METODE PENELITIAN

Penelitian ini menggunakan domba garut (Ovis aries) betina sejumlah 9 ekor yang telah dewasa kelamin serta pernah melahirkan. Domba betina berumur 2-3 tahun dengan bobot sekitar 22–36 kg serta dipelihara dalam kandang individu. Pakan yang diberikan berupa konsentrat dan hijauan.

Perkawinan dilakukan menggunakan metode inseminasi buatan. Plasenta dikumpulkan pada saat melahirkan karena konsentrasi tertinggi ovPAG terjadi menjelang melahirkan dan mempunyai waktu paruh 4,5 hari setelah melahirkan (Haugejorden et al. 2003). Kotiledon dipisahkan dari karunkula kemudian dicuci bersih menggunakan NaCl 0,9 %, disimpan pada suhu – 200C (Sousa et al. 2002) sampai semua sampel terkumpul.

Ekstraksi Kotiledon

Ekstraksi kotiledon dilakukan dengan metode Garbayo et al. (1998), Sousa et al. (2002), dan El Amiri et al. (2007) termodifikasi. Setelah semua induk melahirkan,

Gambar 11 Alur kerangka pemikiran penelitian ekstraksi dan isolasi ovine pregnancy-associated glycoprotein (ovPAG) dari kotiledon domba garut pada saat melahirkan

Ekstrak kotiledon Fraksi Sephadex-G75 DEAE-cellulose Ekstraksi Fraksinasi Spektrofotometer Absorbansi Dialisis Asai Protein SDS-PAGE BM ovPAG Konsentrasi Protein Isolat ovPAG

Ekstraksi Kotiledon

Ekstraksi kotiledon dilakukan dengan metode Garbayo et al. (1998); Sousa et al. (2002), dan El Amiri et al. (2007) termodifikasi. Setelah semua induk melahirkan, ekstraksi kotiledon siap dikerjakan. Proses ekstraksi dimulai dengan mencairkan semua kotiledon yang terkumpul, ditimbang (249,19 g) , dicincang,

ditambahkan phosphate buffer saline (PBS) dengan perbandingan 1 ml kotiledon : 3,5 ml PBS, diperoleh volume campuran 2 100 ml. Campuran

dihomogenkan selama 5 menit lalu diputar semalaman (overnight) menggunakan stirrer pada suhu 4oC disebut larutan awal (S0). Larutan (S0) disentrifus (Refigerated High Speed Centrifuge, Himac-CR21G, R20A2) pada suhu 4oC, kecepatan 27.000 g selama 60 menit. Presipitat (PA) dikumpulkan dipisahkan dari supernatan (SA) , selanjutnya presipitat ditambah 200 ml PBS kemudian diputar semalaman (Miles et al. 2004). Keesokan harinya larutan disentrifus pada 27.000 g selama 60 menit (Sousa et al. 2002, El Amiri et al. 2007) dan presipitat (PB) dipisahkan dari supernatan (SB). Supernatan A ditambah SB, dihomogenkan dan didialisis menggunakan polietilen glikol (PEG) diperoleh supernatan 1 (S1) dengan volume 300 ml.

Presipitasi Asam

Supernatan 1 (S1) ditambah H3PO41M sampai mencapai pH 4,5 kemudian

diputar selama 120 menit. Larutan disentrifus pada 27.000 g selama 60 menit, presipitat dibuang, supernatant C (SC) dikumpulkan kemudian ditambah KOH 1M sampai mencapai pH 7,6 (Garbayo et al. 1998) disebut supernatan 2 (S2).

Presipitasi Garam ((NH4)2SO4)

Supernatan 2 (S2) ditambah 40% (NH4)2SO4 (24,2 g/100ml), penambahan

dilakukan secara hati-hati dan pelahan-pelahan sambil diputar serta disimpan semalaman pada suhu 4oC. Selanjutnya larutan disentrifus pada 27.000 g selama 60 menit, presipitat dibuang sementara supernatan D disebut supernatan 4 (S3) dikumpulkan kemudian ditambah 80% (NH4)2SO4 (28,1 g/100ml) mendapatkan

perlakuan yang sama dengan pada 40% (NH4)2SO4 . Larutan disentrifus pada

27.000 g selama 90 menit, presipitat E dikumpulkan dan ditimbang (15,36 g) sedangkan supernatan E (S4) disimpan untuk pengujian keberadaan protein dalam

ovPAG. Presipitat E ditambah 250 ml Tris- HCl 0,01 M, pH 7,6 (Garbayo et al. 1998; El Amiri et al. 2004). Campuran didialisis menggunakan

bufer yang sama selama 48 jam. Larutan disentrifus pada 36.000 g selama 30 menit dan presipitat F dibuang sedangkan supernatan F (S5) dikumpulkan. Supernatan 5 didialisis sampai mencapai 10% volume awal disebut sebagai

Gambar 12 Tipe plasenta sinepiteliochorion pada domba. Keterangan : A. Plasenta utuh

B. Karunkula. C. Kotiledon

supernatan prekolom (S6) siap untuk dialirkan pada kolom Sephadex-G75 dan DEAE-cellulose.

Isolasi ovPAG dari Ekstrak Kotiledon Plasenta

Isolasi ekstrak kotiledon plasenta dimurnikan dengan cara mengalirkan ekstrak kedalam kolom filtrasi gel Sephadex- G75 dan kolom kromatografi anion DEAE-cellulose (Creighton 1997; Lodish et al. 2000).

Filtrasi Gel pada Kolom Sephadex-G75

Filtrasi gel menggunakan Sephadex-G75 (Sigma®) karena dapat mengisolasi protein pada berat molekul 3-80 kDa sedangkan protein yang telah berhasil diisolasi dari kotiledon plasenta domba mempunyaai berat molekul 55, 57 dan 59 kDa pada 100 hari atau lebih usia kebuntingan (El Amiri et al. 2004).

Isolat prekolom dialirkan pada kolom Sephadex-G-75 yang telah diekuilibrasi menggunakan bufer NH4HCO3 0,05 M dengan kecepatan 1,25

ml/menit. Selanjutnya fraksi-fraksi ini diukur kadar total proteinnya dengan mengukur absorbansi menggunakan spektrofotometer (Hitachi U-2001®) pada panjang gelombang 280 nm, selanjutnya diplot pada grafik (Gambar 10). Fraksi yang berada pada titik puncak fluktuasi dikumpulkan untuk selanjutnya diukur konsentrasi total proteinnya menggunakan metode Bichinconinic Protein Assay (BCA ,Pearce®).

Kromatografi Pertukaran Anion pada Kolom DEAE-cellulose

Pembuatan kolom DEAE (Sigma ®) dimulai dengan melarutkan resin (60 gr) dalam 500 ml dH2O, didiamkan selama 45 menit. Volume resin yang

stabil setelah dilarutkan dalam dH2O dipergunakan sebagai standar penambahan

pelarut pada saat pencucian (1 CV= 1 column volume). Suspensi disaring kemudian dalam resin (1CV) tersebut ditambahkan 2 CV 0.1 M NaOH yang mengandung 0,5 M NaCl selama 10 menit, dituangkan kedalam penyaring, selagi

disaring ditambahkan secara pelahan 1 CV bufer sampai seluruh suspensi tersaring. Pencucian diulang dengan larutan yang sama.

Prosedur yang sama diberikan pada suspensi resin dengan mengganti pelarutnya yaitu 0,5 M NaCl; 0,1 M NaCl yang mengandung 0,5 M NaCl dan dH2O. Pencucian dilanjutkan dengan menambah 5-10 CV dH2O atau sampai pH

campuran 5 atau lebih besar. Larutkan resin dalam 2 CV 1 M NaCl dan pH ditera pada 7-8 dengan menambahkan 2 M NaOH. Suspensi disaring kemudian ditambahkan 5 CV dH2O. Selanjutnya resin dilarutkan kembali dengan

menambahkan 2 CV PBS . Resin dikeluarkan dari penyaring, tambahkan 5 CV PBS , disaring. Resin dilarutkan kembali menggunakan 2CV PBS. Ambil sedikit larutan resin, disaring dan diukur pHnya. Apabila pHnya berada kurang lebih 0,15 dari pH PBS (pH=7,6) maka suspensi resin siap dimasukkan dalam kolom. Kolom dibiarkan 3 hari agar kolom yang terbentuk stabil. Selanjutnya bufer yang akan dipergunakan pertama kali dialirkan untuk mengecek kelancaran aliran.

Kolom DEAE diekuilibrasi menggunakan Tris-HCl 0,01M (pH 7,6). Isolat prekolom dialirkan, fraksi ditampung pada kecepatan 2,5 ml/menit. Selanjutnya kolom dielusi menggunakan bufer NaCl pada konsentrasi bertingkat yaitu 20; 40; 80; 160; 320 mM dan 1M yang pada setiap pergantian konsentrasi, fraksi ditampung dengan prosedur yang sama seperti pada kolom Sephadex-G75.

Protein yang mempunyai konsentrasi protein tinggi dikumpulkan, didialisis menggunakan Polietilen glikol (PEG) terlebih dahulu sebelum diukur berat molekulnya dengan menggunakan monogel Sodium Dedocyl Sulfate- PolyAcrylamide Gel Elctroforesis atau SDS-PAGE (Abbas et al. 2007).

Pembuatan Monogel SDS-PAGE

Running Gel dibuat pada konsentrasi SDS-PAGE 14% sedangkan stacking gel pada 4%. Gel pemisah dibuat dengan menggunakan komposisi Acylamide 40%; bis-acrylamide 2%; TEMED; APS 10%; dH2O ditambah buffer

Tris-HCl pH 8,8 sedangkan untuk stacking pH 6,8 (Gambar 13). Marker

ditambahkan sebagai standar berat molekul protein yang dipisahkan. Setelah stacking gel mengental, protein yang akan diidentifikasi dimasukan yaitu

berasal dari S0; S1; S2; S3; S4; S5; S6 yang diperoleh pada saat ekstraksi kotiledon, standar berat molekul yang dipergunakan adalah Broad Range Standard dengan kisaran 7,5 – 203 kDa (Sigma®). Selanjutnya protein dengan berat molekul tertentu akan terpisah selama melewati gel pemisah pada 100 volt selama 90 menit (Creighton 1997), mengalir menuju elektrode bermuatan positif. Migrasi protein selesai setelah mencapai garis paling bawah dari monogel.

Selanjutnya setelah mencapai garis paling bawah dari monogel, diwarnai dengan Commassie Brilliant Blue (CBB). Pewarnaan gel menggunakan CBB dimulai dengan melepas gel dari tempatnya, dicelupkan pada larutan CBB selama 20 menit. Kemudian untuk menghilangkan zat warna dari CBB dilakukan dengan mencelupkan gel pada larutan methanol selama 2 jam. Apabila larutan masih keruh maka pencelupan diulangi dengan menggunakan methanol baru sampai larutan menjadi bening serta pita protein terlihat jelas pada monogel.

Pewarnaan Commassie Brilliant Blue.

Monogel yang telah dilalui protein, direndam dalam larutan pewarnaan CBB (Merck®) selama 20 menit, kemudian larutan pewarna dibuang. Pencucian dilakukan dengan menambahkan larutan campuran methanol denganasam asetat. Larutan CBB dibuat dengan mencampurkan 1,25 g CBB, 250 ml methanol, 50 ml

asam asetat serta dH2O, sampai mencapai volume 1 liter. Sedangkan larutan

pencuci (destaining) dibuat dengan mencampurkan 250 ml methanol, 70 ml asam asetat dan dH2O, sampai mencapai volume 1 liter.

Pengukuran Konsentrasi Protein

Protein yang terlebih jelas garisnya pada monogel SDS-PAGE diukur konsentrasinya dengan metode Bicinchoninic Acid Protein Assay (BCA Protein assay). Protein yang akan diukur konsentrasinya dimasukkan ke dalam sumuran sebanyak 10 µl + 200 µl BCA (Reagent A : Reagen B = 50 : 1) kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC 30 menit. Selanjutnya absorbansi yang terbentuk dibaca menggunakan Assay Reader pada panjang gelombang 590 nm.

Analisis Data

Data hasil ekstraksi dan isolasi dianalisis secara deskriptif berdasarkan estimasi berat molekul protein yang ditemukan pada pita proteinnya. Demikian juga dengan data hasil pengukuran nilai absorbansi yang ditampung dari kolom Sephadex-G75 maupun DEAE-cellulose dibandingkan dengan konsentrasi total protein.

Dalam dokumen Ovine Pregnancy Associated Glycoprotein (ovPAG) as a marker of pregnancy on Garut Sheep (Halaman 55-62)