BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
H. Penetapan Kandungan Fenolik Total
Reagen spesifik yang umum digunakan dalam menetapkan kadar fenolik pada penelitian ini adalah Folin Ciocalteu karena teknik pengerjaannya yang sederhana. Prinsip metoda Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi senyawa fenol dalam suasana basa oleh pereaksi Folin Ciocalteu menghasilkan kompleks berwarna biru. Peningkatan intensitas warna biru akan sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang ada di dalam sampel.Senyawa pembanding yang digunakan adalah asam galat karena asam galat dapat menghasilkan hasil yang realibitas karena mempunyai reaktifitas yang cukup tinggi terhadap reagen Folin Ciocalteu dan merupakan salah satu fenolik yang alami dan stabil. Reaksi yang terjadi antara asam galat dengan reagen Folin Ciocalteuyaitu terbentuknya senyawa kompleks berwarna biru.Pereaksi akan mengoksidasi fenolatatau gugus fenolik-hidroksi mereduksi asam heteropoli (fosfomolibdat-fosfotungstat) yang terdapat dalam pereaksi Folin Ciocalteu menjadi suatu kompleks molibdenum-tungsten. Senyawa fenolik berekasi dengan reagen Folin Ciocalteu dalam suasana basa yang akan terjadi disosiasi proton pada senyawa fenolik menjadi ion fenolat sehingga gugus hidroksil senyawa fenolik akan berekasi dengan reagen Folin Ciocalteu yang akan membentuk komplek molibdenum-tungsten yang berwarna biru sehingga dapat dideteksi menggunakan spektofotometer (Nofita et al, 2020).
Gambar 7. Reaksi pembentukan kompleks molibdenum-tungsten blue (Adawiah et al, 2012)
Pembuatan kurva baku dibuat untuk mendapatkan persamaan regresi linear sehingga dapat dihitung konsentrasi senyawa fenolik yang terkandung didalam bunga telang. Menurut Nofita et al (2020) persamaan regresi dengan nilai linearitas terbaik adalah nilai r yang mendekati 1. Pembuatan kurva baku pada penetapan kandungan fenolik total dilakukan sebanyak tiga kali replikasi.
Tabel IV. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu pada λ 760.5 nm
Replikasi Konsentrasi (µg/mL)
Absorbansi Persamaan regresi linear
1
10 0,233
y=0,022x+ 0,022 r =0,9837
15 0,304
20 0,420
25 0,507
30 0,700
2
10 0,303
y=0,0025x+ 0,046 r = 0,9898
15 0,428
20 0,505
25 0,708
30 0,788
3
10 0,229
y=0,028x+ 0,083 r = 0,9790
15 0,364
20 0,438
25 0,589
30 0,834
Gambar 8. Kurva baku asam galat dalam penetapan kandungan fenolik total (replikasi 2)
y = 0,025x + 0,046 r= 0,9898 0
0,2 0,4 0,6 0,8 1
0 5 10 15 20 25 30 35
Absorbansi
Konsentrasi (µg/mL)
Konsentrasi VS Absorbansi
Persamaan regresi linear yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi pada replikasi kedua yaitu y = 0,0025x + 0,046dengan nilai linearitas terbaik sebesar 0,9898. Nilai linearitas yang didapatkan menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi dan absorbansi.
Tabel V. Hasil penentuan kandungan fenolik total esktrak etanol bunga telang
Replikas i
Absorbansi
Kandunga n fenolik total (mg GAE/g)
Rata-rata ±
SD (mg GAE/g
)
%CV
1 0,38
4
0,270
0,2403
± 0,0322
13,399 9
2 0,30
4
0,206
3 0,35
3
0,245
Tabel V menunjukkan hasil pengukuran sampel uji ekstrak etanol untuk penentuan kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga telang memiliki nilai kandungan fenolik total rata–rata sebesar 0,2403± 0,0322 mg ekivalen asam galat gram ekstrak etanol bunga telang. Kandungan fenolik total pada bunga telang yang telah diteliti pada ekstrak etanol bunga telang menurut Adriani dan Murtisiwi (2018) adalah 19,43 ± 1,621 mg ekivalen asam galat gram ekstrak etanol bunga telang yang digunakan, dengan metode ekstraksi dan penyari yang berbeda yaitu metode ekstraksi dengan maserasi dan penyari dengan etanol 70%. Berdasarkan penelitian Suhendra et al (2019) menyebutkan bahwa konsentrasi pelarut etanol berpengaruh sangat nyata terhadap rendemen, total fenol, total flavonoid dan aktivitas penghambat radikal DPPH ekstrak, dengan kandungan tertinggi diperoleh pada etanol konsentrasi 70%. Berdasarkan penelitian Mustika Candra et al (2013), menunjukkan bahwa total fenolik dan flavonoid yang diperoleh dari berbagai
metode ekstraksi secara berturut lebih tinggi untuk metode ekstraksi sokletasi dibandingkan dengan maserasi, sonikasi, dan refluks. Namun pada penelitian ini hasil fenolik total lebih kecil dari pad a maserasi, hal ini juga dipengaruhi oleh suhu dan lama waktu pemanasan. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Settharaksa et al (2012) melaporkan bahwa suhu dan lamanya waktu pemanasan pada proses ekstraksi dapat berpengaruh terhadap kadar senyawa yang d iperoleh. Pada umumnya kelarutan zat aktif yang diekstrak akan bertambah besar dengan bertambah tingginya suhu. Akan tetapi, peningkatan suhu ekstraksi juga perlu diperhatikan, karena suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan kerusakan pada bahan yang sedang diproses.
I. Hasil Optimasi Uji Antioksidan 1. Penentuan operating time (OT)
Tujuan penentuan operating time adalah untuk mendapatkan waktu pengukuran absorbansi dari reaksi antara larutan uji, larutan pembanding dengan radikal DPPH yang memberikan nilai absorbansi yang stabil. Larutan pembanding yang digunakan adalah rutin, karena rutin merupakan salah satu senyawa flavonoid dalam tanaman yang telah diketahui mempunyai aktivitas antioksidan. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan mereaksikan larutan DPPH dengan kontrol positif rutin pada tiga konsentrasi yang berbeda yaitu konsentrasi 30 µg/mL(rendah), 50µg/mL(sedang) dan 70 µg/mL(tinggi). Setiap konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan merepresentasikan operating time pada masing-masing konsentrasinya.
Pengukuran OT dilakukan setiap 5 menit selama 60 menit menggunakan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang serapan maksimum teoritis pada penelitian Dehpour et al (2009) yaitu pada 517 nm. Operating Time ditentukan berdasarkan waktu ketika nilai absorbansi mulai stabil atau selisih nilai absorbansi tiap selang waktu mulai kecil. Pengukuran tiap 5 menit karena instrumen yang digunakan tidak dapat berfungsi melakukan pengukuran secara otomatis.
Sedangkan pemilihan waktu 60 menit karena waktu ini dirasa cukup untuk memberikan nilai pengukuran yang stabil, karena jika waktu yang dipakai terlalu lama maka ada kemungkinan senyawa telah rusak.
Gambar 9. Grafik penentuan operating time pembanding rutin
Dari hasil yang ditampilkan melalui grafik (Gambar 9) didapatkan operating time rutin yaitu 30 menit. Hal ini ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil mulai menit ke 30. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan Rollando dan Monica (2018) juga menunjukkan bahwa absorbansi yang stabil adalah pada menit ke 30.
2. Penentuan panjang gelombang
Penentuan panjang gelombang dilakukan untuk mengetahui perubahan absorbansi pada setiap satuan konsentrasi sehingga akan di peroleh kepekaan analisis yang maksimum sehingga memberikan absorbansi maksimum saat melakukan pengukuran (Nofita et al, 2020). Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 400 nm – 600 nm.
Pemilihan rentang panjang gelombang 400 nm – 700 nm didasarkan pada penelitian yang telah dilakukan oleh Dehpour et al (2009), bahwa panjang gelombang maksimum DPPH secara teoritis adalah 517 nm yang masuk kedalam rentang tersebut. DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada strukturnya, serta adanya delokalisasi elektron disekitar molekulnya, sehingga menimbulkan warna ungu yang dapat diukur serapannya pada panjang gelombang visibel. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan DPPH. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada konsentrasi 40 μg/mL larutan
0 10 20 30 40 50 60 70
0 20 40 60 80
Absorbansi
Waktu
Waktu vs Absorbansi
Series1
Series2
Series3 30 µg/mL
50 µg/mL
70 µg/mL
DPPH. Rentang panjang gelombang maksimum yang digunakan untuk melakukan scanning panjang gelombang adalah 400 – 700 nm.
Tabel VI. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH Konsentrasi seri asam
galat (µg/mL)
λ maksimum (nm) λ maksimum (nm) yang digunakan
40
516 516 517 517
Berdasarkan hasil scanning panjang gelombang maksimum yang telah dilakukan yaitu 517 nm (Tabel VI). Secara teoritis pada panjang gelombang serapan maksimum adalah 517 nm.