Hasil Isolasi dan Pemurnian Bakteri Manolitik Laut
Penelitian ini diawali dengan proses sampling di perairan laut pulau Pari kepulauan seribu kota Jakarta untuk mendapatkan bakteri manolitik potensial penghasil enzim mananase. Pulau Pari merupakan salah satu kelurahan di kecamatan Kepulauan eribu elatan kabupaten Kepulauan eribu provinsi DKI Jakarta. Pulau Pari terletak di gugusan Kepulauan eribu dengan letak geografis 05 51 22 Lintang elatan dan 106 36 02 ujur Timur. Pulau Pari juga merupakan tempat wisata, budidaya rumput laut serta tempat penelitian kekayaan laut yang difasilitasi oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang bertujuan untuk melakukan berbagai penelitian demi kepentingan kelestarian alam di pulau ini (Gambar 3).
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 3. Lokasi Sampling di Pulau Pari Kepulauan Seribu DKI Jakarta Laut dalam (a), area budidaya rumput laut (b), laut dangkal (c), dan pesisir pantai (d).
Hasil pengamatan terhadap isolat Pengukuran aktivitas mananase ini dapat dilakukan dengan menghitung indeks manolitik (IM). IM dihitung dengan mengukur diameter koloni dan diameter zona jernih yang terbentuk (Downie et al. 1994).
Bakteri manolitik laut diinokulasikan pada media agar yang mengandung substrat manan (locust bean gum) kemudian diinkubasi selama 72 jam pada suhu ruang. Selama fase inkubasi maka bakteri manolitik akan mensekresikan enzim mananase untuk mendegradasi substrat manan menjadi manooligosakarida atau manosa. Mananase yang telah mendegradasi manan akan membentuk zona spesifik seperti pada gambar 5 dibawah ini. Zona akan terlihat lebih jelas ketika diberikan pewarna congo red hal tersebut dikarenakan congo red dapat terikat
pada substrat manan yang mengandung β-1.4-D manopiranosil sehingga media akan menjadi merah sedangkan zona jernih terjadi karena tidak terbentuk ikatan congo red dan manan (Downie et al. 1994).
(a) (b) (c)
Gambar 5. Hasil analisis kualitatif bakteri manolitik metode pewarnaan congo red Pari 3 (a), Pari 4 (b), dan Pari 5 (c).
Perbedaan diameter zona jernih dan IM belum dapat menunjukan aktivitas enzim secara spesifik (Gambar 5). Oleh karena itu perlu dilakukan produksi
IM =
mananase untuk mengukur aktivitas enzim secara kuantitatif agar data yang diperoleh lebih akurat.
Hasil pengamatan aktivitas enzim mananase secara kualitatif berdasarkan indeks manolitik dapat dilihat pada tabel dibawah ini. Uji ini menujukkan 3 buah isolat potensial yang mempunyai nilai IM yang tinggi yaitu isolat Pari 3 mempunyai IM sebesar 4,33 dengan morfologi koloni putih keruh. Isolat Pari 4 mempunyai IM sebesar 2,40 dengan morfologi tepi koloni bening dan bagian tengah koloni berwarna putih. Sedangkan isolat pari 5 mempunyai IM sebesar 2,60 dengan keterangan morfologi berwarna putih kecokelatan.
Tabel bakteri manolitik laut pendegradasi manan hasil isolasi dari pulau Pari Kepulauan Seribu
No Isolat
Uji Kualitatif CongoRed 0,2% Ø isolat (mm) Ø zona (mm) Index Manolitik Keterangan
1 Pari 1 6 15 1,5 Putih keruh
2 Pari 2 7 15 1,14 Putih keruh kekuningan
3 Pari 3 6 32 4,33* Putih keruh
4 Pari 4 5 17 2,40* tepi bening. bagian tengah berwarna putih
5 Pari 5 5 18 2,60* Putih kecoklatan
6 Pari 6 8 9 0,13 tepi bening. bagian tengah berwarna putih. 7 Pari 7 10 10 0,00 Bentuk melebar dari tengah. gradasi warna putih
8 Pari 8 8 10 0,25 Putih kekuningan
9 Pari 9 6 8 0,33 Putih kekuningan
10 Pari 10 7 10 0,43 Putih kekuningan
11 Pari 11 9 9 0,00 Putih kekuningan
12 Pari 12 10 18 0,80 Putih kekuningan
13 Pari 13 5 9 0,80 Putih kekuningan
14 Pari 14 5 6 0,20 Putih kekuningan
15 Pari 15 5 7 0,40 Putih kekuningan
16 Pari 16 9 17 0,89 Putih kekuningan
17 Pari 17 7 7 0,00 Putih kekuningan
18 Pari 18 6 15 1,50 Putih kecoklatan
19 Pari 19 9 11 0,22 Putih kekuningan
20 Pari 20 6 8 0,33 Putih kekuningan
Aktivitas Enzim Mananase
Aktivitas enzim mananase dilakukan pada ketiga bakteri potensial yaitu isolat Pari 3, Pari 4 dan Pari 5 yang mempunyai nilai IM yang cukup tinggi hasil dari uji kualitatif dengan pewarnaan congo red. Penentuan aktivitas enzim mananase menggunakan metode dinitrosalicylic acid dengan locust bean gum sebagai substratnya. Pengukuran aktivitas enzim mananase berdasarkan satuan unit yaitu satu unit aktivitas enzim mananase didefinisikan sebagai banyaknya
enzim yang dapat memproduksi 1 µmol manosa dalam 1 menit (Lehninger et al. 2004). Perhitungan aktivitas enzim mananase adalah sebagai
berikut:
Keterangan: C = konsentrasi enzim p = faktor pengenceran t = waktu
BM = berat molekul
Hasil pengukuran aktivitas enzim mananase untuk isolat Pari 3 menunjukkan kurva pertumbuhan jumlah sel mempunyai pola yang sama dengan aktivitas enzim mananasenya (Gambar 6). Data aktivitas enzim dilengkapi dengan data kurva pertumbuhan yaitu mengunakan metode pengukuran panjang gelombang 660 nm untuk mendapatkan hubungan antara kisaran jumlah sel bakteri yang tumbuh dengan tingkat aktivitas enzimnya selama masa fermentasi. Aktivitas enzim dengan pertumbuhan sel bakteri manolitik Pari 3 dapat dilihat pada gambar 6 dan diperoleh keterangan bahwa tingkat aktivitas enzim paling tinggi terlihat pada hari ke 2 yaitu 2,474 U/mL hal tersebut dapat terlihat pada grafik dibawah. Aktivitas enzim yang optimum sesuai dengan jumlah sel bakteri yang mencapai jumlah optimum atau mencapai puncak tertinggi pada hari kedua dan penurunan aktivitas enzimnya juga sesuai dengan jumlah sel yang semakin menurun.
Aktivitas enzim mananase (U/mL) =
Pola degradasi enzim mananase yang dihasilkan oleh isolat Pari 3 merupakan pola degradasi tipe eksoenzim karena substrat dimanfaatkan berbanding lurus dengan jumlah sel, sehingga dapat diasumsikan bahwa enzim yang terbentuk memotong gugus manosa dari ujung terluar ikatan polisakarida dengan menghasilkan monosakarida berupa manosa. Hal tersebut dapat dikarenakan substrat telah sempurna terhidrolisis (Aryanthi 2008).
Gambar 6. Aktivitas enzim mananase dan jumlah sel bakteri Pari 3
( ) OD 660 nm dan ( ) Aktivitas enzim mananase.
Pada grafik perbandingan aktivitas enzim dan kurva pertumbuhan bakteri manolitik laut Pari 4 nampak pada gambar 7 dan menerangkan pada hari ke 2 dan ke 3 memiliki nilai aktivitas yaitu 1,193 U/mL dan 1,174 U/mL. Aktivitas enzim dengan kurva pertumbuhan Pari 4 dan Pari 5 dapat disimpulkan bahwa kedua bakteri tersebut mempunyai fase optimum jumlah sel yang cukup stabil dan dari banyaknya gula reduksi yang terbentuk bersifat tidak konstan maka dapat disimpulkan bahwa enzim yang dihasilkan merupakan enzim mananase tipe endoenzim yang dapat memotong secara random dari sisi tengah ikatan rantai linier polisakarida, sehingga pada analisis gula reduksi manosa yang terbentuk tidak dipengaruhi jumlah sel yang terbentuk namun lebih kepada kinerja enzim yang menghasilkan monosakarida.
0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.000 0.900 1.800 2.700 0 24 48 72 96 A 660 n m U/m L Waktu (Jam)
Gambar 7. Aktivitas enzim mananase dan jumlah sel bakteri Pari 4 ( ) OD 660 nm dan ( ) Aktivitas enzim mananase.
Pada gambar 8 dapat terlihat aktivitas enzim bakteri manolitik Pari 5 meningkat pada hari ke 3 yaitu sebesar 1,087 U/mL namun pada grafik jumlah sel hari ketiga menunjukan penurunan, hal ini dapat simpulkan bahwa substrat yang tersedia telah maksimal dihidrolisis oleh enzim secara random pada hari pertama hingga kedua menjadi golongan manobiosa atau manotriosa yang kemudian akan didegradasi secara sempurna menjadi monosakarida pada hari ketiga dan setelah seluruh substrat telah terdegradasi dengan sempurna menjadi monosakarida maka aktivitas enzim menurun pada hari ke empat.
Gambar 8. Aktivitas enzim mananase dan jumlah sel bakteri Pari 5 ( ) OD 660 nm dan ( ) Aktivitas enzim mananase.
0.000 0.060 0.120 0.180 0.000 0.300 0.600 0.900 1.200 1.500 0 24 48 72 96 A 660 n m U/m L Waktu (Jam) 0.000 0.060 0.120 0.180 0.000 0.400 0.800 1.200 0 24 48 72 96 A 660 n m U/m L Waktu (Jam)
DNA Genom
Isolasi DNA genom bakteri manolitik laut dilakukan sesuai dengan prosedur yang tertera pada Kit INSTAGENE BioRad. Hasil pengamatan dapat dilihat pita DNA genom pada elektroforesis gel agarose dengan agarose 1 % untuk mengetahui ukuran pasang basa yang pada genom maka digunakan standar yaitu marker 1 kb dari Gene Ruler ™ (Ladder) Fermentas. Hasil elektroforesis DNA genom menunjukkan keberhasilan dalam mengisolasi genom dari ketiga bakteri manolitik terpilih dengan ditandai oleh adanya pita-pita DNA yang nampak pada agarosa yang sesuai dengan Marker yang dijadikan acuan, yaitu di atas 6000 bp.
Gambar 9. Elektroforegram DNA genom bakteri manolitik laut Marker (1), Pari 3 (2), Pari 4 (3), dan Pari 5 (4).
Hasil elektroforesis menunjukkan pita yang terlihat mempunyai pola yang smear. Hal tersebut dikarenakan volume contoh yang dimasukan ke dalam sumur agarosa terlalu sedikit ataupun terlalu lamanya waktu perendaman dengan etidium bromida dan pada saat pencucian (Gambar 9).
Amplikon Gen 16S rRNA
DNA Genom yang telah berhasil diisolasi selanjutnya di PCR dengan menggunakan universal primer forward λF (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-) dan primer reverse 1510R (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-). Amplifikasi dilakukan dalam thermocycler dengan kondisi pre-denaturasi awal selama 2 menit pada suhu 95ºC, tahap denaturasi selama 30 menit pada suhu 95ºC tahap annealing selama 1 menit pada suhu 55ºC dan tahap extension selama 2 menit pada suhu 72°C. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA selanjutnya dapat dilihat dengan elektroforesis agarosa 1%. Proses elektroforesis dilakukan dengan menggunakan acuan marker 1 kb dari Gene Ruler ™ (Ladder) Fermentas.
Pita-pita penanda pada maker 1 kb memiliki 14 pita dengan ukuran terbesar yaitu 10.000 pasang basa sedangkan yang terkecil yaitu 250 pasang basa. Sedangkan pita bakteri manolitik laut Pari 3, Pari 4 dan Pari 5 yang telah melalui proses PCR berhasil diisolasi (Gambar 10) dengan menghasilkan pita pada elektroforegram sesuai dengan ukuran pasang basa untuk mengidentifikasi gen 16S rRNA yaitu dengan kisaran 1.500 pasang basa. Sehingga dapat disimpulkan bahwa primer serta kondisi PCR yang digunaka dapat mengamplifikasi amplikon dengan baik sesuai dengan target gen 16S rRNA (Lauroa et al. 2009).
Gambar 10. Elektroforegram amplikon hasil identifikasi 16S rRNA
Marker (1), Pari 3 (2), Pari 4 (3), Pari 5 (4).
6000 bp 3000 bp 1500 bp 1000 bp
Pohon Filogenetik Bakteri Manolitik Pari 3
Amplikon yang telah berhasil diisolasi selanjutnya akan ditentukan urutan nukleotidanya dengan cara sekuensing. Sekuensing gen hasil PCR 16S rRNA dilakukan di Laboratorium 1st Base Singapura. Identifikasi gen 16S rRNA dari bakteri manolitik laut Pari 3 berdasarkan hasil sekuensing berupa data kromatogram dan urutan nukleotida, dari data kromatogram maka dapat terlihat puncak-puncak yang tidak sempurna (Lampiran 5), oleh sebab itu perlunya dilakukan pengeditan dengan program bioedit. Selanjutnya data urutan hasil pengeditan pada ujung forward dan reverse akan melalui proses contiq sehingga dapat diperoleh urutan gen 16S rRNA yang lengkap (Lampiran 2). Hasil urutan contiq akan diolah oleh program RDP yang akan dibandingan dengan data yang sudah pada data Gene Bank, selanjutnya dapat disimpulkan bahwa isolat Pari 3 tergolong atas domain Bacteria, filum Firmicutes, kelas Bacilli, ordo Bacillaceae dan genus Bacillus.
Untuk melihat kekerabatan Pari 3 berdasarkan perbandingan dengan bakteri yang telah diketahui susunan basannya pada Bank data Ribosomal Database Project sehingga untuk mempermudah mengetahui identitas bakteri tersebut dapat terlihat pada pohon filogenetik (Gambar 11). Sedangkan untuk keterangan lebih spesifik yang diperoleh dari bank data dengan menggunakan perangkat RDP maka disimpulkan bahwa Pari 3 memiliki kekerabatan dekat dengan Bacillus safensis (FO-036b;AF234854) dengan nilai keidentikan sebesar 0,919 dengan urutan basa yang sama sebanyak 1354 pasang basa dan Bacillus pumilus (ATCC 7061;AY876289) dengan nilai keidentikan sebesar 0,920 dengan urutan basa yang sama sebanyak 1352 pasang basa. Menurut Hagstrom 2002. Jika kemiripan ≥ λ3%
maka dianggap satu spesies yang sama namun menurut Schloss dan Handelsman 2004. bila kemiripan maksimum ≥ λ7% maka dianggap satu spesies yang sama.
Hasil identifikasi bakteri Pari 3 mempunyai hasil kekerabatan 91,1% dengan Bacillus safensis dan 92% dengan Bacillus pumillus.
Dari keduanya menyatakan presentase kekerabatan yang kurang dari 93% dan 97%. oleh karena itu dapat diduga bahwa bakteri Pari 3 merupakan strain baru dan dapat diteliti lebih lanjut.
dengan Bacillus anthracis dan 92,2% dengan Bacillus cereus. Menurut Hagstrom 2000, jika kemiripan ≥ λ3% maka dianggap satu spesies yang sama, maka dapat diduga bahwa bakteri Pari 4 merupakan Bacillus anthracis.
.
Gambar 12. Pohon filogenetik bakteri manolitik laut Pari 4 dan Pari 5.
Dari data yang terlihat diatas maka penentuan species dari Pari 5 memiliki kekerabatan dekat dengan Baccilus anthracis (ATCC 14578; AB190217) sebesar 0,971 dengan urutan basa yang sama sebanyak 1236 pasang basa dan Bacillus
Bacillus_mycoides_(T)_ATCC6462. Bacillus_weihenstephanensis_(T)_DSM11821. Bacillus_thuringiensis_(T)_IAM_12077. Bacillus_cereus_(T)_ATCC_14579. Bacillus_cereus_(T)_ATCC_14579.(2) Bacillus_anthracis_(T)_ATCC_14578. Pari_4 PARI_5 Bacillus_luciferensis_(T)_LMG_18422. Bacillus_panaciterrae_(T)_Gsoil_1517. Falsibacillus_pallidus_(T)_CW_7. Bacillus_aeolius_(T)_type_strain:_4-1. Bacillus_vireti_(T)_LMG_21834. Bacillus_fastidiosus_(T)_DSM_91. Bacillus_litoralis_(T)_SW-211. Bacillus_humi_(T)_type_strain:_LMG_22167. Bacillus_galactosidilyticus_(T)_type_strain:_LMG_17892. Aeribacillus_pallidus_(T)_DSM_3670*. Paraliobacillus_ryukyuensis_(T). Paraliobacillus_quinghaiensis_(T)_YIM_C158. Anaerobacillus_arseniciselenatis_(T)_E1H. Bacillus_halodurans_(T)_DSM_497T. Bacillus_gibsonii_(T)_DSM_8722. Bacillus_pseudofirmus_(T)_DSM_8715. Bacillus_thermocloacae_(T)_DSM_5250. Marinococcus_halophilus_(T)_DSM_20408. Marinococcus_luteus_(T)_YIM_91094 Aquifex_pyrophilus_(T)_Kol5a. 100 100 96 46 62 89 88 65 51 46 41 31 78 5 15 17 53 100 63 47 45 46 44 100 0.005
cereus (ATCC 14579;AE016877) sebesar 0,952 dengan urutan basa yang sama sebanyak 1428 pasang basa. Hasil identifikasi bakteri Pari 5 mempunyai hasil kekerabatan 97,1% dengan Bacillus anthracis dan 95,2% dengan Bacillus cereus. Menurut Hagstrom 2002, jika kemiripan ≥ λ3% maka dianggap satu spesies yang
sama, maka dapat diduga bahwa bakteri Pari 5 merupakan Bacillus anthracis. Kekerabatan Pari 4 dan 5 diketahui berdasarkan perbandingan dengan bakteri yang telah diketahui urutan basannya pada Gene Bank dengan menggunakan program Ribosomal Database Project dan program MEGA 5 yang digunakan untuk melakukan konstruksi pohon filogenetik untuk mengetahui kekerabatan dan rentang evolusi bakteri tersebut. Konstruksi pohon filogenetika dari kedua isolat Pari 4 dan Pari 5 dibuat satu pohon karena satu sama lain mempunyai kemiripan yang hampir identik setelah dibandingkan dengan Gene Bank, dan hasil pohon filogenetika yang terbentuk dapat dilihat pada Gambar 12.