morfologi sel bakteri potensial probiotik dilakukan dengan pengamatan menggunakan pewarnaan gram. Berdasarkan pewarnaan pada seluruh isolat bakteri potensial probiotik bahwa yang mampu mempertahankan warna ungu (Kristal violet) setelah pelunturan dengan alkohol aseton adalah bakteri dengan gram positif. Hal ini sesuai dengan Mastang (2016) yang menyatakan bahwa Pengecatan gram memisahkan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif pada pewarnaan Gram berwarna biru keunguan hal ini disebabkan kompleks crystal violet yang masuk ke dalam sel bakteri Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel.
Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri Potensial Probiotik
Isolat yang berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dari saluran pencernaan ikan Patin berupa usus dan lambung ada terdapat 4 isolat dimana dua diantaranya merupakan bakteri potensial probiotik Bacillus badius dan Bacillus coagulans dengan kode isolat U103 dan L105. Hal ini sesuai dengan Pelczar et al. (1976) yang menyatakan bahwa Bacillus merupakan bakteri yang berbentuk batang dapat dijumpai di tanah dan air termasuk pada air laut. Beberapa jenis menghasil enzim ekstraseluler yang dapat menghidrolisis protein dan polisakarida kompleks.
Bacillus spp membentuk endospora, merupakan gram positif, bergerak dengan adanya flagel peritrikus, dapat bersifat aerobik atau fakultatif anaerobik serta bersifat katalase positif.
Pengamatan ciri-ciri tersebut, dibandingkan dengan ciri-ciri bakteri yang diuraikan oleh Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria. Berdasarkan dari serangkaian pengamatan koloni bakteri, pewarnaan Gram, dan uji biokimia didapatkan bakteri Micrococcus roseus dengan kode isolat U105 memiliki ciri-ciri dengan bentuk kokus, Oksidase positif , katalase positif dan berwarna ungu. Hal ini sesuai dengan Thoyip et al., (2007) yang menyatakan bahwa Genus Micrococcus memiliki ciri: sel berbentukbulat, berukuran 0,5-2,0 μm. Sel tersusuntunggal, tetrad, bergerombol. Reaksi grampositif, jarang yang motil, dan tidak membentukendospora. Koloni biasanya berwarna kuningatau merah. Micrococcus hidup secara aerob,katalase positif, sering oksidase juga positif, meskipun ada juga yang negatif, tidakmenghasilkan asam dari karbohidrat atau sedikitmenghasilkan asam. Suhu optimum pertumbuhan 25-37°C.
Hidrolisis Pati (Amilum) dan Kasein (Protein) pada Isolat Bakteri
Bakteri probiotik merupakan bakteri yang sangat menguntungkan bagi ikan karena dapat mencegah bakteri patogen dan merupakan penghasil beberapa enzim yang dibutuhkan ikan dalam pencernaan dan penyerapan dalam saluran pencernaan ikan. Sesuai denganArief et al.,(2008) yang menyatakan bahwa bakteri probiotik menghasilkan enzim yang mampu mengurai senyawa kompleks menjadi sederhana sehingga siap digunakan ikan. Bakteri yang terdapat dalam probiotik memiliki mekanisme dalam menghasilkan beberapa enzim untuk pencernaan pakan
pakan. Enzim tersebut yang akan membantu menghidrolisis nutrien pakan (molekul kompleks), seperti memecah karbohidrat, protein dan lemak menjadi
molekul yang lebih sederhana yang akan mempermudah pencernaan dan penyerapan dalam saluran pencernaan ikan.
Uji hidrolisis pati dilakukan yaitu untuk mengetahui ke-4 isolat yang didapat apakah mampu dalammenguraikan karbohidrat. Berdasarkan uji hidrolisis yang telah dilaksanakan maka ke-4 isolat bakteri tersebut mampu menghidrolisis pati dan membentuk zona bening. Dimana Uji hidrolisispati ditandai dengan terbentuknya zonabening setelah diteteskan iodin padaisolat bakteri. Hal ini terjadi karenamolekul pati merupakan molekul yanglarut dalam air dan memberikan warnabiru apabila tercampur dengan larutaniodin dan akan membentuk zonabening apabila menghidrolisis pati.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan, uji hidrolisis protein dari ke-4 isolat yang didapat mamampu menghasilkan zona bening disekeliling bakteri yang ditanam pada media Skim Milk Agar atau media susu skim yang mengandung kasein yang dapat dipecah oleh mikroorganisme proteolitik. Uji hidrolisis protein dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan protein dengan menghasilkan enzim protease. Protease merupakan enzimyang digunakan secara luas padaindustri pakan ternak. Salah satu fungsiprotease yaitu berperan dalamdegradasi protein menjadi asam amino,sehingga menjadikan pakan ternaklebih mudah diserap oleh pencernaanhewan ternak.
Dari hasil penelitian diperoleh bahwa isolat bakteri potensial probiotik berasal dari genus Bacillus sp. Micrococcus roseus dan Streptococcus bovis
kemampuan bakteri dalam menguraikan amilum dan kasein untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan protein. Bacillus sp. merupakan salah satu jenis bakteri yang memiliki kemampuan untuk menghasilkan protease dan merupakan jenis bakteri yangterdapat dihampir semua tempattermasuk di dalam saluran pencernaan. Hal ini sesuai dengan Fardiaz (1992)yang menyatakan bahwaBacillus sp. mempunyai sifat dapatmensekresikan enzim protese, lipasedan amilase. Jenis dari marga Bacillus sp. mempunyai kemampuan enzimatikyang berbeda-beda dalammenghasilkan enzim, diantaranyadalam menghasilkan enzim amilase,protease, dan lipase.
Indikasi Penghambat Bakteri Aeromonas hydrophila
Untuk dapat mengetahui apakah ke-4 isolat bakteri potensial probiotik yang diperoleh mampu melakukan uji penghambat bakteri patogen dengan baik terlebih dahulu kita mengetahui kriteria yang terdapat pada BAL. Salah satu kriteria yang diinginkan dari BAL yang digunakan sebagai kultur probiotik adalah mampu menggantikan kerja antibiotik sehingga dapat mempertahankan keseimbangan mikrofora dalam usus dengan menghambat atau menurunkan pertumbuhan bakteri patogen. Rashid et al. (2007) menyatakan bahwa BAL sebagai bakteri probiotik harus mampu menurunkan jumlah bakteri patogen dalam usus manusia karena BAL memiliki komponen antimikroba. Bakteri yang digunakan dalam indikasi penghambat yaitu bakteri Aeromonas hydrophila.
Dari ke-4 isolat, 1 isolat diantaranya merupakan jenis Micrococcus sp.
yangjuga memiliki indikasi penghambatanA. hydrophila. Dengan demikianMicrococcus sp. merupan bakteri yangpotensial probiotik pada ikan
Patin karena menghambat pertumbuhan A.hydrophila. Hal ini sesuai dengan Subagiyo et al (2010) menyatakan bahwa Micrococcus dapat dikembangkan sebagai pembentukan konsorsium probiotik. Pembentukan konsorsium probiotik pada ikan kerapu menghasilkan senyawa antibakteri terhadap pathogen dan mampu hidup didalam saluran pencernaan dan bersifat non patogen dan memberikan efek yang menguntungkan bagi ikan.
Aktifitas penghambat keempat bakteri potensial terhadap A.hydrophila berturut-turut dari yang paling besar adalah Bacillus coagulans(L105)dengan diameter 9 mm, Streptococcus bovis type I (L103) sebesar 8 mm. Bacillus badius dan sphaerius (U103) sebesar 7 mm dan zona penghambat paling kecil yaitu bakteri Micrococcus roseus (U105) sebesar 7 mm. Walaupun zona hambatprobiotik tidak luas dan hanyamenunjukkan indikasi penghambatan,tetapi itu sudah memberikan indikasibahwa bakteri-bakteri tersebutmempunyai kemampuan menghambatpertumbuhan patogen yang nantinyadapat diteliti lebih mendalam tentanguji penggunaan bakteri tersebut secaralangsung pada ikan (in vivo) (Butar-butar et.al., 2015)