BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
D. Identifikasi Kualitatif Kandungan Kimia Ekstrak Etanol Daun Sirih
(KLT)
Identifikasi kandungan kimia ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol daun sirih merah dengan mengamati warna yang terbentuk dari reaksi antara zat aktif yang ada dengan pereaksi yang digunakan. Kandungan kimia daun sirih merah meliputi flavonoid, alkaloid, senyawa polifenol, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). Pada ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan uji alkaloid, uji flavonoid, uji tanin dan uji minyak atsiri karena dari hasil identifikasi serbuk daun sirih merah tidak mengandung antrakinon, kardenolida, dan saponin. Pengamatan pada uji tabung dapat melalui pengamatan warna. Peristiwa terjadinya warna disebabkan karena struktur zat aktif dari tanaman yang mengandung gugus kromofor bereaksi dengan pereaksi tertentu sehingga menimbulkan warna yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
khas. Parameter hasil berdasarkan warna yang terbentuk dinyatakan positif apabila didalam reaksi warna yang terbentuk secara intensif tidak berubah.
Tabel I. Hasil pengamatan uji kandungan kimia ekstrak etanol daun sirih merah dengan uji tabung
Identifikasi Pereaksi Hasil Pengamatan
Alkaloid Pereaksi Mayer Terbentuk endapan
merah bata
Pereaksi Dragendorf Terbentuk endapan
merah bata
Minyak atsiri - Tercium bau khas
Flavonoid Fe3Cl Terbentuk warna
hijau tua
Tanin Natrium klorida 2 %
dan Larutan Gelatin 1%
Tidak terbentuk endapan
a. Identifikasi Alkaloid
Pereaksi Mayer digunakan untuk mengetahui adanya basa amin (alkaloid). Reaksi positif jika terbentuk endapan dengan penambahan pereaksi Mayer dan Dragendorff. Pada uji alkaloid sampel di didihkan dengan HCl 1% dengan tujuan untuk menggaramkan alkaloid yang berbentuk basa. Dari hasil identifikasi alkaloid menunjukkan hasil yang positif, hal ini berarti ekstrak etanol daun sirih merah mengandung alkaloid. Kemampuan alkaloid mengendapkan logam
pereaksi dimungkinkan oleh adanya atom nitrogen yang memiliki lone pair
elektron pada struktur alkaloid yang dapat membentuk ikatan komplek dengan ion logam berat sehingga terbentuk kristal yang tidak larut dalam air.
b. Identifikasi Minyak Atsiri
Identifikasi adanya minyak atsiri dalam ekstrak etanol daun sirih merah hasil positif ditunjukkan dengan timbulnya bau aromatik khas sirih merah. Pada
36
identifikasi minyak atsiri digunakan eter dan etanol untuk melarutkan minyak atsiri di dalam ekstrak etanol daun sirih merah sehingga saat dipanaskan dapat tercium bau khas daun sirih. Dari hasil percobaan didapatkan hasil yang positif, hal ini berarti ekstrak daun sirih merah mengandung minyak atsiri. Bagian utama dari minyak atsiri adalah terpenoid yang menyebabkan wangi, bau yang khas pada tumbuhan.
c. Identifikasi Flavonoid
Ekstrak etanol daun sirih merah dididihkan dengan aquadest dan disaring saat masih panas karena senyawa flavonoid lebih mudah larut dalam air panas. Penambahan Besi (III) klorida digunakan untuk mengetahui adanya senyawa fenolik termasuk flavonoid. Terbentuknya warna hijau biru menunjukkan adanya flavonoid. Dari hasil pengujian identifikasi flavonoid diketahui bahwa terbentuk warna hijau tua, hal ini berarti ekstrak etanol daun sirih merah mengandung flavonoid.
d. Identifikasi Tanin
Pada identifikasi tanin ditambahkan larutan natrium klorida 2 % (1 ml) dan larutan gelatin 1 % (5 ml). Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan dengan penambahan kedua larutan tersebut. Hasil identifikasi tanin dari ekstrak etanol daun sirih merah menunjukkan tidak terbentuknya endapan, hal ini tidak berarti ekstrak etanol daun sirih merah tidak mengandung tanin. Kemungkinan tanin rusak oleh pemanasan pada saat proses soxhletasi berlangsung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Dari hasil identifikasi dengan uji tabung memberikan kemungkinan sementara keberadaan alkaloid, minyak atsiri, dan flavonoid dalam ekstrak etanol daun sirih merah.
Pemeriksaan kandungan kimia secara KLT dilakukan untuk memperoleh gambaran yang lebih pasti mengenai kandungan kimia dalam ekstrak etanol daun sirih merah. Analisis KLT mempunyai beberapa keuntungan yaitu waktu yang dibutuhkan singkat, dapat memberikan pemisahan yang baik, lebih sederhana, cuplikan dan pelarut yang digunakan sedikit.
a) Identifikasi Alkaloid
Identifikasi alkaloid dengan KLT menggunakan fase diam silika gel GF 254 nm dan fase geraknya adalah tertier butanol : kloroform : dietil amina (2:7:1 v/v). Untuk deteksi digunakan pereaksi semprot Dragendorff. Sebagai pembanding adanya alkaloid digunakan skopolamin. Skopolamin digunakan sebagai pembanding karena skopolamin termasuk alkaloid. Fase gerak yang digunakan merupakan senyawa yang nonpolar karena alkaloid yang akan dipisahkan merupakan senyawa nonpolar. Sementara silika gel GF 254 nm merupakan senyawa polar di mana mengandung indikator fluoresensi gelombang 254 nm, terlihat sebagai bercak gelap dengan latar belakang berfluoresensi. Sebelum digunakan, silika gel GF 254 nm yang ditempatkan di lempeng kaca diaktifkan terlebih dahulu dengan cara lempeng dipanasi di oven agar pori-porinya terbuka sehingga perambatan bercak saat eluasi atau pengembangan dapat maksimal (Stahl, 1985).
38
Ekstrak etanol daun sirih merah ditotolkan pada lempeng KLT menggunakan pipa kapiler. Eluasi lempeng KLT dilakukan di dalam tabung yang jenuh akan uap dari fase gerak. Penempatan kertas saring yang dibasahi dengan fase gerak pada dinding tabung akan membantu dan mempercepat proses penjenuhan. Penjenuhan ini sendiri bertujuan agar perambatan dapat berjalan dengan cepat dan optimal. Jarak rambat yang ditentukan pada penelitian ini adalah 10 cm. Eluasi dilakukan sampai pada saat fase gerak tepat melampaui jarak yang telah ditentukan (10 cm).
Dari KLT yang telah dilakukan hasilnya dapat dilihat secara visual bahwa terjadi pemisahan senyawa setelah ditotolkan pada fase diam dan dieluasi dengan fase gerak. Untuk meningkatkan kepekaan deteksi, memperjelas gambaran bercak sehingga dapat meningkatkan intensitas warna pada kromatogram maka di semprot dengan menggunakan pereaksi semprot Dragendorff.
Dari hasil KLT didapat harga Rf dan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah dalam tabel II
Tabel II. Harga Rf dan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah Senyawa Harga
uji Rf
Vis UV 254 UV 365 Vis UV 254 UV 365
Ekstrak etanol 0.19 Hijau Hijau merah terang Orange Orange Orange
Pembanding 0.19 Kuning Ungu - Orange Orange Orange
skopolamin
Sebelum disemprot Dragendorff
Setelah disemprot Dragendorff
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Rf Rf Rf 1,00 1,00 1,00 0,90 0,90 0,90 0,80 0,80 0,80 0,70 0,70 0,70 0,60 0,60 0,60 0,50 0,50 0,50 0,40 0,40 0,40 0,30 0,30 0,30 0,20 0,20 0,20 0,10 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 A B A B A B I II III
Gambar 1. Kromatogram Ekstrak etanol daun sirih merah pada identifikasi Alkaloid
Keterangan :
I = deteksi dengan sinar tampak
II = deteksi dengan sinar UV 254 nm
III = deteksi dengan sinar UV 365 nm (setelah disemprot
Dragendorff)
A = ekstrak etanol daun sirih merah
B = pembanding skopolamin
Fase diam = silika gel GF 254 nm
Fase gerak = t butanol : kloroform : dietil amina (2:7:1 v/v) Jarak pengembangan = 10 cm
Dari hasil KLT diperoleh 1 bercak pemisahan untuk sampel ekstrak etanol daun sirih merah dengan Rf sebesar 0,19. Pembanding skopolamin memiliki harga Rf 0,19. Dengan demikian diketahui bahwa bercak sampel dengan harga Rf
40
sebesar 0,19 merupakan alkaloid. Hal ini diperkuat dengan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah yang sama dengan warna bercak pembanding setelah disemprot dengan Dragendorff yaitu orange. Menurut Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M., (1984) dengan penyemprotan Dragendorff nampak bercak berwarna orange dan pembanding skopolamin juga berwarna orange, hal ini menunjukkan adanya alkaloid. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel benar-benar mengandung alkaloid. Deteksi alkaloid yang paling ideal adalah dengan mengamati perubahan warna sebelum dan sesudah disemprot dengan pereaksi Dragendorff (Harbone, 1987).
b) Identifikasi Minyak Atsiri
Identifikasi minyak atsiri dengan KLT menggunakan fase diam silika gel GF 254 nm yang bersifat polar. Perbedaan sifat kepolaran dari silika gel GF 254 nm dan minyak atsiri diharapkan agar tidak terjadi pengikatan antara zat uji dengan fase diam sehingga zat uji dapat tereluasi dengan baik dengan bantuan fase gerak yang sifatnya sama dengan zat uji. Fase gerak yang digunakan toluene : etil asetat (93:7 v/v) yang bersifat non polar sama dengan minyak atsiri. Fase gerak yang digunakan harus memiliki sifat yang relatif sama dengan senyawa yang akan dipisahkan tetapi harus memiliki sifat yang tidak campur dengan fase diam (Sastrohamidjojo, 1991).
Ekstrak etanol daun sirih merah ditotolkan pada lempeng KLT menggunakan pipa kapiler. Eluasi lempeng KLT dilakukan di dalam tabung yang jenuh akan uap dari fase gerak. Penempatan kertas saring yang dibasahi dengan fase gerak pada dinding tabung akan membantu dan mempercepat proses
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
penjenuhan. Penjenuhan ini sendiri bertujuan agar perambatan dapat berjalan dengan cepat dan optimal. Jarak rambat yang ditentukan pada penelitian ini adalah 10 cm. Eluasi dilakukan sampai pada saat fase gerak tepat melampaui jarak yang telah ditentukan (10 cm).
Pembanding yang digunakan dalam KLT ekstrak etanol daun sirih merah adalah eugenol. Eugenol digunakan sebagai pembanding karena di dalam minyak atsiri daun sirih merah terdapat eugenol (Anonim, 2008b). Identifikasi KLT minyak atsiri ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan juga dengan penyemprotan untuk meningkatkan intensitas warna pada kromatogram. Pereaksi semprot yang digunakan adalah vanilin-asam sulfat (Wagner, H., Bladt, S., and Zgainski, E.M., 1984). Vanilin-asam sulfat digunakan sebagai pereaksi semprot karena vanilin-asam sulfat dapat digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa terpenoid dalam minyak atsiri seperti eugenol.
Dari hasil KLT didapat harga Rf dan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah dalam tabel III
Tabel III. Harga Rf dan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah
Senyawa Harga uji Rf
Vis UV 254 UV 365 Vis UV 254 UV 365
Ekstrak etanol 0,28 Hijau Kuning Kuning Kuning Hijau Hijau kehijauan kehijauan kehijauan
0,36 Hijau Kuning Biru Biru Biru Biru
kehijauan
0,88 Hijau Kuning Kuning Kuning Biru Biru
muda muda
Pembanding 0,49 Kecoklatan Ungu - Biru -
-eugenol
Sebelum disemprot Setelah disemprot Vanilin-asam sulfat Vanilin-asam sulfat
42 Rf Rf Rf 1,00 1,00 1,00 0,90 0,90 0,90 0,80 0,80 0,80 0,70 0,70 0,70 0,60 0,60 0,60 0,50 0,50 0,50 0,40 0,40 0,40 0,30 0,30 0,30 0,20 0,20 0,20 0,10 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 A B A B A B I II III
Gambar 2. Kromatogram ekstrak etanol daun sirih merah pada identifikasi Minyak Atsiri
Keterangan :
I = deteksi dengan sinar tampak
II = deteksi dengan sinar UV 254 nm
III = deteksi dengan sinar tampak (setelah disemprot vanilin
asam-sulfat)
A = ekstrak etanol daun sirih merah
B = pembanding eugenol
Fase diam = silika gel GF 354 nm
Fase gerak = toluene : etil asetat (93:7 v/v) Jarak pengembangan = 10 cm
Dari hasil identifikasi minyak atsiri (Tabel III), dapat ditarik kesimpulan bahwa terdapat minyak atsiri dalam ekstrak etanol daun sirih merah. Hal ini dilihat dari adanya kesamaan warna antara bercak sampel dengan bercak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pembanding yaitu bercaknya berwarna biru pada pengamatan dibawah sinar tampak setelah disemprot vanilin-asam sulfat. Kesamaan warna ini dimungkinkan adanya kemiripan struktur antara sampel dengan pembanding sehingga jika disemprot dengan vanilin-asam sulfat dapat berwarna biru. Menurut Wagner, H., Bladt, S., and Zgainski, E.M., (1984) setelah disemprot dengan vanilin-asam sulfat maka bercak akan berwarna biru, hijau, merah, serta coklat dan ini menunjukkan adanya minyak atsiri. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel benar-benar mengandung minyak atsiri. Minyak atsiri yang terdapat didalam ekstrak etanol daun sirih merah diduga minyak atsiri golongan fenol.
Minyak atsiri ekstrak etanol daun sirih merah di duga mempunyai ikatan rangkap yang terkonjugasi atau mempunyai cincin aromatis dan juga mempunyai gugus kromofor karena pada UV 254 nm bercak berwarna kuning kehijauan. Pada UV 254 nm senyawa yang mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi atau gugus kromofor terjadi peredaman bercak dengan latar belakang yang bersinar berwarna hijau karena menggunakan fase diam silika gel GF 254 nm.
c) Identifikasi Flavonoid
Identifikasi flavonoid dengan KLT digunakan fase diam selulosa (polar) dan fase gerak BAW yaitu n-butanol : asam asetat : air (4:1:5 v/v) yang bersifat non polar. Silika gel tidak digunakan sebagai fase diam karena dapat membentuk khelat dengan flavonoid yang akan mengganggu pergerakan senyawa ketika di eluasi. Untuk deteksi adanya bercak digunakan pereaksi semprot Aluminium (III) Klorida (Harbone, 1987). Aluminium (III) Klorida digunakan sebagai pereaksi semprot karena pereaksi ini digunakan untuk mendeteksi senyawa yang memiliki
44
orto dihidroksi seperti flavonoid. Pembanding baku yang digunakan pada analisis kualitatif ini adalah rutin karena menurut Harbone (1987) rutin adalah senyawa glikosida flavonol yang paling umum terdapat dalam tumbuhan. Dalam tumbuhan, biasanya terikat dalam bentuk glikosida, terikat dengan gulanya (Robinson, 1991).
Setelah penotolan dengan pipa kapiler, lempeng KLT kemudian dieluasi didalam tabung yang jenuh akan uap dari fase gerak. Penjenuhan dilakukan dengan menempatkan kertas saring yang dibasahi oleh fase gerak pada dinding tabung. Tujuan penjenuhan tabung eluasi dengan uap dari fase gerak agar perambatan dapat berlangsung cepat dan optimal. Eluasi dilakukan hingga jarak eluasi yang ditentukan (10 cm) tepat terlampaui oleh fase gerak. Jarak 10 cm digunakan karena menyesuaikan dengan panjang lempeng kaca.
Dari hasil KLT didapat harga Rf dan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah dalam tabel IV
Tabel IV. Harga Rf dan warna bercak ekstrak etanol daun sirih merah
Senyawa Harga uji Rf
Vis UV 254 UV 365 Vis UV 254 UV 365
Ekstrak etanol 0,57 Hijau Hijau Merah Hijau Kuning Kuning terang kekuningan kehijauan kemerahan Pembanding 0,57 Kuning Kuning Ungu Kuning Ungu Kuning
rutin terang
Sebelum disemprot Setelah disemprot
AlCl3 AlCl3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Rf Rf Rf 1,00 1,00 1,00 0,90 0,90 0,90 0,80 0,80 0,80 0,70 0,70 0,70 0,60 0,60 0,60 0,50 0,50 0,50 0,40 0,40 0,40 0,30 0,30 0,30 0,20 0,20 0,20 0,10 0,10 0,10 0,00 0,00 0,00 A B A B A B I II III
Gambar 3. Kromatogram ekstrak etanol daun sirih merah pada Identifikasi Flavanoid
Keterangan :
I = deteksi dengan sinar tampak
II = deteksi dengan sinar UV 365 nm
III = deteksi dengan sinar tampak (setelah disemprot AlCl3)
A = ekstrak etanol daun sirih merah
B = pembanding rutin
Fase diam = selulosa
Fase gerak = n-butanol : asam asetat : air (4:1:5 v/v) Jarak pengembangan = 10 cm
Dari hasil identifikasi flavonoid (Tabel IV), diperoleh bercak kromatografi sebanyak 1 buah bercak pemisahan untuk sampel ekstrak etanol daun sirih merah dengan harga Rf sebesar 0,57 dan pembanding rutin memiliki harga Rf 0,57.
46
Dengan demikian diketahui bahwa bercak sampel tersebut merupakan flavonoid karena harga Rf-nya sama dengan pembanding. Hal ini diperkuat dengan warna bercak yang sama dengan warna bercak pembanding setelah disemprot dengan Alumunium (III) Klorida pada pengamatan di bawah lampu UV 254 nm yaitu hijau kekuningan. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel benar-benar mengandung flavonoid. Jenis flavonoid yang terdapat dalam ekstrak etanol daun sirih merah diduga termasuk golongan flavonol.
