BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
D. Uji Identifikasi Escherichia coli
3. Identifikasi dan konfirmasi keberadaan E.coli pada sampel
Uji konfirmasi bertujuan untuk memastikan dan menegaskan sampel jamu cekok benar mengandung E.coli. Tahap identifikasi merupakan serangkaian uji yang berguna untuk mengidentifikasi apakah sampel benar-benar mengandung
E.coli.Uji dilakukan dengan cara mengambil satu sengkelit mikroba yang tumbuh pada media TBX (yang berwarna hijau kebiruan) dari ketiga sampel jamu cekok. Tahap uji identifikasi meliputi pengujian biokimia, yaitu uji fermentasi gula-gula dan uji SIM, dan uji IMVIC.
Uji identifikasi dan konfirmasi menggunakan kontrol positifE.coliATCC 25922.E.coliATCC 25922 merupakan salah satu strain murni bakteri E.coli. Pada umumnya ada tiga jenis strain murni E.coli yang sering digunakan dalam penelitian yaitu E.coli ATCC 25922, E.coli ATCC 25922D-5, dan E.coli ATCC 700927. Ketiga strain E.coli ini dibedakan berdasarkan struktur DNA, serotype dan antigen. E.coli ATCC 25922D-5 merupakan modifikasi dari strain E.coli ATCC 25922. E.coli ATCC 25922 dan E.coli ATCC 25922D-5 biasa digunakan untuk pengujian pada makanan, minuman, dan antibiotik. Sedangkan E.coli ATCC 700927 digunakan untuk pengujian antibiotik dan penelitian Enterobacter. E.coli ATCC 29522 memiliki karakteristik bakteri gram negatif, patogen, bersifat aerob, mempunyai antigen O, dan negatif preseptrol (ATCC, 2014).
a. Uji biokimia
Tujuan dilakukannya uji biokimia adalah untuk menegaskan keberadaan E.coli dalam sampel jamu cekok. Setelah dilakukan tahap isolasi pada media Tryptone Bile X-Glucoronide (TBX), keberadaan positif E.coli ditunjukkan dengan koloni yang berwarna hijau kebiruan.
Pengujian biokimia dilakukan dengan uji fermentasi gula-gula yang terdiri dari beberapa jenis gula yaitu glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan
sukrosa. Tujuan uji biokimia adalah untuk melihat apakah bakteri yang terdapat pada sampel jamu cekok memiliki kemampuan memfermentasikan jenis gula-gula spesifik yang dapat mencerminkan sifat bakteri tersebut sehingga dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk menegaskan keberadaan bakteri (Soemarno, 2000). Uji biokimia dilakukan dengan menanam satu sengkelit dari media TBX dan diinokulasikan ke dalam tabung yang sudah berisi gula-gula, lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C.
Bakteri E.coli adalah bakteri yang mampu menguraikan gula-gula spesifik seperti glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa agar dapat ditranspor ke dalam sel (Hotl dkk, 2000). Apabila bakteri positif memfermentasikan gula-gula dalam uji biokimia maka akan terjadi perubahan warna dari merah ke kuning. Perubahan warna disebabkan adanya indikator Phenol red. Indikator Phenol red berwarna merah dan akan berubah warna menjadi kuning apabila terjadi penurunan pH menjadi lebih asam. Kondisi asam dihasilkan dari proses fermentasi gula oleh bakteri yang menghasilkan asam piruvat dan asam laktat yang akan menyebabkan terjadinya penurunan pH. Penurunan pH akan menyebabkan suasana menjadi lebih asam sehingga dengan kondisi asam warna indikator akan berubah menjadi kuning. BakteriE.coliadalah bakteri yang mampu menghasilkan asam piruvat dan laktat dalam proses penguraian gula-gula, sehingga uji biokimia dapat digunakan sebagai penegasan karakteristikE.coli(Soemarno, 2000).
Gambar 3. Hasil uji fermentasi gula-gula sampel jamu cekok Keterangan :
Larutan gula-gula : 1(glukosa, 2 (laktosa), 3 (Manitol), 4 (Maltosa), 5 (Sukrosa). K : Kontrol positif (biakan murniE.coli ATCC 25922)
S : Warna merah larutan gula-gula sebelum diinkubasi
Data pada gambar 3 menunjukkan bahwa ketiga sampel mengalami perubahan warna dari merah menjadi kuning. Perubahan warna dari indikator tersebut menandakan bakteri uji mampi menguraikan gula-gula. Hasil uji fermentasi gula-gula akan dilanjutkan dengan uji SIM untuk melengkapi data identitas bakteri.
b. Uji SIM
Uji SIM merupakan uji identifikasi E.coli dengan menggunakan tiga indikator yaitu, pembentukan sulfur (H2S), pembentukan Indol dari hasil peruraian asam amino, dan pengamatan pergerakan pertumbuhan bakteri dalam media tabung. Media yang digunakan adalah media SIM yang memiliki komposisi sebagai berikut : (1) Pancreatic Digest of Casein, (2)Peptic Digest of Animal Tissue, (3) Ferrous Ammonium Sulfate, (4) Sodium Thiosulfate, (5) Nutrient Agar. Komposisi media SIM tersebut memungkinkan untuk dilakukan tiga pengujian sekaligus dalam satu media. Kandungan Ferrous Ammonium Sulfate dan Sodium Thiosulfate digumakan untuk uji H2S, kandungan Nutrien Agar (NA) dapat digunakan untuk uji motilitas sedangkan uji Indol perlu penambahan reagen kovacs (Finegold dan Baron, 1996).
Uji sulfur bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan asam amino menjadi sulfur (H2S). H2S dihasilkan oleh beberapa jenis mikroba melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang (S) seperti lisin dan mentionin. H2S dapat diproduksi melalui reduksi senyawa-senyawa belerang anorganik seperti tiosulfat, sulfit, atau sulfat. Hasil peruraian H2S dapat diamati dengan penambahan garam-garam logam berat kedalam medium. Hasil positif terbentuknya sulfur adalah adanya endapan berwarna hitam. Hasil negatif pada uji sulfur adalah tidak terbentuknya endapan hitam. Endapan hitam tidak terbentuk karena bakteri tidak mampu menghasilkan sulfur (Nugraheni, 2010). Menurut Holt dkk (2000), bakteri E.coli tidak mampu menghasilkan residu sulfur dalam proses peruraian asam amino. Jika bakteri
mampu menghasilkan sulfur maka sulfur tersebut akan berinteraksi dengan Sodium Thiosulfat membentuk kompleks Ferrous Thiosulfate berupa logam berwarna hitam pada permukaan media SIM. Reaksi pembentukan kompleks Ferrous Sulfate ini dijadikan sebagai indikator kemampuan bakteri dalam menghasilkan sulfur sebagai hasil proses metabolismenya (Finegold dan Baron, 1996).
Gambar 4. Hasil Uji Sulfur sampel jamu cekok Keterangan :
K : kontrol positif ; P : sampel jamu cekok
Berdasarkan data (gambar 4) dari ketiga sampel jamu cekok tidak menunjukkan pembentukan sulfur. Hasil dibandingkan kontrol yang juga tidak ada pembentukan sulfur. Hasil dari uji ini tidak dapat digunakan sebagai acuan untuk menyatakan bakteri yang diuji adalah E.coli. oleh karena itu, pengujian dilanjutkan dengan uji motilitas dan indol.
Uji motilitas adalah metode yang digunakan untuk mengidentifikasi E.coli terhadap bakteri lainnya berdasarkan penyebaran koloni karena E.coli memiliki kemampuan bergerak (motil) dalam media SIM. Adanya kandungan NA semisolid dalam media SIM memungkinkan bakteri yang memiliki flagel
melakukan pergerakan dalam media tersebut. E.coli memiliki karakteristik mempunyai flagel di seluruh permukaan sel (peritrik) sebagai alat gerak dalam habitatnya. Apabila dalam media terdapat pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka dinyatakan bakteri yang diidentifikasi tersebut adalah golongan EnterobactertermasukE.coli(Holt dkk, 2000).
Gambar 5. Hasil Uji Motilitas Sampel Jamu Cekok pada Media SIM Keterangan:
K: kontrol positif P: sampel jamu cekok
Tanda panah merah menunjukkan adanya pertumbuhan koloni bakteri yang menyebar
Hasil uji yang diperoleh yaitu baik sampel 1, 2, dan 3 mengalami kekeruhan dan hanya pada sampel 1 dan 2 yang terlihat adanya pertumbuhan koloni yang menyebar dibandingkan dengan kotrol positifE.coli ATCC 25922.Hasil uji ini digunakan selanjutnya untuk uji indol.
c. Uji IMVIC (Indol, Metil Merah, Voges Prokaeur, Sitrat)
Uji IMVIC merupakan tahap uji identifikasi dimana hasil biakan dari media TBX yang sudah ditanam di media NA diambil satu sengkelit dan
dilakukan uji yang meliputi uji metil red, uji indol, uji sitrat dan uji voges proskaeur.
