BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
F. Tata Cara Penelitian
Bunga telang yang diteliti di determinasi menurut pustaka acuan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Bahan yang digunakan untuk determinasi yaitu bunga pada bagian samping dan bagian, daun pada bagian atas dan bagian bawah dan batang.
b) Pengambilan Bahan Bunga Telang
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga telang yang diperoleh dari daerah Kaliurang, Harjobinangun, Kecamatan Pakem, Kabupaten Sleman, Yogyakarta. Kriteria bunga telang yang dipilih yaitu bunga telang sehat,segar dan dewasa yang telah mekar.
c) Pembuatan ekstrak
Sampel sebanyak 50 gram serbuk kering bunga telang dibungkus menggunakan kertas saring, diikat dengan benang pada kedua ujungnya dan masukan kedalam alat soklet. Pelarut etanol 96% dimasukkan kedalam labu soklet yang disesuaikan dengan besar soklet dengan prinsip dua kali sirkulasi. Lakukan proses sokletasi pada suhu pemanasan antara 81-96oC untuk pelarut etanol 96%
sampai tetesan siklus tidak berwarna lagi. Ekstrak cair yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary evporator pada suhu 50oC. Pelarut yang tersisa diuapkan menggunakan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental (Rosita et al, 2017).
d) Uji pendahuluan
1. Uji pendahuluan senyawa fenolik
Uji pendahuluan senyawa fenolik diakukan dengan cara 0,5 mL larutan uji 750,0 µg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µg/mL ditambah
2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit.
Tambahkan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna larutan tersebut (Rollando danMonica, 2018).
2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Uji pendahuluan aktivitas antioksidan dilakukan dengan 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi.
Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pembanding rutin 37,5 μg/mL, dan larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut (Rollando dan Monica, 2018).
e)
Uji kromatografi Lapis Tipis (KLT)Plat KLT silika gel GF254 diaktifasi dengan cara dioven pada suhu 100 ºC selama 10 menit untuk menghilangkan air yang terdapat pada plat KLT.
Ekstrak kental hasil ekstraksi dilarutkan dengan etanol 96% kemudian ditotolkan beberapa titik yang ditandai pada plat dengan menggunakan pipet mikro pada jarak 1 cm dari garis bawah dan 1 cm dari garis atas. Selanjutnya dielusi dengan menggunakan eluen yang yang memberikan hasil pemisahan terbaik pada KLT yaitu n-butanol : asam asetat : air (BAA) dengan perbandingan (4:1:5). Setelah elusi mencapai batas penambaran kemudian plat KLT diangin-anginkan dan diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. (Koirewoa et al, 2012).
f) Penentuan kandungan fenolat total 1. Pembuatan larutan asam galat
Sebanyak 25 mg Asam galat ditimbang, selanjutnya dimasukkan dalam gelas beker dan dilarutkan menggunakan aquades : methanol p.a (1:1).
Larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, kemudian ditambahkan akuades : methanol p.a (1:1) hingga tanda batas. Larutan kemudian diambil sebanyak 0,5 ; 0,75 ; 1 ; 1,25 ; dan 1,5mL, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan aquades : methanol p.a (1:1)
hingga tanda batas, sehinggadiperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50 ; 75 ; 100 ; 125 ; dan 150 μg/mL.
2. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik
Sebanyak 250 mg ekstrak etanol 96% bunga telang ditimbang, selanjutnya dilarutkan menggunakan methanol p.a dalam gelas beker kemudian dimasukkan ke dalam labu takar berukuran10 mL dan ditambahkan methanol p.a sampai tanda batas. Selanjutnya larutan intermediet dibuat dengan mengambil sebanyak 3,6 mL larutan stok, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan methanol p.a sampai batas tanda. Sebanyak 2,5 mL larutan intermediet kemudian diambil dan masukkan ke dalam labu takar 10 mL, ditambahkan methanol p.a sampai tanda batas. Diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 4500,0 μg/mL.
3. Penentuan operating time
Larutan asam galat konsentrasi 50 ; 100 ; dan 150 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Kemudian Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2,0 mL pada larutan. Kemudian ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M.
Selanjutnya absorbansi larutan dibaca setiap 5 menit dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 60 menit.
4. Penentuan panjang gelombang maksimum
Larutan asam galat dengan konsentrasi 50 ; 100 ; dan 150 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Kemudian Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2,0 mL pada larutan. Kemudian ditambahkan 4,0 mL natrium karbonat 1 M pada masing-masing larutan. Diamkan selama operating time yang telah didapat, setelah itu dilakukan scanning panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer visible dengan panjang gelombang 600-800 nm.
5. Pembuatan kurva baku asam galat
Larutan asam galat dengan konsentrasi 50 ; 75 ; 100 ; 125 ; dan 10 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL. Kemudian Reagen Folin-Ciocalteu dimasukkan sebanyak 2,0 mL pada larutan. Selanjutnya, ditambahkan natrium karbonat 1 M sebanyak 4,0 mL, didiamkan selama operating time yang telah didapat.
Kemudian absorbansi dibaca pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh hingga 3 kali replikasi.
6. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Larutan uji dengan konsentrasi 4500,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL.
Kemudian Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2 mL.Selanjutnya, ditambahkan natrium karbonat 1 M sebanyak 4,0 mL, kemudian didiamkan selama operating time yang telah di dapat. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang maksumum yang telah diperoleh.
g) Penentuan aktivitas antioksidan 1. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 5 mg DPPH ditimbang kemudian dilarutkan dengan methanol p.a di dalam labu ukur 50 mL dan diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100 μg/mL. Larutan stok DPPH kemudian diambil sebanyak 5 mL,ditambahkan methanol p.a sampai 25,0 mL. Kemudian larutan tersebut ditutup dengan aluminium foil dan harus selalu dibuat baru.
2. Pembuatan larutan stok rutin
Sebanyak 5 mg rutin dilarutkan dalam methanol p.a sampai 50,0 mL.
3. Pembuatan larutan standar rutin
Diambil sebanyak 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ; 6,0 ; dan 7,0 mL larutan stok, dimasukkan kedalam tabung 10 mL. Kemudian ditambahkan methanol p.a sampai 10 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan rutin standar sebesar 30 ; 40 ; 50 ; 60 ; dan 70 μg/mL.
4. Pembuatan larutan uji
Ekstrak etanol 96% bunga telang ditimbang sebanyak 250,0 mg kemudian ditambahkan methano lp.a sampai 10,0 mL.Larutan diambil sebanyak 2,0 mL kemudian ditambahkan dengan methanol p.a sampai 10,0 mL, menjadi larutan intermediet. Kemudian diambil 0,6 ; 1,0 ; 1,4 ; 1,8 ; dan 2,2 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 600 ; 1000 ; 1400 ; 1800
; dan 2200 μg/mL.
5. Pembuatan larutan kontrol
Larutan yang digunakan adalah 0,2 mL methanol p.a dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 3,8 mL DPPH, kemudian di vortex selama 30 detik dan didiamkan selama 30 menit (Reaction Time).
6. Penentuan operating time (OT)
Digunakan sebanyak 3 konsentrasi rutin yaitu 5, 15 dan 25 μg/mL.
Sebanyak 3,8 mL larutan DPPH dimasukkan dalam tabung reaksi tertutup, ditambah 0,2 mL larutan standar rutin. Campuran larutan kemudian di vortex selama 30 detik. Selanjutnya dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimal 517 nm setiap 5 menit selama 60 menit sampai diketahui terjadi penurunan absorbansi secara nyata.
7. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 20 ; 30 ; dan 40 μg/mL ditentukan spectrum serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm hingga 700 nm dan ditentukan panjang gelombang optimumnya.
8. Penentuan aktivitas antioksidan
Masing-masing larutan uji di ambil sebanyak 0,2 mL dan dimasukkan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan 3,8 mL DPPH 20 μg/mL dan di vortex selama 30 detik. Kemudian, didiamkan selama (Operating Time) dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum. Dilakukan pengujian yang sama untuk pembanding rutin. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
9. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur tersebut, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk rutin dan ekstrak etanol 96% bunga telang.