Ekstraksi kotiledon menggunakan metode Garbayo et al .(1998), Sousa et al. (2002), dan El Amiri et al. (2007) termodifikasi, dari kotiledon kasar (249,19 g) setelah diekstrak dihasilkan presipitat seberat 15,36 g pada 80% (NH4)2SO4. Presipitasi garam umumnya menggunakan ammonium sulfat karena
sifatnya yang sangat larut dalam air. Adapun tujuan utama dilakukan presipitasi terhadap ekstrak kasar adalah untuk menghilangkan protein besar yang mengkontaminasi sehingga hanya protein yang dibutuhkan yang terikat oleh adanya kekuatan ion tanpa merusak aktivitas enzim dari protein yang dipurifikasi.
Persamaan linear (Y= -0,927 X + 2,178; R2 = 0,949) didapat dengan cara menghitung migrasi relatif marker yang dipergunakan terhadap log berat molekul marker yang telah diketahui berat molekulnya (Gambar 14). Pita protein yang terlihat pada monogel SDS-PAGE dari berbagai supernatan yang dikumpulkan selama proses ekstraksi, dapat diestimasi berat molekulnya dengan mengukur migrasi relatif yang dilakukan protein pada saat melewati monogel SDS-PAGE. (Champe et al. 2008; Stryer 1995).
Perbandingan jarak migrasi sampai pita protein muncul pada monogel terhadap jarak migrasi terjauh merupakan nilai migrasi relatif protein yang diuji. Estimasi berat molekul dapat dihitung dengan memasukan nilai migrasi relatif ke dalam persamaan linear di atas. Protein yang terkandung didalam ekstrak kotiledon plasenta (Gambar 15) terbagi menjadi 3 kelompok yaitu sekitar 70 kDa sebanyak 3 pita (77,4; 73,1; 68,8), sekitar 30 kDa sebanyak 7 pita (39,92; 38,68; 37,98; 36,04; 34,1; 33,53; 32,39) dan belasan sebanyak 6 pita (17,64; 16,08; 14,56; 14,52; 13,74; 12,18 ).
Gambar 14 Kemiringan persamaan linear perhitungan migrasi relatif untuk menentukan berat molekul protein ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG). X=migrasi relatif, Y=logBM
Purifikasi ovPAG dilakukan dengan mengalirkan ekstrak kotiledon pada kolom Sephadex-G75 dan DEAE-cellulose. Sephadex-G75 dipilih untuk filtrasi protein yang berada pada kisaran berat molekul 3 – 80 kDa (Sigma®) sedangkan DEAE-cellulose dimanfaatkan untuk pertukaran anion dengan menggunakan konsentrasi NaCl yang bertingkat sebagai upaya untuk mendapatkan protein yang mempunyai ikatan ion yang paling kuat. Penggunaaan NaCl pada kromatografi pertukaran anion karena ion Cl-1 dalam kondisi fisiologis normal banyak tersedia dalam membran plasma (Eggermont 2004).
Hal utama dari proses purifikasi adalah untuk meningkatkan rasio aktivitas enzim terhadap protein yang dielusi. Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) dipergunakan untuk memotong protein yang terkontaminasi enzim selain yang dipersiapkan untuk dievaluasi aktivitasnya. Gambar 15 Pita protein dari isolat hasil ekstraksi kotiledon yang terpapar pada monogel SDS-PAGE dengan pewarnaan Commassie Brilliant Blue Keterangan : M= marker; S0=material kasar; S1=S0 disentrifus;
S2=presipitasi asam; S3= 40%(NH4)2SO4; S4=80% (NH4)2SO4;
Mercaptoethanol panas dipergunakan untuk memotong ikatan disulfid dan mendenaturasi protein. Sementara SDS merupakan deterjen dipergunakan untuk mencuci muatan alami protein, sehingga semua protein mempunyai muatan ion yang sama (SDS mengikat secara stoichiometrikal, 1 SDS per 1,4 asam amino). Pada saat protein dilewatkan pada gel , dan aliran listrik dijalankan maka protein akan migrasi melalui pori-pori dalam gel poliakrilamid. Gel akan memisahkan protein berdasarkan kecepatan gerakan protein yang sebanding dengan logaritmik berat molekulnya. Ada dua hal utama yang penting dilakukan selama purifikasi yaitu total protein yang dielusi serta aktivitas enzim dari protein.
Seluruh fraksi yang tertampung (Tabel 1) dari kolom Sephadex-G75(S) maupun DEAE-cellulose (Tris-HCl atau DT, NaCl 20mM atau DN20, NaCl 40mM atau DN40, NaCl 80mM atau DN8, NaCl160 mM atau DN16, NaCl 320 mM atau DN32 dan NaCl 1 M atau DN1) diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer kemudian dibuat grafik (Gambar 16). Berdasarkan fluktuasi nilai absorbansi yang muncul, akan diperoleh beberapa fraksi yang memiliki nilai absorbansi tinggi. Fraksi ini dikumpulkan untuk dihitung total proteinnya.
Keterangan : Negatif = nilai lebih rendah dari standar
Tabel 1 Jumlah Fraksi dan Konsentrasi Protein pada Kolom Sephadex-G75 dan DEAE- cellulose
Gambar 16 Absorbansi protein dalam fraksi dari kolom Sephadex-G75 (NH4HCO3) dan DEAE-cellulose
Keterangan : S= Sephadex-G75; DT=DEAE-Tris-HCl 0,01 M;
DN2=DEAE- NaCl 20mM; DN4=DEAE- NaCl 40 mM; DN8=DEAE- NaCl 80 mM; DN16=DEAE- NaCl 160 mM; DN32=DEAE- NaCl 320 mM dan DN1=DEAE- NaCl 1M).
Fraksi DN2, DN4 dan DN1, mempunyai nilai absorbansi rendah dan fluktuasi tidak terlihat jelas, sedangkan pada DN8, DN16 serta DN32 meskipun nilai absorbansi tidak terlampau tinggi tetapi masih ada fluktuasi nilai absorbansinya sehingga dapat dikumpulkan untuk diukur total proteinnya. Fraksi S mempunyai nilai absorbansi yang cukup tinggi dengan fluktuasi yang jelas. Hal ini dimungkinkan karena kolom Sephadex-G75 hanya memisahkan protein berdasarkan ukuran protein saja.
Konsentrasi total protein (Tabel 1) yang terkandung didalamnya diukur dengan metode BCA Assay. Fraksi DEAE-NaCl 20 dan 40 mM serta 1M mempunyai nilai absorbansi yang rendah ternyata mempunyai konsentrasi protein yang nilainya lebih rendah dari standar sehingga tidak dipergunakan sebagai stok. Sedangkan fraksi S, DT, DN8, DN16 dan DN32 yang mempunyai total protein berturut-turut 181; 171; 2,67; 44,33 dan 86 ng/ml akan dipergunakan sebagai stok isolat murni ovPAG sebagai hasil purifikasi ekstrak kotiledon .
Protein yang telah diisolasi diukur berat molekulnya dengan mengalirkan isolat (S, DT, DN2, DN4, DN8, DN16, DN32 dan DN1) ke dalam monogel SDS- PAGE. Pita protein S mempunyai estimasi berat molekul 72,95; 32,16; 30,17 dan 11,73 kDa yang dihitung berdasarkan persamaan linear Y = -1,505x+2,164, R2=0,939 (Gambar 17).
Estimasi berat molekul protein pada DT; DN16, dan DN32 dapat dihitung berdasarkan persamaan linear Y=-1,444X +2,315; R2=0,935, (Gambar 18), sedangkan pita protein dari isolat DN2; DN4, dan DN1 tidak muncul pada monogel SDS-PAGE. Ada dua pita protein DT yaitu 30,86 dan 11,74 kDa, sedangkan pada DN16 dan DN32 masing-masing memiliki tiga pita protein pada 71,67; 33,64 dan 30,86 kDa. Ada satu pita protein yang memiliki berat molekul yang sama pada DT, DN 16 dan DN32 yaitu pada 30,86 kDa.
Gambar 17 Pita protein fraksi hasil gel filtrasi Sephadex-G75 Keterangan : M= marker; S=Sephadex-G75
1 1 8 k Da 8 6 5 1 ,6 3 4 ,1 2 9 1 9 ,2 7 ,5 2 0 3 M S 7 2 ,9 5 3 2 ,1 6 3 0 ,1 7 1 1 ,7 4
Gambar 18 Pita protein fraksi hasil kromatografi pertukaran anion DEAE Keterangan : M=Marker; DT=DEAE-TrisHCl 0,01 mM;DN2=DEAE-NaCl
20mM;DN4= DEAE-NaCl 40mM; DN8=DEAE-NaCl 80mM; DN16=DEAE- NaCl 160mM; DN32=DEAE-NaCl320mM; DN1= DEAE-NaCl 1M)
M DT DN2 DN4 DN8 DN16 DN32 7 1 ,6 7 3 3 ,6 4 3 0 ,8 6 1 1 ,7 4 3 0 ,8 6 1 1 8 kDa 8 6 5 1 ,6 3 4 ,1 2 9 1 9 ,2 7 ,5 2 0 3 M DT DN2 DN4 DN8 DN16 DN32 DN1
Pada penelitian ini ditemukan protein yang spesifik domba garut, karena belum dilaporkan peneliti terdahulu, yaitu protein dengan berat molekul 30,86 kDa yang lebih rendah dari El Amiri et al. (2007) yang telah berhasil mengisolasi ovPAG pada kebuntingan > 100 hari dan antara 60 – 100 hari usia kebuntingan, pada berat molekul 57-59 kDa dan 58 -61 kDa seta Szafranska et al. (2003) yang telah berhasil mengidentifikasi pada babi sebesar 35-72 kDa. Akan tetapi, protein dengan berat molekul antara 12,18 dan 17,67 kDa mendekati berat molekul Human Chorionic Gonatotrophine (HCG) yang biasa dimanfaatkan sebagai penanda kebuntingan pada manusia pada 14,5 kDa (Garn & Latiff 2005). Temuan menjadi penting karena berhasil mengisolasi protein kotiledon plasenta pada saat melahirkan dengan berat molekul sebesar 30,86 kDa.
KESIMPULAN
Protein pada berat molekul sekitar 30,86 kDa merupakan protein spesifik domba garut yang berhasil diisolasi dari ekstrak kotiledon plasenta pada saat melahirkan dan dapat dijadikan sebagai protein penanda kebuntingan.
