BAB III KERANGKA BERPIKIR DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.3 Hipotesis Penelitian
Berdasarkan kerangka konsep, maka hipotesis yang dapat diajukan adalah Pemberian asam α-lipoat dapat menurunkan ekspresi MMP-1 pada kultur
Asam α-lipoat dan Ekstrak Asap Rokok
Faktor internal
fibroblast yang terpapar ekstrak asap rokok.
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental, dengan rancangan penelitian yang digunakan adalah Posttest only control group design pada penelitian in vitro dengan subyek kultur fibroblast (Campbell, 1963).
Penelitian in vitro, dilakukan dengan menggunakan kultur sel fibroblast, dimana sel fibroblast diberikan asam α-lipoat dengan variasi 3 dosis 50μg/hr, 100μg/hr, dan 200μg/hr dan selanjutnya diberikan ekstrak asap rokok dengan variasi dosis 50μl/ml, 25μl/ml, dan 12,5μl/ml. Supernatan dari kultur sel fibroblast dikumpulkan setelah 24 jam dan nilai MMP-1 diamati dengan menggunakan MMP-1 Human enzyme-linked immunsorbent assay ( ELISA ) kit.
P0
Bagan 4.1 Skema Rancangan Penelitian in vitro
Keterangan : P = Populasi S = Sampel R = Random
K = MMP-1 di awal, sebelum diberikan perlakuan
K1 = MMP-1 kelompok kontrol yang tidak dipapar ekstrak asap rokok di akhir penelitian
K2 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 50μl/ml K3 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 25μl/ml K4 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 12,5μl/ml
K5 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 50μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr
K6 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 50μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 100μg/hr
K7 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 50μl/ml dan
pemberian asam α-lipoat 200μg/hr
K8 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 25μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr
K9 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 25μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 100μg/hr
K10 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 25μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 200μg/hr
K11 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 12,5μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr
K12 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 12,5μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 100μg/hr
K13 = MMP-1 kelompok setelah terpapar ekstrak asap rokok 12,5μl/ml dan pemberian asam α-lipoat 200μg/hr
P0 = Tidak ada perlakuan
P1 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 50μl/ml P2 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 25μl/ml P3 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 12,5μl/ml
P4 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 50μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr
P5 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 50μl/ml pada kelompok dengan
pemberian asam α-lipoat 100μg/hr
P6 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 50μl/ml pada kelompok dengan pemberian α-lipoic acid 200μg/hr
P7 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 25μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr
P8 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 25μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 100μg/hr
P9 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 25μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 200μg/hr
P10 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 12,5μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr
P11 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 12,5μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 100μg/hr
P12 = Perlakuan pemberian ekstrak asap rokok 12,5μl/ml pada kelompok dengan pemberian asam α-lipoat 200μg/hr
4.2 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gajah Mada dan Laboratorium Bagian Kulit dan Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada.
4.3 Subyek dan Sampel 4.3.1 Variabilitas populasi
Populasi pada penelitian in vitro adalah fibroblast yang diisolasi dari kulit preputium penis ( post sirkumsisi ) anak berusia 6-10 tahun yang sehat, sesuai dengan prosedur yang telah ditetapkan di LPPT Universitas Gajah Mada. Jumlah spesimen jaringan kulit preputium penis diambil sebanyak 5 spesimen, yang nantinya dipilih yang terbaik kondisinya.
4.3.2 Besaran sampel
Pada penelitian in vitro perhitungan jumlah sampel dihitung dengan rumus Federer (1963)
Rumus : ( n-1 )( k-1 ) ≥ 15
n = jumlah sampel (mewakili pengulangan perlakuan pada kelompok sampel)
k = jumlah kelompok perlakuan (kelompok perlakuan yang diberikan sebanyak 13)
sehingga didapatkan hasil : ( n-1 )( 13-1 ) ≥ 15 n = 2,25 ( 3 )
Jadi jumlah sampel yang diperlukan sebanyak 4 pada masing-masing kelompok perlakuan.
4.4 Variabel
4.4.1 Klasifikasi variabel
a. Variabel bebas : dosis asam α-lipoat dan dosis ekstrak asap rokok b. Variabel tergantung : ekspresi MMP-1
c. Variabel kendali : media kultur dan sel fibroblast 4.4.2 Definisi operasional variabel
1. Dosis asam α-lipoat adalah jumlah asam α-lipoat yang diberikan sebagai bahan uji (dengan menggunakan bahan aktif asam α-lipoat yang diproduksi oleh Ferron Pharm) dengan dosis 50μg/hr, 100μg/hr dan 200μg/hr pada kelompok perlakuan dengan asam α-lipoat, sebelum diberikan perlakuan paparan ekstrak asap rokok.
2. Pembuatan ekstrak asap rokok
Pada suhu ruang, ekstrak asap tembakau dihasilkan dengan melewatkan asap dari rokok melalui phosphate-buffered saline (PBS). Dua tabung yang berisi 20 ml PBS digunakan pada sistem ini. Satu sisi dari tabung ( A ) dihubungkan ke pompa, dan tabung yang lain ( B ) dihubungkan ke rokok.
Satu buah rokok ( dengan kertas dan filter ) dipompa selama 2 detik dengan interval 1 menit. Kemudian larutan asap dari kedua tabung ( A+B= 40 ml ) dikumpulkan dan disesuaikan pH-nya menuju 7,4 dengan cairan natrium bikarbonat dan disaring dengan menggunakan filter 0,22-μm ( Millipore Co., Bedford. Mass. )
3. Dosis ekstrak asap tembakau adalah jumlah kadar ekstrak asap rokok yang
diberikan pada kultur sel fibroblast, dengan konsentrasi 50μl/ml, 25μl/ml dan 12,5μl/ml. Pemberian ekstrak asap rokok dilakukan 1 kali pada masing-masing kelompok perlakuan.
4. Nilai ekspresi MMP-1 adalah nilai ekspresi MMP-1 pada supernatan kultur sel fibroblast yang dikumpulkan 24 jam setelah paparan dengan variasi dosis ekstrak asap rokok pada seluruh kelompok perlakuan dan kelompok kontrol, dinyatakan dengan satuan ng/gram dari protein seluler menggunakan human enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) kit.
4.5 Bahan dan Instrumen Penelitian 4.5.1 Bahan Utama
Bahan utama yang digunakan adalah bahan dasar asam α-lipoat, kit MMP-1, dan ekstrak asap rokok.
4.5.2 Bahan Penunjang
Bahan penunjang yang digunakan pada proses kultur fibroblast ini adalah Media RPMI 1640 ( dengan glutamine, tanpa sodium bicarbonate ), Fetal Bovine Serum ( FBS ), Media Komplit 20% ( FBS 20 ml, penicillin streptomycin 2 ml, fungisone 0,5 ml, ditambahkan Media RPMI sampai dengan 100 ml ), Phosphat Buffer Saline ( PBS ), Trypsin.
4.5.3 Instrumen Penelitian
Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1. Laminar Air Flow safety class II ( Labconco ) 2. Inkubator CO2 ( Memmer )
3. Mikroskop inverted ( Leitz ) 4. Mikroskop binokuler ( Olympus ) 5. ELISA Reader ( Bio Rad 680 XR ) 6. Sentrifuge 1500 rpm
7. Tissue Culture Flask
8. Petri kecil dan besar
9. Well Plated 8x12 ( 96 wadah )
10. Tabung sentrifuge 15 ml, conicle tube Eppendorff beserta raknya 11. Pipet mikro ( ukuran 20μl , 50-200μl , 100-1000μl )
12. Bilik hitung Neubauer 13. Scalpel
14. Pinset 15. Gunting
4.6 Prosedur Penelitian in vitro 4.6.1 Pemberian perlakuan in vitro
Kulit preputium penis yang telah disiapkan sebagai kultur primer dimasukan ke dalam medium komplit, kemudian disimpan satu hari dalam lemari pendingin dengan suhu 4ºC. Keesokan harinya kulit preputium penis tersebut diletakkan pada cawan petri, selanjutnya proses dilakukan dalam laminar flow.
Kulit tersebut dipotong dengan ukuran 3-4 cm, dipisahkan dari jaringan subkutan dan epidermis. Setelah itu dipotong dengan ukuran sekecil-kecilnya menggunakan gunting jaringan dengan bantuan pinset. Selanjutnya potongan-potongan jaringan tersebut dipindahkan ke dalam 3 buah petri kecil, disusun dibagian tengah petri dan ditutup dengan cara agak ditekan menggunakan cover glass. Sisa media komplit di sekitarnya dibuang menggunakan pipet mikro, setelah sisa media komplit tersebut habis, diganti dengan media komplit 20% sebanyak 3 ml pada masing-masing petri, dan dipastikan cover glass yang menutupi potongan jaringan tersebut tidak mengambang dengan menekannya menggunakan ujung tip pipet mikro yang digunakan mengisi larutan media komplit tersebut. Kemudian ketiga petri kecil masing-masing ditutup dengan tutup petri, selanjutnya disusun dalam petri besar. Petri besar ditutup dan diberi label. Kultur primer yang ditumbuhkan ini disimpan dalam inkubator CO2 ( 37ºC, 5% CO2, kelembaban 95% ).
Setelah 24 jam, kultur diamati setiap hari dengan mikroskop inverted, apakah sudah tampak adanya sel fibroblast. Diamati juga kemungkinan terjadinya kontaminasi bakteri atau jamur yang dapat menghambat pertumbuhan sel fibroblast. Apabila terjadi kontaminasi bakteri proses pertumbuhan kultur sel tidak dapat dilanjutkan dan harus segera diganti dengan yang baru. Media komplit 20%
pada kultur diganti setiap 3 hari. Sel fibroblast yang tumbuh mempunyai sifat menempel pada dasar petri sedangkan sel yang mati akan mengambang di permukaan media, sehingga saat penggantian media sel yang mati akan ikut terbuang.
Sel fibroblast dari kultur primer yang sudah konfluen 60-70% dapat dipanen dan dibiakkan kembali sebagai sub kultur ( kultur sekunder ). Supernatan dibuang, sisa larutan FBS yang masih ada dalam petri dibilas menggunakan media RPMI sampai bersih, setelah itu ditambahkan trypsin 0,25% sebanyak 1 ml untuk melepaskan sel yang melekat pada dasar petri, kemudian diinkubasi selama 8 menit. Dengan pemberian trypsin berbentuk bulat dan ukuranya menjadi lebih besar. Setelah inkubasi sejumlah sel dapat dibiakan kembali sebagai sub kultur dengan memindahkan sejumlah sel ke TCF lainnya yang telah diisi media komplit 7 ml, selanjutnya disimpan kembali dalam inkubator CO2 dan media diganti tiap 3 hari. Apabila sel telah cukup banyak jumlahnya dapat dilakukan panen sel dan penghitungan jumlah sel untuk proses perlakuan yang akan diberikan selanjutnya.
4.6.2 Penghitungan Jumlah Sel Uji
Adapun cara penghitungan sel adalah dengan cara sebagai berikut, terlebih dahulu larutan yang tersisa dalam TCF dibuang, setelah suspensi sel telah bersih dari FBS, dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge 15 ml yang telah diisi media RPMI, disentrifuge 1500 rpm selama 10 menit. Tampak sel menjadi berwarna putih mengendap di bagian dasar, supernatan dibuang. Sel yang telah mengendap ditambahkan media komplit 1 ml dan dihomogenkan. Suspensi sel yang telah
homogen diambil sebanyak 20μl, dimasukkan ke dalam well plate, kemudian tambahkan tripan blue 180μl lalu dihomogenkan. Ambil sel sebanyak 10μl masukkan ke dalam bilik hitung Neubauer, selanjutnya dihitung jumlah sel fibroblast dengan menggunakan mikroskop binokuler pembesaran 10x. Cara penghitungannya adalah dengan menghitung seluruh sel fibroblast yang ditemukan dalam 4 buah kotak berukuran 4x4 pada bilik hitung, selanjutnya perhitungan dilakukan dengan menggunakan rumus seperti berikut ini
n1 + n2 + n3 +n4
Jumlah sel/ml = x 106 :10 4
n = jumlah sel dalam masing-masing bilik hitung 4 = jumlah bilik hitung
106 = konstanta jumlah sel per ml larutan 10 = jumlah pengenceran larutan
4.6.3 Uji Aktivitas in vitro
Kultur fibroblast dibagi menjadi 3 kelompok dan sub kelompok dengan variasi dosis asam α-lipoat dan pemberian ekstrak asap rokok, yaitu :
Kelompok 1 : tanpa perlakuan apapun, sebagai kontrol negatif
Kelompok 2 : dengan perlakuan pemaparan dengan ekstrak asap rokok dengan dosis bervariasi 50μl/ml, 25μl/ml, dan 12,5μl/ml.
Kelompok 3 : dengan pemberian asam α-lipoat dengan variasi dosis 50μg/hr,
100μg/hr, dan 200μg/hr, serta pemaparan ekstrak asap rokok dengan variasi dosis 50μl/ml, 25μl/ml, dan 12,5μl/ml.
Dua puluh empat jam setelah perlakuan pemaparan dengan ekstrak asap rokok, supernatan dari masing-masing sub kelompok beserta pengulangan kelompok tersebut dikumpulkan dan ekspresi MMP-1 dinilai dengan menggunakan kit MMP-1 human enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA ) dengan prosedur yang sesuai dengan protokol dari pabrik.
4.7 Alur Penelitian
Kulit Preputium
Kultur Fibroblast
KONTROL
Ekstrak Asap Rokok/EAR (μl/ml) dan asam α-lipoat/AAL (μg/hr)
EAR 50
Bagan 4.2 Alur Penelitian in vitro 4.8 Analisis Data
Data yang didapatkan pada penelitian in vitro ini dianalisis sebagai berikut (Campbel, 1963; Sugiyono, 2009) :
1. Analisis Deskriptif
2. Analisis Normalitas dan Homogenitas :
a. Uji Normalitas data dengan Saphiro-Wilk Test untuk mengetahui rerata data sampel berdistribusi normal atau tidak.
b. Uji Homogenitas = test of the equality of variances = F test (Levene's Test for Equality of Variances).
3. Analisis Inferensial :
A. Data berdistribusi normal : (nilai α = 0,05)
Uji Compare means antar kelompok dengan Anova Test
1.Post test kelompok kontrol negatif, kelompok ekstrak asap rokok, dan kelompok asam α-lipoat + ekstrak asap rokok.
2. Data beda (selisih) kelompok kontrol negatif, kelompok ekstrak asap rokok, dan kelompok asam α-lipoat + ekstrak asap rokok.
BAB V
HASIL PENELITIAN
Proses penelitian dimulai dengan pembiakan kultur sel fibroblast selama ± 6 minggu dengan mengikuti prosedur standar pembuatan kultur sel. Setelah jumlah sel fibroblast mencukupi dilakukan pembagian kelompok, menjadi 1 kelompok kontrol dan 12 kelompok perlakuan yang sesuai dengan rancangan penelitian. Setelah pemberian pelakuan, pengukuran nilai absorbansi MMP-1 menggunakan ELISA reader, selanjutnya analisis data dan pengolahan data menggunakan Program Statistic Base SPSS 11,5 for Windows didapatkan hasil sebagai berikut
5.1 Uji Normalitas Data
Data sebelum perlakuan maupun sesudah perlakuan pada masing-masing kelompok diuji normalitasnya dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. Hasilnya menunjukkan data berdistribusi normal (p>0,05), disajikan pada Lampiran 1.
5.2 Uji Homogenitas Data antar Kelompok
Data antar kelompok baik sebelum perlakuan maupun sesudah perlakuan diuji homogenitasnya dengan menggunakan uji Levene's test. Hasilnya menunjukkan data homogen (p>0,05), disajikan pada Lampiran 2, 3 dan 4.
5.3 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 50μl/ml (EAR 50μl/ml) 5.3.1 Uji Efek Pemberian EAR 50μl/ml
Uji efek perlakuan bertujuan untuk membandingkan rerata antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way Anova disajikan pada Tabel 5.1 berikut.
Tabel 5.1
Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 50μl/ml
Kelompok subyek N Rerata SB F P
adalah 0,114 ± 0,010, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 50 adalah 0,346 ± 0,017, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 50 + AAL50μg/hr adalah 0,274 ± 0,014, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 50 + AAL100μg/hr adalah 0,251 ± 0,005, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 50 + AAL200μg/hr adalah 0,222 ± 0,009
Tabel 5.1 di atas, dengan uji One Way Anova menunjukkan bahwa kelima kelompok sesudah diberikan perlakuan rerata MMP-1 berbeda secara bermakna (p<0,05).
Gambar 5.1 Grafik Sesudah Pemberian EAR 50μl/ml
Gambar 5.1 di atas menggambarkan bahwa dengan pemberian EAR 50μl/ml meningkatkan MMP-1, dan dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr, 100μg/hr dan 200μg/hr sebelum diberikan EAR dengan dosis yang sama tampak aktivitas MMP-1 mengalami penurunan.
Sebagai uji lanjutan untuk mengetahui beda rerata kelompok yang berbeda perlu dilakukan uji lanjutan dengan Least Significant Difference – test (LSD).
MMP-1
Didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok-kelompok yang berbeda tersebut. Hal tersebut ditunjukkan pada tabel 5.2 dengan uraian sebagai berikut
1. Beda rerata antara kelompok kontrol dan kelompok EAR 50μl/ml didapatkan nilai p<0,05.
2. Beda rerata antara kelompok kontrol dengan kelompok EAR 50μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan p<0,05.
3. Beda rerata antara kelompok EAR 50μl/ml dengan kelompok EAR 50μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.
4. Beda rerata antara kelompok EAR 50 + asam α-lipoat dengan variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.
Hasil uji disajikan pada tabel 5.2 di bawah ini : Tabel 5.2
Analisis Komparasi antar Kelompok setelah Pemberian EAR 50μl/ml
Kelompok BR P Interpretasi
Kontrol & EAR 50 0,231 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 50 + 50 AAL 0,160 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 50 + 100 AAL 0,136 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 50 + 200 AAL 0,108 0,000 Berbeda bermakna EAR 50 & EAR 50 + 50 AAL 0,715 0,000 Berbeda bermakna EAR 50 & EAR 50 + 100 AAL 0,095 0,000 Berbeda bermakna EAR 50 & EAR 50 + 200 AAL 0,123 0,000 Berbeda bermakna
EAR 50 + 50 AAL & EAR 50 + 100 AAL 0,235 0,015 Berbeda bermakna EAR 50 + 50 AAL & EAR 50 + 200 AAL 0,517 0,000 Berbeda bermakna EAR 50 + 100 AAL & EAR 50 + 200 AAL 0,282 0,005 Berbeda bermakna
5.4 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 25μl/ml (EAR 25μl/ml) 5.4.1 Uji Efek Pemberian EAR 25μl/ml
Uji efek perlakuan bertujuan untuk membandingkan rerata antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way Anova disajikan pada Tabel 5.3 yang menunjukkan bahwa rerata MMP-1 pada
Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 25μl/ml
Kelompok subyek N Rerata SB F P
Tabel 5.3 di atas, dengan uji One Way Anova menunjukkan bahwa kelima kelompok sesudah diberikan perlakuan reratanya berbeda secara bermakna (p<0,05).
Gambar 5.2 Grafik Sesudah Pemberian EAR 25μl/ml
Gambar 5.2 di atas menggambarkan bahwa dengan pemberian EAR 25μl/ml meningkatkan MMP-1, dan dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr, 100μg/hr dan 200μg/hr sebelum diberikan EAR dengan dosis yang sama tampak aktivitas MMP-1 mengalami penurunan.
Sebagai uji lanjutan untuk mengetahui beda rerata kelompok yang berbeda perlu dilakukan uji lanjutan dengan Least Significant Difference – test (LSD).
Didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok-kelompok yang berbeda tersebut. Hal tersebut ditunjukkan pada tabel 5.2 dengan uraian sebagai berikut
1. Beda rerata antara kelompok kontrol dan kelompok EAR 25μl/ml didapatkan nilai p<0,05.
MMP-1
2. Beda rerata antara kelompok kontrol dengan kelompok EAR 25μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan p<0,05.
3. Beda rerata antara kelompok EAR 25μl/ml dengan kelompok EAR 25μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.
4. Beda rerata antara kelompok EAR 25 + asam α-lipoat dengan variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.
Tabel 5.4
Analisis Komparasi antar Kelompok setelah Pemberian EAR 25μl/ml
Kelompok BR P Interpretasi
Kontrol & EAR 25 0,136 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 25 + 50 AAL 0,119 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 25 + 100 AAL 0,094 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 25 + 200 AAL 0,070 0,000 Berbeda bermakna EAR 25 & EAR 25 + 50 AAL 0,167 0,029 Berbeda bermakna EAR 25 & EAR 25 + 100 AAL 0,417 0,000 Berbeda bermakna EAR 25 & EAR 25 + 200 AAL 0,665 0,000 Berbeda bermakna EAR 25 + 50 AAL & EAR 25 + 100 AAL 0,250 0,003 Berbeda bermakna
EAR 25 + 50 AAL & EAR 25 + 200 AAL 0,497 0,000 Berbeda bermakna EAR 25 + 100 AAL & EAR 25 + 200 AAL 0,247 0,003 Berbeda bermakna
5.5 Pemberian Ekstrak Asap Rokok 12,5μl/ml (EAR 12,5μl/ml) 5.5.1 Uji Efek Pemberian EAR 12,5μl/ml
Uji efek perlakuan bertujuan untuk membandingkan rerata antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji One Way Anova disajikan pada Tabel 5.5 yang menunjukkan bahwa rerata MMP-1 pada kelompok kontrol adalah 0,114 ± 0,010, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 adalah 0,175 ± 0,009, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 + AAL50μg/hr adalah 0,161 ± 0,004, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 + AAL100μg/hr adalah 0,142 ± 0,011, rerata MMP-1 pada kelompok EAR 12,5 + AAL200μg/hr adalah 0,128 ± 0,005.
Tabel 5.5
Rerata MMP-1 antar Kelompok Sesudah Pemberian EAR 12,5μl/ml
Kelompok subyek N Rerata SB F P
Tabel 5.5 di atas, dengan uji One Way Anova menunjukkan bahwa kelima
kelompok sesudah diberikan perlakuan reratanya berbeda secara bermakna (p<0,05).
Gambar 5.3 Grafik Sesudah Pemberian EAR 12,5μl/ml
Gambar 5.3 di atas menggambarkan bahwa dengan pemberian EAR 12,5μl/ml meningkatkan MMP-1, dan dengan pemberian asam α-lipoat 50μg/hr, 100μg/hr dan 200μg/hr sebelum diberikan EAR dengan dosis yang sama tampak aktivitas MMP-1 mengalami penurunan.
Sebagai uji lanjutan untuk mengetahui beda rerata kelompok yang berbeda perlu dilakukan uji lanjutan dengan Least Significant Difference – test (LSD).
Didapatkan perbedaan yang bermakna antara kelompok-kelompok yang berbeda tersebut. Hal tersebut ditunjukkan pada tabel 5.6 dengan uraian sebagai berikut
1. Beda rerata antara kelompok kontrol dan kelompok EAR 12,5μl/ml didapatkan nilai p<0,05.
MMP-1
2. Beda rerata antara kelompok kontrol dengan kelompok EAR 12,5μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan p<0,05.
3. Beda rerata antara kelompok EAR 12,5μl/ml dengan kelompok EAR 12,5μl/ml + asam α-lipoat (variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.
4. Beda rerata antara kelompok EAR 12,5 + asam α-lipoat dengan variasi dosis 50, 100 dan 200μg/hr) menunjukkan nilai p<0,05.
Tabel 5.6
Analisis Komparasi antar Kelompok setelah Pemberian EAR 12,5μl/ml
Kelompok BR P Interpretasi
Kontrol & EAR 12,5 0,060 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 12,5 + 50 AAL 0,047 0,000 Berbeda bermakna
Kontrol & EAR 12,5 + 100 AAL 0,028 0,000 Berbeda bermakna Kontrol & EAR 12,5 + 200 AAL 0,013 0,042 Berbeda bermakna EAR 12,5 & EAR 12,5 + 50 AAL 0,013 0,042 Berbeda bermakna EAR 12,5 & EAR 12,5 + 100 AAL 0,325 0,000 Berbeda bermakna EAR 12,5 & EAR 12,5 + 200 AAL 0,472 0,000 Berbeda bermakna EAR 12,5+50 AAL & EAR 12,5+100 AAL 0,019 0,007 Berbeda bermakna EAR 12,5+50 AAL & EAR 12,5+200 AAL 0,033 0,000 Berbeda bermakna EAR 12,5+100 AAL & EAR 12,5+200 AAL 0,014 0,028 Berbeda bermakna
BAB VI
PEMBAHASAN
Berdasarkan teori yang telah diuraikan dimana paparan ekstrak asap rokok dapat menimbulkan kerusakan kolagen kulit.
Akibat dari paparan ekstrak asap rokok yang menimbulkan keadaan stres pada sel fibroblas memicu pembentukan ROS, meningkatkan latent TGF-β serta menurunkan jumlah reseptor TGF-β. Hal tersebut meningkatkan produksi dari MMP-1,3,7 yang menyebabkan peningkatan degradasi matriks kolagen, penumpukan proteoglikan abnormal, serta akumulasi tropoelastin abnormal.
Semua kerusakan tersebut mengakibatkan penghancuran matriks dermis serta gangguan pada sistem perbaikan. Apabila kerusakan pada kulit ini berlanjut terus menerus lebih jauh akan terjadi penuaan dini pada kulit tersebut.
Dari hasil penelitian dan analisis data yang telah dilakukan pada hasil penelitian in vitro tampak bahwa ekstrak asap rokok berpengaruh terhadap terjadinya peningkatan MMP-1 yang dihasilkan oleh sel fibroblas, dimana terjadi peningkatan nilai MMP-1 yang signifikan (p<0,05) pada kelompok kultur sel fibroblas yang dipapar ekstrak asap rokok dosis 50μl/ml, 25μl/ml, 12,5μl/ml jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Peningkatan MMP-1 terjadi pada semua dosis. Pada pemaparan ekstrak asap rokok dosis 50μl/ml terjadi peningkatan MMP-1 sebesar 3,04 kali dari kontrol, pada pemaparan ekstrak asap rokok dosis 25μl/ml terjadi peningkatan MMP-1 sebesar 2,20 kali dari kontrol dan pada pemaparan ekstrak asap rokok 12,5μl/ml terjadi peningkatan MMP-1 sebesar 1,54 kali dari kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa MMP-1 dapat terbentuk pada berbagai variasi dosis. Peningkatan MMP-1 tertinggi pada penelitian ini terjadi
pada paparan ekstrak asap rokok dosis 50μl/ml, yaitu sebesar 3,04 kali lipat dari MMP-1 pada kelompok kontrol yang tidak dipapar ekstrak asap rokok. Sedangkan pada paparan ekstrak asap rokok dengan dosis 12,5μl/ml terjadi peningkatan MMP-1 sebesar 1,54 kali lipat dari kontrol, peningkatan pada dosis ini lebih rendah jika dibandingkan dengan peningkatan MMP-1 pada dosis lainnya.
Sebagai antioksidan, asam α-lipoat dinyatakan mampu memberikan perlindungan pada kulit terhadap paparan ekstrak asap rokok yang dapat memicu pembentukan radikal bebas, radikal hidroksil, singlet oxygen, serta kerusakan lainnya yang dapat ditimbulkan, sesuai dengan sifat asam α-lipoat yang dapat memakan berbagai macam radikal bebas dan mengkelasi logam (Nichols, 2001).
Asam α-lipoat mempunyai kelebihan dibandingkan dengan antioksidan lainnya yaitu kelarutannya pada air dan lemak, sehingga memudahkan asam α-lipoat melalui membran sel dan menetralkan radikal bebas (Gurer, 1999).
Kelebihan lainnya adalah kemampuan untuk mendaur ulang beberapa antioksidan penting seperti vitamin C, E, dan glutation. Antioksidan menjadi teroksidasi akibat meredam sebuah radikal bebas, keadaan teroksidasi ini tidak dapat meredam radikal bebas yang baru, sampai antioksidan tersebut direduksi
Kelebihan lainnya adalah kemampuan untuk mendaur ulang beberapa antioksidan penting seperti vitamin C, E, dan glutation. Antioksidan menjadi teroksidasi akibat meredam sebuah radikal bebas, keadaan teroksidasi ini tidak dapat meredam radikal bebas yang baru, sampai antioksidan tersebut direduksi