BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tatacara Penelitian
4. Identifikasi Kualitatif Kandungan Kimia Ekstrak Etanol
a. Metode Uji Tabung
Uji Alkaloid : Ekstrak (0,5 g) dipanaskan dalam tabung reaksi besar dengan asam klorida 1% (2,5 ml) selama 30 menit dalam penangas air mendidih. Suspensi disaring dengan kapas ke dalam tabung reaksi. Larutan dibagi dua sama banyak, lalu ke dalam larutan tabung-1 ditambah dengan reaksi Dragendorff (3 tetes) dan larutan tabung-2 ditambah pereaksi Mayer (3 tetes). Terbentuknya endapan dengan kedua pereaksi tersebut menunjukkan adanya alkaloid.
Uji Minyak Atsiri : Sebanyak 0,5 g ekstrak ditambahkan 1 ml eter kocok, saring. Filtrat dikering uapkan. Bila sedikit berbau aromatik, larutan residu dengan 3 tetes etanol, uapkan lagi sampai kering. Bila terjadi bau aromatik spesifik, menunjukkan adanya minyak atsiri.
Uji Flavonoid : Ekstrak (0,5 g ) ditambahkan air (2,5 ml), dipanaskan selama 10 menit di atas air mendidih. Larutan disaring melalui kapas. Larutan ditambahkan dengan Besi (III) Klorida (3 tetes), larutan berwarna hijau sampai biru menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
Uji Tanin : Ekstrak etanol (0,5 g) dipanaskan dengan air (2,5 ml) selama 30 menit diatas tangas air. Disaring, filtrat (5 ml) ditambah larutan natrium klorida 2% (1 ml), bila terjadi suspensi atau endapan disaring melalui kertas saring, kemudian filtrat ditambah larutan gelatin 1% (5 ml). Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin.
26
b. Metode Kromatografi Lapis Tipis
Ekstrak etanol daun sirih merah yang digunakan untuk identifikasi Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dibuat dengan melarutkan 0,5 gram ekstrak etanol daun sirih merah dengan Tween 80 (konsentrasi 5%) sebanyak 2 ml.
Identifikasi Alkaloid : Ekstrak ditotolkan pada fase diam silika gel GF 254 nm dengan menggunakan pipa kapiler pada lempeng KLT. Fase gerak tertier butanol : kloroform : dietil amina (2:7:1 v/v), dan pembanding skopolamin. Senyawa dieluasikan sampai batas yang ditentukan yaitu 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi semprot Dragendorff. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding.
Pembuatan standar skopolamin : 5 mg skopolamin dilarutkan dalam 10 ml metanol.
Identifikasi Minyak Atsiri : Ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan silika Gel GF 254 nm dan fase gerak yang digunakan toluena : etil asetat (93:7 v/v). Sebagai pembanding digunakan eugenol. Senyawa dieluasi hingga batas tertentu (10 cm) kemudian dikeringkan. Selanjutnya dilihat pada UV 254 nm dan UV 365 nm. Pereaksi semprot yang digunakan yaitu vanilin-asam sulfat. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding.
Pembuatan standar eugenol : 10 ml eugenol dilarutkan dalam 10 ml toluen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Identifikasi Flavonoid : Ekstrak ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah selulosa, fase gerak n-butanol : asam asetat : air (4:1:5 v/v), dan pembanding rutin. Langkah selanjutnya adalah pengeluasian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi Alumunium (III) Klorida. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga Rf dan warna pembanding.
Pembuatan standar rutin : 10 mg rutin dilarutkan dalam 10 ml metanol.
5. Uji anti fungi
a. Sterilisasi alat-alat dan bahan
Alat-alat seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, pipet volume, ujung mikropipet dan media SDA yang akan digunakan untuk pemeriksaan
aktivitas antifungi disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121˚C dengan tekanan 1
atm selama 15 menit.
b. Pembuatan larutan uji Konsentrasi ekstrak
etanol (%)
Berat ekstrak etanol (g) Pelarut Tween 80 (ml)
60 1,2 2 50 1,0 2 40 0,8 2 30 0,6 2 20 0,4 2
28
Sebagai kontrol positif digunakan Ketokonazol yang dibuat dengan melarutkan 0,1 mg serbuk Ketokonazol dalam 100 ml metil alkohol dan kontrol negatif Tween 80.
c. Pembuatan media SDA
Sebanyak 65 gram SDA dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, ditambahkan dengan 1 Liter aquadestilata. Kemudian ditutup dengan menggunakan kapas, dan
dimasukkan ke dalam autoklaf untuk disterilkan pada suhu 121˚C selama 15
menit dengan tekanan 1 atm.
d. Penyiapan stok Candida albicans
Media SDA yang sudah steril dicairkan kemudian dituang ke dalam tabung reaksi dan dimiringkan, biarkan hingga membeku. Setelah membeku
diambil 1 ose fungi dari pertumbuhan dan diinokulasikan secara streak plate.
Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37°C. Digunakan sebagai
stok.
e. Pengujian potensi anti fungi
Metode Difusi : Pengujian potensi antifungi ekstrak etanol daun sirih
merah dilakukan dengan metode difusi secara paper disk. Satu koloni fungi
Candida albicans dari stok disuspensikan ke dalam media SDA cair,
diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan
dengan standar Mc. Farland II (6.108 CFU/ml) hingga kekeruhannya sama. Dari
suspensi tersebut, diambil 0,1 ml kemudian ditambahkan ke dalam 20 ml media
SDA yang telah memadat dengan cara spread plate, kemudian didiamkan selama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15 menit. Setelah itu, diletakkan paper disk 6 mm pada jarak tertentu diatas cawan petri.
Langkah yang terakhir, hasil pengenceran dari ekstrak etanol daun sirih
merah dan kontrol diteteskan diatas paper disk sebanyak 10 µl. Sebagai kontrol
positif digunakan Ketokonazol dan kontrol negatif digunakan Tween 80, lalu
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37˚C. Diukur diameter zona hambatnya
dengan menggunakan penggaris. Pengulangan pengukuran masing-masing diameter sebanyak 5 kali.
Metode Dilusi Padat : Di ambil 1 ose fungi dari stok fungi, kemudian
disuspensikan ke dalam 5 ml SDA cair campur rata dan inkubasi pada suhu 37˚C
selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan dengan standar Mc. Farland II (6.108
CFU/ml) hingga kekeruhannya sama lalu diambil 0,5 ml. Kemudian 0,5 ml ekstrak etanol daun sirih merah dengan kadar tertentu ditambahkan dalam
suspensi tadi dan dicampur rata dengan 15 ml SDA yang cairkan. Setelah divortex
lalu dituang dalam cawan petri steril secara pour plate dan dibiarkan memadat
lalu diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37˚C. Setelah masa inkubasi,
kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan Candida albicans dalam media
diamati dan diberi penilaian menggunakan notasi (+) untuk media yang tampak keruh. Hal ini berlaku untuk tiap ekstrak etanol daun sirih merah, kontrol negatif (Tween 80) dan kontrol positif (Ketokonazol). Hasil pengamatan dianalisis untuk mendapatkan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) senyawa uji. Setelah
30
plate. Kadar Bunuh Minimum (KBM) ditentukan apabila sudah tidak ada pertumbuhan fungi uji.
