PENGUJIAN OVINE PREGNANCY-ASSOCIATED
3. Pengukuran konsentrasi ovPAG dalam urin dan plasma
Gambar 24 Alur kerangka pemikiran penelitian pengujian ovine pregnancy- associated glycoprotein (ovPAG) menggunakan teknik ELISA
METODE PENELITIAN
Pembuatan Standar ovPAG
Pengenceran bertingkat untuk membentuk standar ovPAG DN32. Adapun pengencerannya dengan konsentrasi 0.344; 0.172; 0.688; 0.0344 dan 0.0172 ng/ml, menggunakan pengencer 0.01 M Tris HCl.
Prosedur Teknik ELISA Termodifikasi
Sampel yang akan diukur konsentrasi ovPAG berupa plasma dan urin selain itu juga dilakukan pada urin yang dikoleksi secara serial pada saat tidak bunting dan bunting (n = 9 ekor).
Teknik ELISA Termodifikasi (TET) merupakan modifikasi dari metode Crowther (2001), Green et al. (2005) dan Silva et al. (2007) Antigen (ovPAG) hasil isolasi yaitu S, DT, DN8, DN16 dan DN32 ditambah bufer karbonat- bikarbonat (coating-buffer) dengan perbandingan 1 : 10 dimasukkan pada masing- masing sumuran sebanyak 100 μl, kemudian diinkubasi pada 4oC semalam. Keesokan harinya, dicuci menggunakan PBS Tween 0.1 % sebanyak 4 kali. Setiap sumuran diisi 300 μl blotto 5% kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit (Silva et al. 2007). Larutan penghambat (Blotto 5%) merupakan campuran 5 g susu skim dengan PBS 0.1%, berfungsi untuk menghambat ikatan protein nonspesifik yang menempel pada permukaan fase solid lempeng ELISA.
Setelah 60 menit, blotto 5% dibuang dan dicuci sebanyak 4 kali. Rabbit anti- ovPAG diencerkan dalam blotto 5% (1:50) kemudian pada masing-masing sumuran diisi 100 μl, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 90 menit. Selanjutnya lempeng ELISA, dicuci sebanyak 4 kali menggunakan larutan pencuuci yang sama. Setiap sumuran diisi campuran Goat anti-rabbit IgG peroxidase (Sigma®) dalam blotto 5% (1 : 2 000) sebanyak 100 μl, diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit. Lempeng ELISA cuci menggunakan PBS Tween 0.1% sebanyak 4 kali. Selanjutnya ditambahkan 100 μl TMB (3,3’,5,5’ tetra methyl benzidine dihydrochloride (Sigma®) kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar (warna biru). Reaksi dihentikan dengan menambahkan
larutan 2N H2SO4 sebanyak 50 μl pada setiap sumuran. Perubahan warna biru
menjadi kuning, menunjukan reaksi telah berakhir, selanjutnya kerapatan optik atau absorbansi dibaca menggunakan Microplate Reader Model 3550 (Biorad®) pada panjang gelombang 450 nm (Crowther 2001; Chow et al. 2003).
Validasi Asai
Pada penelitian ini, uji validasi yang akan dilakukan adalah uji presisi asai dengan menentukan koefisien variasi intra- dan inter-asai. Selanjutnya dibuat rencana kontrol kualitas yang akan diuji validasinya (intra- dan inter-assay) dengan cara menentukan letak kontrol kualitas tertinggi dan terendah (QC-H dan QC-L). Penentuan QC-H dan QC-L dilakukan dengan mengencerkan standar ovPAG DN32 kemudian dilakukan asai. Setelah didapatkan nilai kerapatan optiknnya, nilai tersebut dibuat grafik dan ditemukan kemiringannya. Berdasarkan dari persamaan linear yang diperoleh, konsentrasi sampel yang diencerkan dapat dihitung kemudian dihitung nilai koefisien variasi intra- dan inter-asainya ( Ebrahimi 2004).
Analisis Data
Penentuan standar ovPAG DN32 untuk dapat dipergunakan pada pengukuran konsentrasi ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting dilakukan uji validasi untuk menggunakan konsentrasi standar ovPAG DN32 bertingkat. Selanjutnya uji validasi dipergunakan untuk menentukan persamaan linear dan koefisien korelasi antara konsentrasi standar dan kerapatan optik. Data konsentrasi ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting terhadap respon antibodi positif dan negatif disajikan secara deskriptif dengan menampilkan nilai rerata. Selanjutnya untuk menentukan uji beda konsentrasi ovPAG dalam urin domba bunting dan tidak bunting dilakukan uji t-student menggunakan Program Minitab 14 (Mattjik & Sumertajaya 2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pembuatan Standar ovPAG
Standar ovPAG ditentukan dengan melakukan pengenceran bertingkat isolat ovPAG DN32 pada 0.344; 0.172; 0.688; 0.0344 dan 0.0172 ng/ml . Isolat ovPAG DN32 mempunyai konsentrasi total protein awal 86 ng/ml (Lampiran 5). Interaksi yang terbentuk antara ovPAG dan rabbit anti-ovPAG diuji validasinya diantara sumuran dalam satu lempeng ELISA (intra asai) dan antar lempeng yang berbeda (inter asai) dengan menentukan terlebih dahulu kontrol kualitas tertinggi dan terendah pada lempeng ELISA yang diuji.
Gambar 25 menunjukkan bahwa ada korelasi antara standar dan kerapatan optik yang ditunjukan dengan semakin tinggi konsentrasi standar maka kerapatan optiknya semakin meningkat. Ada tiga lempeng ELISA yang diuji mempunyai nilai R2 positif bererturut-turut 0.981; 0.960, dan 0.987. Nilai ini menunjukan bahwa prosedur ELISA yang dikerjakan sudah sesuai dengan prosedur yang seharusnya serta dapat dipergunakan sebagai standar.
Gambar 25 Kemiringan dan persamaan linear standar ovPAG DN32 pada tiga lempeng ELISA
Uji Validasi Asai dengan Menentukan Koefisien Variasi Intra- dan Inter – Asai
Koefisien variasi dari intra- dan inter-asai merefleksikan presisi dari asai yang digunakan. Ada tiga lempeng ELISA untuk menguji sampel standar secara duplo , diperoleh koefisien variasi intra asai untuk kontrol kualitas konsentrasi tinggi dan rendah adalah 9.97 % (n=13) dan 5.87 % (n=19). Nilai menunjukkan bahwa proses ELISA yang dilakukan pada ketiga lempeng ELISA telah memenuhi standar prosedur asai. Selanjutnya untuk lebih mempertajam uji validasi, dilanjutkan dengan menghitung variasi diantara ketiga lempeng ELISA, diperoleh koefisien variasi inter-asai pada kontrol kualitas tinggi dan rendah adalah 16.95 % (n=6) dan 13.9 % (n=6) pada kontrol kualitas konsentrasi rendah. Kontrol kualitas tinggi mempunyai nilai koefisien variasi inter-asai 15 %, hal ini menunjukan bahwa preparasi ELISA yang dilakukan belum sempurna dan tidak spesifik sehingga perludilakukan uji validasi ulang. Uji validasi lebih lanjut belum dapat dilakukan karena keterbatasan rabbit anti-ovPAG yang diproduksi.
Pengukuran Konsentrasi ovPAG dalam Urin Domba Garut Bunting
Uji kebuntingan terhadap PAG yang terdapat dalam air susu dan darah sapi potong maupun perah menggunakan teknik ELISA secara cepat telah berhasil dikembangkan dengan tingkat sensitivitas dan spesifitas yang tinggi (Munro et al. 1991; O’Connor et al. 2003; Friedrich & Holtz 2008; Green et al. 2009). Dengan demikian dimungkinkan untuk mengukur konsentrasi PAG dalam urin karena hasil yang diperoleh setara hanya perbedaan dalam waktu
munculnya substansi untuk dapat diukur atau time lag (O’Connor et al. 2003; Munro et al. 1991).
Konsentrasi ovPAG dapat terukur baik pada sampel urin maupun plasma (Tabel 3), dan hasilnya sesuai dengan hipotesis bahwa urin bunting yang diduga mengandung ovPAG memberikan reaksi terhadap Ab+. Akan tetapi hasilnya kurang memuaskan karena Ab- dapat bereaksi dengan ovPAG dalam urin. Meskipun demikian, konsentrasi ovPAG dalam plasma maupun urin pada saat diuji terhadap Ab+ mempunyai nilai yang lebih besar dibanding Ab-. Hal ini,
dimungkinkan karena antibodi primer yang digunakan adalah antibodi poliklonal sehingga mempunyai spesifisitas yang luas akibatnya dapat berinteraksi dengan semua protein yang memiliki epitop (Green et al. 2005), seperti ovPAG yang dapat dikenali oleh rabbit anti-ovPAG. Selanjutnya agar dapat diperoleh hasil yang lebih jelas, dilakukan pengukuran konsentrasi ovPAG pada sampel urin tidak bunting dan bunting yang dikoleksi secara serial pada sembilan ekor domba garut (Tabel 4).
Tabel 4 Konsentrasi ovPAG pada Urin Domba Garut Tidak Bunting dan Bunting
Status Domba Jenis sampel Konsentrasi ( ng/µl )
Ab + Ab-
Bunting U1 0,0133 0,0067
P1 0,0973 0,0031
Tidak bunting U2 0,0032 0,0030
P2 0,0294 0,0030
Keterangan : U = urin, P = plasma
Tabel 3 Rerata Konsentrasi ovPAG dalam Urin dan Plasma Domba Bunting dan Tidak Bunting terhadap Respon Uji Antibodi Positif dan Negatif.
No. Individu Tidak Bunting Bunting P-Value Rata-rata ± sd Rata-rata ± sd 1 A2 0,581 ± 0,053a 0,591± 0,058a 0,537 2 B2 0,572 ± 0,024a 0,561 ± 0,040a 0,208 3 B3 0,548 ± 0,055a 0,589 ± 0,091b 0,028 4 C1 0,527 ± 0,044a 0,593 ± 0,158b 0,011 5 C2 0,563 ± 0,033a 0,606 ± 0,079b 0,014 6 C3 0,596 ± 0,049a 0,682 ± 0,122b 0,004 7 D3 0,541 ± 0,037a 0,525 ± 0,031a 0,094 8 E1 0,569 ± 0,059a 0,668± 0,148b 0,001 9 E2 0,665 ± 0,125a 0,643 ± 0,104a 0,519 Rerata 0,583± 0,048a 0,607 ± 0,050a 0,323
Keterangan : superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukan perbedaan yang nyata (P 0,05) antara domba tidak bunting dan bunting
Konsentrasi ovPAG dalam urin domba tidak bunting (Tabel 4) yang diukur menggunakan standar ovPAG DN32 pada sembilan individu domba memperlihatkan adanya tiga individu yang mempunyai konsentrasi berbeda nyata (P 0,05) yaitu B3; C1; C2 dan dua individu berbeda sangat nyata (P 0,01) yaitu C3 dan E1. Namun rerata konsentrasi kesembilan individu tidak menunjukan adanya perbedaan yang nyata (P 0,05). Hal ini menunjukan bahwa teknik ELISA termodifikasi yang dipergunakan dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi ovPAG dalam urin. Namun untuk membedakan konsentrasi ovPAG pada domba bunting dan tidak bunting, tingkat keberhasilannya masih rendah (55,56 %) dari sembilan individu yang diuji.
Ketidak spesifikan hasil asai (Tabel 3 dan Tabel 4) yang dilakukan erat kaitannya dengan adanya reaksi silang antararabbit anti-ovPAG dengan material yang terkandung dalam urin. Hal ini dapat terjadi apabila urin mengandung antigen yang tidak identik tetapi mempunyai epitop yang identik, atau dapat juga dua antigen yang memiiki dua epitop sama tapi tidak identik sehingga intensitas yang muncul menjadi berbeda. Dapat juga urin mengandung dua bahan yang berbeda secara kimiawi seperti protein dan karbohidrat tetapi memiliki epitop yang sama (Huebner 2004). Agar diperoleh hasil yang lebih akurat perlu dilakukan uji immunoreactivity terhadap antibodi yang digunakan untuk menentukan faktor penyebab ketidak spesifikan tersebut. Selain itu, diperlukan penambahan jumlah sampel serta antibodi yang lebih murni. Oleh karenanya hasil ini belum dapat dijadikan sebagai rekomendasi produksi kit deteksi kebuntingan.
KESIMPULAN
1. Pengenceran ovPAG 0.344; 0,172; 0,688; 0,0344 dan 0,0172 ng/ml dapat digunakan sebagai standar.
2. Koefisien variasi intra-asai dan inter-asai rendah telah memenuhi kriteria presisi (≤ 15%) pada 9.97 %; 5.87 % dan 13.9 %, sedangkan koefisien variasi inter-asai tinggi adalah 16.95 % .
3. Teknik ELISA Termodifikasi sudah dapat membedakan konsentrasi konsentrasi ovPAG pada hewan bunting atau tidak bunting (55,56 %).
DAFTAR PUSTAKA
Chow et al. 2003. Development of a microtiter plate ELISA and a dipstick ELISA for the determination of the organophosphorus insecticide fenthion. J Agric Food Chem 51 : 7854-7860.
Crowther JR. 2001. The ELISA Guidebook. New Jersey : Humana Press. hlm 1 – 82.
Ebrahimi M. 2004. A Rapid ELISA method for 17, 20β-dihydroxy-4-pregenen-3- one (17, 20βP) hormone using acetylcholinesterase enzyme as tracer. J of Res Med Sci 3 : 1-8.
Friedrich M, Holtz W. 2008. Establishment of an ELISA for Measuring Bovine Pregnancy-Associated Glycoprotein in Serum or Milk and Its Application for Early Pregnancy Detection. Reprod Domest Anim 30 Oktober 2008 (Epub).
Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. 2000. Kuby Immunology. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 63-172.
Green JA et al. 2005. The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) in the serum of pregnant cows and heifers. Theriogenology 63(5):1481-1503.
Green JA et al. 2009. Technical note : A rapid enzyme-linked immunosorbent assay blood test for pregnancy in dairy and beef cattle. J Dairy Sci 92:3819-3824.
Huebner J. 2004. Antibody-Antigen Interactions and Measurements of Immunologic reactions. Didalam : Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM, editor. Immunology, Infection, and Immunity. Washington, DC : ASM Press. hlm 207-232.
Lodish et al. 2000. Molecular Cell Biology. Ed ke-4. New York : WH Freeman & Co. hlm 50-137.
Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Jilid I. Ed ke-2. Bogor : IPB Press. hlm 21-52.
Munro et al. 1991. Relationship of serum estradiol and progesterone concentrations to the excretion profiles of their major urinary metabolites
as measured by enzyme immunoassay and radioimmunoassay. Clin Chemist 37 : 838-844.
O’Connor et al. 2003. Urinary estrone conjugate and pregnanediol 3-
glucuronide enzyme immunoassays for population research. Clinical Chemistry 49:1139-1148.
Silva et al. 2007. Accuracy of a pregnancy-associated glycoprotein ELISA to determine pregnancy status of lactating dairy cows twenty-seven days after timed artificial insemination. J Dairy Sci 90:4612-4622.
