Manan
Manan merupakan senyawa hemiselulosa yang terdapat di alam dan merupakan polisakarida kedua yang sangat melimpah setelah selulosa. Manan dapat diklasifikasikan menjadi macam tipe dari mannopolisakarida yaitu linier manan, galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan (Zahura et al. 2011). Manan terdiri atas susunan gula sederhana manosa, galaktomanan terdiri atas manosa dan galaktosa, glukomanan terdiri atas manosa dan glukosa, sedangkan galaktoglukomanan tersusun dari manosa, galaktosa dan glukosa (Sachselehner et al. 2000). Struktur manan berbentuk linier atau bercabang yang dapat pula ditemukan sebagai heteroglikan pada tumbuhan tingkat tinggi, variasi struktur senyawa kompleks hemiselulosa mannan (Gambar 1).
Gambar 1. Kelompok Hemiselulosa: (a) Manan (b) Galaktomanan (c) Glukomanan (d) Galaktoglukomanan (Dhawan et al. 2007)
Manan terutama terdapat pada kayu lunak, endosperma kopra, kelapa sawit, kopi, dan locust bean gum. Locust bean gum adalah substrat yang mengandung galaktomanan yang berasal dari tanaman Ceratonia siliqua. Locust bean gum dapat menginduksi sekresi enzim mananase yang dapat menghidrolisis rantai tulang punggung galaktomanan maupun rantai sampingnya. Locust bean gum terdiri atas komponen galakto-D-manoglikan 88%, pentan 4%, protein 6%, selulosa 1%, dan mineral 1% (Sumardi 2004).
Enzim Mananase
Enzim adalah biokatalisator yang berfungsi untuk mempercepat laju reaksi kimia dalam suhu dan derajat keasaman yang spesifik. Enzim juga dapat berupa protein sederhana atau protein yang terikat pada gugus non-protein, enzim bersifat spesifik untuk substrat tertentu. Enzim dapat diklasifikasikan berdasarkan beberapa reaksi seperti reaksi oksidasi-reduksi, perpindahan komponen kimia, hidrolisis, pengurangan atau penambahan suatu zat kimia, isomerasi, dan adanya unit substrat yg berikatan (polimerasi) (Lehninger et al. 2004).
Enzim merupakan biokatalisis yang penggunaannya dibatasi oleh suhu, tekanan, pH, dan kekuatan ion. Enzim juga merupakan zat yang dapat bereaksi di dalam sel hidup, enzim mengkatalisis semua aspek metabolisme sel seperti dalam proses pencernaan makanan yang meliputi hidrolisis senyawa protein, karbohidrat, dan lemak menjadi molekul yang lebih kecil; penyimpanan dan
perpindahan energi kimia serta pembentukkan struktur penyusun sel (Purawadaria et al. 1994).
Enzim mananase merupakan enzim pengurai heteromanan menjadi manosa, glukosa, dan galaktosa. Enzim Mananase adalah enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis proses hidrolisis manan yang merupakan senyawa polisakarida. Degradasi manan oleh bakteri, fungi, cendawan dan tanaman
memerlukan variasi enzim seperti β-Mananase (EC 3.2.1.78) yang dapat menghidrolisis β-1,4-D manopiranosil pada kerangka utama polimer manan seperti pada galaktomanan dan glukomanan untuk menghasilkan rantai pendek manooligosakarida. Selanjutnya senyawa tersebut dihidrolisis oleh kerja enzim β -manosidase (EC 3.2.1.25) dan α-galaktosidase (EC 3.2.1.22) menghasilkan
manosa dan galaktosa (Duffaud et al. 1997). Proses hidrolisis dari senyawa heteromanan galaktomanan memerlukan komplek enzim mananase yaitu enzim galaktosidase untuk memotong rantai ikatan galaktosa dengan manosa dan enzim mananase untuk memotong rantai ikatan manosa dengan manosa. Pada senyawa glukomanan diperlukan komples enzim mananase glukosidase dengan mananase untuk menghasilkan gula sederhana. Enzim glukosidase berfungsi untuk memotong ikatan rantai glukosa dengan manosa sehingga hasil akhir hidrolisis berupa glukosa dan manosa (Gambar 2).
Gambar 2. Pemotongan heteromanan oleh komplek enzim mananase (Kurakake et al. 2001).
Enzim Mananase merupakan kelompok enzim glikosida hidrolase yang dapat mendegradasi manan dan heteromanan. Enzim glikosida hidrolase (E.C 3.2.1) merupakan kelompok enzim yang telah diketahui dapat menghidrolisis ikatan glikosidik pada oligo-dan polisakarida. Untuk menghidrolisis substrat karbohidrat yang mempunyai struktur kompleks maka dibutuhkan kombinasi berbagai macam enzim untuk dapat mendegradasi menjadi senyawa manooligosakarida. Enzim yang termasuk dalam kelompok glikosida hidrolase mempunyai sumber yang berbeda-beda yaitu bakteri, kapang maupun jamur sehingga enzim tersebut dapat diklasifikasikan menjadi kelas yang berbeda menurut urutan sekuen asam amino dan struktur tiga dimensi molekul enzimnya (Dhawanet al.2007).
Perbandingan hasil sekuen dari enzim β-mananase menunjukan bahwa ada dua famili yaitu famili 5 dan 26. Famili 5 merupakan perbandingan dari hasil sekuen bakteri Caldocellum saccharolyticum, Caldibacillus, Vibrio, Aspergillus aculeatus, Trichoderma reesei dan Agaricus bisporus dan mananase dari kelompok eukariotik seperti Lycopersicon esculentum dan Mytilus edulis. Famili 26 terdiri atas hasil sekuen mananase dari Bacilli sp., Cellvibrio japonicus, Pseudomonas fluorescens dan Rhodothermus marinus. Adapun enzim mananase dari bakteri dan eukariotik terdapat dalam daftar famili 5 dengan suatu pengecualian untuk beberapa fungi anaerobik, sedangkan untuk famili 26 sebagian besar terdiri atas bakteri origin. Namun dalam beberapa hal tertentu, enzim mananase yang dihasilkan dari mikroorganisme yang bergenus sama dapat diklasifikasikan pada kedua famili 5 dan 26 (Dhawanet al.2007).
Mikroba Manolitik
Perairan laut merupakan ekosistem terbesar di bumi karena lebih dari 90% biosfer terdiri atas sejumlah mikroorganisme laut bertanggung jawab atas 50% produksi bahan-bahan utama untuk memenuhi kebutuhan ekosistem laut sebagai kebutuhan makanan serta energi untuk mlakukan metabolisme bagi habitat yang lain. Dalam lingkungan perairan laut, bakteri mempunyai peranan penting sebagai pengatur siklus biogeokimia agar selalu bersifat konstan seperti proses asimilasi, pengendapan, transformasi, perpindahan, dan remineralisasi unsur karbon yang
berada pada laut. Tingkat aktivitas mikroba laut dalam mendegradasi unsur karbon dapat diteliti berdasarkan keberadaan nutrisi yang tersedia di habitatnya. Karakteristik bakteri laut memerlukan air laut atau kadar garam, sehingga bakteri laut digolongkan ke dalam kelompok bakteri halofilik, diantaranya bakteri halofilik moderat yang membutuhkan 1% hingga 20% NaCl untuk pertumbuhannya dan bakteri halofilik ekstrem yaitu memerlukan 15% hingga 31% NaCl untuk pertumbuhannya (Ruyitno 2004).
Nutrisi karbon yang terdapat pada laut tidak seragam karena luasnya area perairan menyebabkan nutrisi yang terkandung mempunyai tingkat konsentrasi yang berbeda-beda. Tingkat kedalaman juga mempengaruhi jenis nutrisi yang terkandung pada bagian laut tertentu, misalnya pada laut dalam hanya dihasilkan nutrisi karbon yang berasal dari hasil degradasi mikroba yang berada pada endapan tanah dan tidak mempunyai aktivitas terhadap sinar matahari. Sedangkan untuk perairan laut dangkal mempunyai nutrisi yang lebih kaya karena mikroba mendapatkan energi dari sinar matahari untuk melakukan aktivitas metabolisme dan adanya interaksi dari fitoplankton yang dapat mendegradasi senyawa organik. Oleh sebab itu mikroba pada permukaan air laut mempunyai kemampuan yang lebih beragam dalam mendegradasi sumber karbon (Lauroa et al. 2009).
Dasar dari ketertarikan untuk melakukan eksplorasi mikroba laut untuk memperkaya jenis enzim mananase karena selama ini eksplorasi lebih banyak dilakukan untuk mikroba darat. Penelitian yang dilakukan sebelumnya telah menghasilkan enzim mananase termofilik laut dari bakteri Rhodothermus marinus, mikroba ini diisolasi dari perairan laut yang mempunyai suhu tinggi sehingga mempunyai aktivitas enzim mananase yang cukup unik dalam mendegradasi sumber manan seperti galaktomannan pada substrat locust bean gum, mikroba manolitik laut ini telah diketahui menghasilkan enzim mananase glikosidasi famili 26 yang bersifat termofilik yaitu tahan hingga suhu 85° C
setelah melalui proses karakterisasi enzim dan analisis sekuen DNA (Politz et al. 2000).
Enzim pendegradasi polisakarida seperti selulase (β-1,4-glukanase) dan β -1,4-xilanase memiliki struktur modul yang terdiri atas modul katalitik dan modul pengikat karbohidrat (CBM). Berdasarkan pada kesamaan homologi hasil sekuen
asam amino, enzim glikosida hidrolase (GH) dan CBM diklasifikasikan menjadi famili 112 dan 52. Sistem klasifikasi membagi enzim β-mananase menjadi dua
famili yaitu GH 5 dan 26. Enzim β-mananase telah diisolasi dari berbagai jenis tanaman, fungi dan bakteri sehingga banyak pula literatur tentang gen yang menyandi enzim mananase yang telah dikloning maupun disekuen berasal dari mikroba darat, namun telah diketemukan mikroba laut Vibrio sp. Strain MA-138 penghasil enzim mananase yang telah dimurnikan dan diketahui memiliki enzim mananase terbaru yaitu famili 27 berdasarkan modul pengikat karbohidratnya yang menyandi enzim Man5C yaitu mempunyai wilayah terminal karbohidrat pada spesifik domain, jenis enzim ini mempunyai kemampuan untuk mengikat β -manan dan aktivitas katalitik yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat polisakarida (Tanaka et al. 2009).
Manfaat Enzim Mananase
Pemanfaatan enzim mananase pada dunia industri sangat beragam karena enzim ini mempunyai daya hidrolisis yang tinggi dan cukup stabil pada suhu tinggi karena bersifat termostabil. keunggulan yang dimiliki oleh enzim mananase membuatnya cukup populer, namun selain keunggulan enzim tersebut adapula kekurangannya yaitu produksi enzim mananase cenderung membutuhkan biaya produksi yang tinggi. Hal ini pula yang menyebabkan para peneliti berusaha untuk mencari solusi untuk menekan biaya produksi dengan memanfaatkan mikroba potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dengan tingkat produksi yang tinggi dan kemurnian yang baik.
Penggunaan enzim mananase sebagai zat penambah pakan menunjukkan beberapa pengaruh yang menguntungkan. Keuntungan tersebut terlihat dalam kombinasi dengan bahan pakan lain seperti guar gum, kopra, alfalfa, bungkil sawit dan kedelai yang mengandung manan dengan jumlah yang signifikan. Untuk ternak monogastrik seperti unggas dan babi, manan merupakan komponen pakan yang tidak dapat dicernakan karena beraksi sebagai faktor antinutrisi. Pengaruh negatif manan telah dilaporkan mengurangi pertumbuhan ternak, efisiensi penggunaan dan nilai nutrisi dalam pakan. Sebaliknya mananase ketika ditambahkan dalam diet corn-soybean meal untuk ayam petelur dapat
meningkatkan produksi telur dan berat telur. Enzim mananase juga digunakan sebagai pakan ternak yang dikombinasi dengan karbohidrat dalam diet ternak. Hasilnya menunjukkan perbaikan terhadap tingkat pertumbuhan dan daya cerna nutrisi (Dahwan et al. 2007).
Dalam industri makanan enzim mananase digunakan untuk produksi kopi instan karena enzim ini dapat mengurangi viskositas ekstrak kopi sehingga memudahkan proses hidrolisis manan kopi. Hal ini menyebabkan pengurangan biaya energi dalam proses pengeringan dalam produksi kopi instan, karena air yang terikat pada manan akan terlepas karena adanya degradasi enzim mananase. Selain itu mananase digunakan untuk menghasilkan monooligomer spesifik yang penting sebagai bahan pangan fungsional, seperti monooligomer yang berfungsi sebagai prebiotik (Sachslehner et al. 2000).
Enzim mananase juga digunakan dalam detergen, berfungsi dalam menfasilitasi penghilangan sisa kotoran dan kosmetika dari zat warna dan tanah. Mananase pada detergen dapat berfungsi pula sebagai penstabil, pengembang dan penghalus. Untuk beberapa jenis detergen, aplikasi mananase juga dapat dikombinasikan dengan enzim-enzim lainnya seperti amilase, selulase, lipase, pektinase, protease dan endoglukanase (Kensch et al. 2008).
Enzim mananase berfungsi sebagai zat pemutih pada bubur kertas. Efektifitas enzimatis yang terjadi pada proses pemutihan selalu berdasarkan pada jenis kayu yang digunakan dan metode pembuburan kertas, karena enzim mananase hanya dapat bekerja apabila kadar ligninnya rendah (Zhang et al. 2000). Enzim mananase pada industri minyak dan gas dapat diaplikasikan sebagai stimulator untuk proses pematahan hidrolik, hal ini disebabkan sifat termostabil dari enzim yang cukup baik. Sistem kerja enzim ini ialah mengurangi tingkat viskositas larutan pada saat berlangsungnya proses pematahan hidrolik minyak dan gas pada suhu tinggi (Dhawanet al.2007).
Aplikasi yang lainnya digunakan dalam bidang pengolahan pangan dan pakan yaitu untuk produksi manno-oligosakarida sebagai prebiotik penting pada bungkil kelapa sawit baik untuk pangan maupun pakan. Produk prebiotik dapat diperoleh dengan melakukan proses hidrolisis mananase terhadap bungkil kelapa sawit atau galaktomanan yang kaya akan kandungan manno-oligosakarida dan
D-mannosa. Manno-oligosakarida dapat memacu pertumbuhan probiotik (seperti Bifidobacteria dan Lactobacillus sp), dan menghambat pertumbuhan enterobacteria Salmonella, serta menetralkan sifat-sifat antinutrisi dari lectin (Yopi et al. 2007).
Bioinformatika
Bioinformatika merupakan ilmu yang dapat menghubungkan informasi yang meliputi biologi molekular, struktur biokimia, enzimologi, biologi sel, fisiologi dan patologi dengan menggunakan sistem komputerisasi berdasarkan data yang telah dikumpulkan. Definisi bioinformatika adalah ilmu yang dapat mengorganisir dan menganalisis data kompleks dengan ilmu biologi molekular dan biokimia modern berdasarkan pada informasi yang tersimpan di dalam sekuen nukleotida-DNA, sebagai dasar tersusunnya molekul kehidupan yaitu protein. National Center for Biotechnology Information (NCBI) merupakan organisasi yang diperkenalkan pada tahun 1988 di Serikat yang bertujuan untuk memproses data secara komputerisasi dalam bidang biomedical dan biokimia. Pada saat itu NCBI berada di dalam National Library of Medicine (NLM), yaitu badan yang menangani data base biomedikal. NCBI sendiri secara spesifik bergerak dalam bidang pengembangan alat analisis untuk membantu dalam mengerti proses genetik dan molekular maupun sifat-sifat patogenik. Organisasi NCBI mempunyai tujuan pokok, yaitu meliputi 1) menciptakan mekanisme otomatis yang dapat menganalisis dan menyimpan data yang berhubungan dengan biologi molekular, genetik dan biokimia. 2) memfasilitasi penggunaan data base dan perangkat lunak yang tersedia kepada komunitas sains, seperti peneliti, pekerja dalam bidang kesehatan maupun mahasiswa. 3) mengkoordinasi komunitas sains global di seluruh dunia untuk mengumpulkan data genetik dan 4) melakukan penelitian baru yang berhubungan dengan analisis struktur dan hubungan fungsional antara molekul biologis secara komputerisasi (Rashidi et al. 2000).
16S rRNA Ribosom
RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti zat pembentuk protein pada suatu makhluk hidup. Molekul rRNA bersifat ubikuitus dengan fungsi yang
identik pada seluruh organisme. Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein yang terdiri atas dua subunit yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar (large subunit). Terdapat tiga jenis RNA dalam ribosom prokariotik berdasarkan nilai koefisien sedimentasi, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Gen 16S rRNA merupakan bagian dari subunit kecil ribosom dan berperan penting dalam pengenalan ujung 5’–mRNA serta memposisikan pada letak yang tepat dalam ribosom (Clarridge, 2004).
RNA ribosom pada semua sel memiliki daerah yang urutan basanya sangat lestari dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa yang lestari berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik karena mengalami perubahan dengan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies (Pangastuti, 2006).
Dari tiga jenis rRNA yang dimiliki prokariot, gen penyandi 16S rRNA paling sering digunakan sebagai penanda molekular karena memiliki ukuran basa yang paling ideal dari segi analisis statistika dibandingkan gen penyandi 5S rRNA dan 23S rRNA. Molekul 5S rRNA memiliki ukuran basa yang terlalu pendek sehingga tidak ideal untuk analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. Tingkat kelestarian yang tinggi dan kemudahannya untuk mengukur variasi dari 16S rRNA menjadikan gen penyandi 16S rRNA secara luas digunakan pada penentuan taksonomi, filogeni (hubungan evolusioner), dan memperkirakan laju penyebaran bakteri (Weisburg et al. 2001). Penelitian mengenai kekerabatan evolusioner di antara mikroorganisme berdasarkan perbandingan urutan basa 16S rRNA dipelopori oleh Carl Woese (Krane dan Raymer, 2003). Berdasarkan urutan basa 16S rRNA, Woese mengajukan tiga domain dalam sistem klasifikasi yaitu Archaea, Bacteria dan Eucarya. Dua bakteri dapat dikelompokkan dalam satu genus bila memiliki kemiripan maksimum (maximum identity) ≥ λ3%. Sementara dua bakteri dianggap sebagai satu spesies bila memiliki kemiripan
Identifikasi 16S rRNA dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
Identifikasi molekuler digunakan untuk mempelajari kesamaan deoxyribonucleic acid (DNA) atau homologi genetik diantara organisme. Kesamaan DNA dapat dipelajari dengan sekuensing terhadap basa DNA atau RNA dan hibridisasi DNA (Malik 2006). Penggunaan untai gen ribosomal RNA untuk klasifikasi mikroorganisme saat ini merupakan salah satu analisis yang cukup akurat untuk menentukan kekerabatan diantara mikroorganisme (Suryadi 2002). Situs DNA molekul 16S rRNA dikenal mempunyai informasi genetik yang cukup lengkap untuk melihat kekerabatan bakteri (Leblond et al. 1996).
Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode untuk membuat salinan segmen spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih cepat daripada pengklon gen dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan in vitro (Campbell 2002).
Gen pengkode 16S rRNA terdapat bagian penyimpan yang berguna untuk mendisain primer universal PCR yang mampu memperbanyak beberapa fragmen 16S rRNA dari semua bakteri pathogen dan nonpatogen. Fragmen ini termasuk bagian hipervariable yang tidak mudah termutasi dan mengandung tanda urutan spesifik spesies yang berguna untuk mengidentifikasi bakteri hingga ke level spesies (Israhmadini 2008).
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polymerase. Setiap siklus dikondisikan pada temperature berbeda yang telah diprogram oleh mesin yang disebut thermal cycler. Dasar siklus PCR ada 30-35, siklus ini meliputi: denaturasi (95°C) untaian ganda DNA dipisahkan, annealing (55-60°C) primer dibiarkan berikatan dengan ujung-ujung urutan target yang spesifik, dan ekstensi (72°C). Taq polimerase
menambahkan nukleotida pada ujung 3’ primer dengan menggunakan untai DNA
yang lebih panjang sebagai cetakannya (Kuchel et al. 1998). Sedangkan untuk waktu tergantung pada panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk amplifikasi. Campuran reaksi PCR terdiri atas komponen-komponen yaitu
template DNA, buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), primer dan unit taq polimerase.
Ribosomal Database Project (RDP)
Metode Ribosomal Database Project (RDP) adalah program yang menggunakan pengukuran gen berdasarkan program algoritma. Kesesuaian susunan yang diperoleh dapat dibandingkan dengan gen yang sudah ada sebelumnya. RDP, menyediakan metode untuk pencarian database nukleotida dan protein secara cepat dan akurat. RDP juga dapat digunakan untuk mengetahui hubungan fungsional dan evolusioner dari spesies yang berhubungan. Secara umum perangkat lunak RDP dpat diaplikasikan secara online melalui http://www.rdp.com yaitu meliputi memasukan data sekuen hasil bioedit, memilih program dan data base yang diinginkan, memilih format output dan melakukan pencarian database dan menyimpan hasilnya. Sedangkan untuk melakukan perbandingan pohon kekerabatan dapat menggunakn program MEGA5 (Cole et al. 2009).
METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi pada Pusat Penelitian Bioteknologi
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor.
Bahan dan Alat
Alat yang digunakan adalah tabung analisis, cawan petri, oze, bunsen, kapas, gelas piala, mikrotips, erlenmeyer, neraca analitik, sentrifuge, mikropipet, tabung Eppendorf, thermometer, penangas air, pH meter Jenway 3505, magnetic stirer, hot stirer IKA RH basic 2, shaker incubator TAITEC Bioshaker BR-23FP, laminar air flow Bioclean Bench Sanyo, autoclave Tommy SX-500, spreader, inkubator bakteri SANYO, PCR ASTEC, elektroforesis Nyx Technik MIR-153, UV gel doc Scope WD, Freezer SANYO Ultra low. Bahan yang digunakan adalah sample air laut dengan media untuk proses pengkayaan dan identifikasi kualitatif menggunakan aquades, Artificial Sea Water, agar powder, substrat (Locust bean gum), pepton, ekstrak khamir, (NH4)2.SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, CO (NH2)2, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2, HCl, NaOH, NaCl, pewarna congo red. Bahan yang digunakan dalam proses analisis enzim mananase secara kuantitatif adalah Reagen berupa reagen dinitrosalisilat (DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH padat, fenol, Na2SO3, dan Kalium Natrium
Tartrat (KNa-tartrat). Bahan yang digunakan dalam proses identifikasi gen 16S rRNA dan kloning adalah strain bakteri potensial penyandi mananase,
InstaGene TM Matrix Biorad, agarosa, TAE (Tris Asetat EDTA), Etidium bromida, go taq®green master mix, primer 9F, primer 1510R.
Cara Kerja
Isolasi Mikroba LautMikroba laut yang digunakan dalam penelitian berasal dari Pulau Pari Teluk Jakarta, disampling dengan menggunakan metode sea water direct
sampling (sampel berupa air laut). Bakteri penghasil mananase diisolasi dengan teknik pengayaan mengikuti Mandels dan Stemberg (1976) dengan memodifikasi sumber karbon. Komposisi media pengayaan, skrining, purifikasi dan identifikasi secara lengkap seperti berikut: Substrat Locust bean gum 0,5%; Pepton 0,075%; Ekstrak khamir 0,05%; Mineral (NH4)2.SO4 0,14%; KH2PO4 0,2%; MgSO4.7H2O 0,03%; CO (NH2)2 0,03%; CaCl2 0,03%; FeSO4.7H2O 0,0005%; MnSO4.7H2O 0,00016%; ZnSO4.7H2O 0,00014%; CoCl2 0,0002% dan pH media 6.0. Mikroba mannolitik diisolasi dari kultur pengkayaan dengan locust bean gum sebagai sumber substrat (sumber karbon berupa manan). Kultur pengkayaan yang telah diinokulasikan air laut hasil sampling diinkubasi dalam shaker incubator selama satu minggu, kecepatan putar 150 rpm pada suhu ruang. Proses isolasi dilakukan dengan cara menginokulasikan hasil kultur pengayaan sebanyak 20 µL dengan faktor pengenceran 10-4 dan 10-5 pada media padat dengan cara disebar dengan menggunakan spreader kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Proses pemurnian isolat dilakukan dengan cara pick –up koloni tunggal yang telah tumbuh pada media isolasi dan ditumbuhkan pada media padat untuk proses identifikasi (Mandels dan Sternberg, 1976).
Uji Bakteri Manolitik Potensial
Identifikasi bakteri potensial penghasil enzim mananase dengan cara uji kualitatif dengan pewarnaan menggunakan metode congo red. Bakteri laut yang telah murni diinokulasikan pada media padat (komposisi media pengayaan dengan konsentrasi agar 1,5%) yang mengandung substrat manan (Locust Bean Gum 0,5%), kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan larutan pewarna congo red dengan konsentrasi 0,2% dan diinkubasi selama 15-30 menit pada suhu ruang, kemudian dilakukan pencucian sebanyak 3 kali dengan menggunakan larutan NaCl dengan konsentrasi 2%. Bakteri mannolitik potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dapat diketahui secara visual yaitu dengan nampaknya zona bening disekitar zona tumbuh koloni (Yopi et al. 2007).
Uji Aktivitas Enzim Mananase
Aktivitas enzim mananase diuji dengan memipet sebanyak 0,5 mL substrat locust bean gum 0,5% direaksikan dengan 0,5 mL enzim mananase lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1,5 mL reagen dinitrosalisilat (DNS). Perlakuan kontrol dengan cara substrat direaksikan dengan DNS lalu ditambahkan enzim. Sampel dan kontrol dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks
dan diukur absorbansinya pada = 540 nm (Miller 1959). Pembuatan kurva standar dilakukan dengan mereaksikan berbagai konsentrasi manosa dari 0-10 mg/ml sebanyak 1 mL dengan 1,5 mL DNS lalu dididihkan selama 15 menit dan didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya
pada = 540 nm. Satu unit aktivitas enzim mananase (U) didefinisikan sebagai sejumlah enzim yang dapat mengkatalisis konversi dari 1 mol substrat manan menjadi manosa dalam 1 menit (Bintang 2010).
Identifikasi Mikroba berdasarkan Analisis Gen 16S-rRNA
Isolasi Genom Total
Identifikasi bakteri manolitik diawali dengan mengisolasi DNA genom total menggunakan metode dari kit InstaGene TM Matrix BioRad. Koloni isolat
murni sebanyak satu ose dengan 250 µ L mili Q steril dan disentrifuge