THIDIAZURON PADA BEBERAPA GENOTIPE
KOPI ARABIKA
Abstrak
Perbanyakan Coffea arabica L. menggunakan embriogenesis somatik secara langsung maupun tidak langsung memberikan harapan dalam penyediaan bibit dalam jumlah besar. Penelitian ini bertujuan ; (1) Mempelajari sistem regenerasi kopi Arabika melalui pembentukan embrio somatik secara langsung dan tidak langsung, (2) Mengoptimasi pemberian 2,4-D dan thidiazuron terhadap embriogeneis tidak langung pada beberapa genotipe kopi Arabika, (3) Mempelajari perkembangan embrio somatik kopi Arabika, dan (4) Mengkaji kemungkinan induksi embrio somatik sekunder pada kopi Arabika untuk mendukung usaha perbanyakan klonal yang dihasilkan. Penelitian terdiri dari 4 kegiatan yaitu; (1) Embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron, (2) Optimasi pemberian 2,4-D dan Thidiazuron terhadap embriogenesis somatik tidak langsung pada beberapa genotipe kopi Arabika, (3) Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi, dan (4) Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP pada Media Padat dan Semi Padat. Hasil penelitian menunjukan konsentrasi ZPT mempengaruhi pembentukan embrio, baik pada embriogenesis somatik langsung dan tidak langsung. Varietas dan perlakuan ZPT memberikan pengaruh yang nyata terhadap bobot basah, jumlah torpedo dan kecambah yang dihasilkan namun tidak berpengaruh nyata terhadap persentase pembentukan kalus. Media induksi kalus terbaik yang dapat digunakan untuk perbanyakan tanaman tergantung varietas yang digunakan. Morfologi embrio somatik kopi terlihat normal dimana embrio globular, hati, torpedo, dan kecambah sesuai dengan embriogenesis somatik tanaman dikotil pada umumnya. Persentase dan jumlah embrio somatik sekunder terbanyak dihasilkan dari perlakuan thidiazuron 9.08 µM.
Kata Kunci : Coffea arabica L, embrio somatik sekunder, kalus, morphologi, perbanyakan
--- Catatan: Sebagian dari bab ini telah dipublikasikan pada Indonesian. J.Agrig.Sci. Vol 14.4 No. 2.
4.
INDUCTION OF DIRECT AND INDIRECT SOMATIC
EMBRYOGENESIS USING 2,4-D AND THIDIAZURON
ON SOME GENOTYPES OF ARABICA COFFEE
Abstract
Propagation of Coffea arabica L. through direct or indirect somatic embryogenesis is expected to supply seeds in large quantities. The aims of this study were (1) Observing Arabica coffee regeneration system through direct and indirect somatic embryo formation, (2) Optimizing the application of 2,4-D and Thidiazuron to the indirect embryogenesis of some Arabica coffee genotypes, (3) Examining the development of Arabica coffee somatic embryos, and (4) Assessing the possibility to induce secondary somatic embryos in Arabica coffee to support clonal propagation. This research comprised of four activities: (1) Somatic embryogenesis of Arabica coffee using 2,4-D and Thidiazuron, (2) Optimization of 2,4-D and Thidiazuron application to the indirect somatic embryogenesis in some Arabica coffee genotypes, (3) Morphological development of somatic embryo of coffee, and (4) The induction of secondary somatic embryos using Thidiazuron and BAP in solid and semi-solid media. The results showed the concentrations of plant growth regulator (PGR) significantly affected embryo formation, both in direct and indirect somatic embryogenesis. Varieties and PGR treatments indicated significant effect on fresh weight, number of torpedo and number of germinate embryos, but showed no significant result on callus formation percentage. The best callus induction medium for plant propagation was varied, depended on the varieties. The morphology of coffee somatic embryos was normal indicated by the similar form of globular embryo, heart, torpedo, and germinate as in somatic embryogenesis in other dicotyledonous plants. The highest percentage and number of secondary somatic embryos were generated from Thidiazuron 9.08 µM treatment.
Keywors : Coffea arabica L, secondary somatic embryos, callus, morphology, propagation
--- Note : Section of this chapter has been published in Indonesian. J.Agrig.Sci. Vol 14.4 No. 2. Pages
Pendahuluan
Embriogenesis somatik merupakan salah satu tehnik kultur yang dapat dimanfaatkan untuk perbanyakan tanaman kopi Arabika secara klonal. Penelitian embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan kombinasi ZPT yang berbeda telah dilaporkan oleh banyak peneliti. Neuenschwander dan Baumann (1992) telah berhasil menginduksi embrio dengan menggunakan tiga kombinasi ZPT, yaitu Benzyl Amino Purine (BAP), 2,4-Diklorofenoksiasetat Acid (2,4-D), dan
α-Naphtalene Acetic Acid (NAA). Priyono dan Danimihardja (1991) menggunakan BAP dan kinetin. Priyono (1993) menggunakan Indole Asetic Acid (IAA), BAP dan Adenine sulfat. Giridhar et al. (2004) menggunakan Thidiazuron, sementara Oktavia et al. (2003), Samson et al. (2006), dan Arimarsetiowati (2011) menggunakan 2,4-D dengan 6-(y,y-dimethylallylamino) purine (2-iP). Hasil penelitian memperlihatkan bahwa kemampuan eksplan daun untuk membentuk embrio dalam proses embriogenesis somatik kopi sangat dipengaruhi oleh media, ZPT dan genotipe tanaman.
Embriogenesis somatik pada tanaman kopi dilaporkan dapat melalui embriogenesis langsung (tampa pembentukan kalus) dan embriogenesis tidak langsung (melalui pembentukan kalus). Pembentukan embrio melalui embriogenesis langsung lebih disukai karena dapat menekan masalah sulitnya pembentukan benih somatik pada tahap perkecambahan (Rai & Mccomb 2002), dan dapat menekan terjadinya variasi somaklonal. Kelemahannya jumlah bibit yang dihasilkan biasanya lebih sedikit, dan proses perkembangan embrio biasanya kurang serentak jika dibandingkan dengan embrogenesis tidak langsung. Embriogenesis somatik tidak langsung banyak digunakan untuk perbaikan tanaman dengan metoda variasi somaklonal atau diaplikasikan dengan mutasi dan tranformasi gen.
Peranan ZPT sangat penting dalam menginduksi embriogenesis somatik. Zat pengatur tumbuh yang paling banyak digunakan untuk memacu pembelahan dan elongasi sel adalah dari golongan sitokinin dan auksin (Srivastava 2002). Penelitian Santos-Briones dan Hernández-Sotomayor (2006) serta Samson et al. (2006) memperlihatkan bahwa selain ZPT, kemampuan eksplan daun untuk membentuk embrio dalam proses embriogenesis somatik kopi dipengaruhi oleh genotipe tanaman. Seberapa besar konsentrasi ZPT yang diperlukan pada genotipe tanaman kopi Arabika yang akan digunakan dalam proses perbanyakan tentunya memerlukan penelitian tersendiri untuk mendapatkan hasil yang optimum.
Optimasi media umumnya dilakukan untuk meningkatkan kemampuan media dalam menginduksi pembentukan kalus embriogenik, embrio globular, torpedo dan daya kecambah dari eksplan yang dikulturkan. Optimasi media dilakukan dengan berbagai cara, diantaranya memberikan variasi konsentrasi 2,4-D dan Thidiazuron yang ditambahkan dalam media kultur pada beberapa genotipe tanaman. Embriogenesis somatik tanaman juga dapat dioptimasi dengan memanfaatkan pembentukan embrio sekunder. Embrio somatik sekunder adalah pembentukan embrio somatik dari embrio somatik primer. Beberapa keuntungan menggunakan embrio somatik sekunder adalah ; ketersedian eksplan steril yang dapat langsung digunakan untuk perbanyakan, proses penyediaan eksplan bisa lebih cepat karena tidak perlu menginduksi embrio somatik dari luar, dan dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman hasil mutasi maupun hasil transformasi genetik.
Pembentukan embrio somatik sekunder berkelanjutan dari embrio somatik primer pada kopi dapat dimanfaatkan untuk tujuan perbanyakan tanaman klonal dan pemuliaan tanaman terutama dengan metoda rekayasa genetik (Fernández-Da et al. 2005). Secara umum penelitian pembentukan embrio somatik sekunder yang mengikuti proses embrio somatik primer pada kopi Arabika tidak banyak dilaporkan.
Keberhasilan regenerasi melalui embriogenesis somatik dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain formulasi media yang berbeda pada setiap tahap perkembangan embrio somatik, jenis eksplan yang digunakan, kombinasi dan konsentrasi ZPT, dan genotipe tanaman. Penelitian ini bertujuan ; (1) Mempelajari sistem regenerasi kopi Arabika melalui pembentukan embrio somatik secara langsung dan tidak langsung, (2) Mengoptimasi pemberian 2,4-D dan Thidiazuron terhadap embriogeneis tidak langung pada beberapa genotipe kopi Arabika, (3) Mempelajari perkembangan embrio somatik kopi Arabika, dan (4) Mengkaji kemungkinan induksi embrio somatik sekunder pada kopi Arabika untuk mendukung usaha perbanyakan klonal yang dihasilkan.
Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan tanaman dan rumah kaca, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, dari Juni 2012 sampai April 2015. Penelitian ini terdiri dari empat tahapan kegiatan yaitu; (1) Embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron, (2) Optimasi 2,4-D dan Thidiazuron pada beberapa genotipe kopi Arabika, (3) Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi Arabika, dan (4) Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP.
1. Embriogenesis Somatik Kopi Arabika Menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron - Induksi Kalus
Medium dasar yang digunakan untuk induksi kalus adalah 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro MS (Murashige and Skoog) yang dilengkapi dengan vitamin B5, sukrosa 30 g L-1, dan 250 mg L-1 Poliviynil polipyrolidon (PVPP). Sebagai bahan pemadat ditambahkan phytagel 2.5 g L-1. Perlakuan yang diuji yaitu; (1) 2,4-D 2.26 µM + thidiazuron 4.54 µM, (2) 2,4-D 2.26 µM + thidiazuron 9.08 µM, (3) 2,4-D 4.52 µM + thidiazuron 4.54 µM, (4) 2,4-D 4.52 µM + thidiazuron 9.08 µM, dan (5) 2,4-D 9.04 µM + thidiazuron 9.08 µM. Media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 20 menit dengan tekanan 1.5 atm.
Eksplan berupa daun muda diambil dari tanaman kopi Arabika varietas Kartika yang telah ditumbuhkan di rumah kaca. Daun dibersihkan dengan air mengalir selama 10 menit, disterilisasi menggunakan larutan 0.2% Dithane M-45 dan Agrimicin 0.1 % selama 30 menit, lalu dibilas sampai bersih. Di laminar air flow, daun direndam dalam alkohol 50% selama 5 menit dilanjutkan dengan Calsium hipoklorit 10% selama 10 menit.
Daun yang telah steril dibilas sampai bersih dengan air steril sebanyak 3 kali, dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, dan ditanam dalam media induksi kalus. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada temperatur ± 25oC dan kelembaban relatif ± 60%.
Satu bulan dimedia induksi kalus, eksplan yang membentuk kalus dipindahkan ke media induksi kalus lanjutan yang mengandung 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 (yang dimodifikasi), sukrosa 30 g L-1, Phytagel 2.5 g L-1, dan penambahan zat pengatur tumbuh 2,4-D 4.50 µM dan BAP 17.75 µM (Etienne 2005). Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 5 potongan daun. Peubah yang diamati meliputi persentase pembentukan kalus dan berat kalus yang terbentuk.
- Induksi Embrio Somatik
Kalus embriogenik yang telah terbentuk dipindahkan ke media 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 (yang dimodifikasi), sukrosa 30 g L-1, phytagel 2.5 g L-1 dengan penambahan zat pengatur tumbuh kinetin 9.30 µM. Kultur diinkubasi dalam ruangan gelap yang bersuhu 25 °C. Perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 100 mg kalus. Masing-masing perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5.000 mg kalus. Peubah yang diukur adalah persen kalus yang membentuk embrio somatik.
- Pengecambahan Embrio Somatik dan Regenerasi Tanaman
Embrio fase torpedo dipindahkan ke medium perkecambahan yang mengandung 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 (yg dimodifikasi), sukrosa 40 g L-1. Perkecambahan embrio dilakukan dalam penyinaran selama 16 jam, dengan intensitas cahaya 1.000-1.500 luks pada suhu 25 oC dengan kelembaban relatif ± 60%. Percobaan dilakukan dengan 10 ulangan. Peubah yang diamati jumlah kecambah yang terbentuk.
- Analisis Data
Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap. Jika terdapat perbedaan yang nyata dari nilai rata-rata perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan mengunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5 α = 0.05.
2. Optimasi 2,4-D dan Thidiazuron pada Beberapa Genotipe Kopi Arabika Penelitian tahap ke dua ini dilakukan untuk mengoptimasi kegiatan yang telah dilakukan pada tahap pertama. Optimasi yang dilakukan dengan mengembangkan konsentrasi ZPT Thidiazuron yang digunakan untuk menginduksi kalus embriogenik dan menambah genotipe tanaman kopi Arabika yang digunakan. Genotipe kopi Arabika yang digunakan adalah varietas Kartika, AS2K, Sigarar Utang dan S 795.
Daun muda diambil dan dibersihkan dengan air mengalir. Daun disterilisasi menggunakan larutan 0.2% Dithane M-45 dan Agrimicin 0.1 % selama 30 menit, lalu dibilas sampai bersih. Daun disterilisasi dalam alkohol 50% selama 5 menit dilanjutkan dengan Calsium hipoklorit 10% selama 10 menit.
Daun yang telah steril dibilas sampai bersih menggunakan air steril sebanyak 3 kali. Daun dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, dan ditanam dalam media induksi kalus. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada temperatur ± 25oC dan kelembaban relatif ± 60%.
Medium dasar yang digunakan untuk induksi kalus adalah 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro MS (Murashige and Skoog) yang dilengkapi dengan vitamin B5, sukrosa 30 g L-1, dan 250 mg L-1, Poliviynil polipyrolidon (PVPP), dan kemudian ditambahkan phytagel 2.5 g L-1. Kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D dan Thidiazuron yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D danThidiazuron
Perlakuan 2,4-D Thidiazuron 1 4.5β μM 4.54 μM 2 4.5β μM 9.08 μM 3 4.5β μM 13.62 μM 4 4.5β μM 18.16 μM 5 4.5β μM 22.70 μM 6 9.04 μM 4.54 μM 7 9.04 μM 9.08 μM 8 9.04 μM 13.62 μM 9 9.04 μM 18.16 μM 10 9.04 μM 22.70 μM
Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 5 potongan daun. Peubah yang diamati meliputi persentase pembentukan kalus dan bobot basah kalus yang terbentuk. Media induksi kalus lanjutan, induksi embrio somatik, regenerasi dan perkecambahan yang digunakan sama dengan media yang digunakan pada tahap pertama. Pada induksi embrio somatik perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 200 mg kalus, sehingga untuk masing- masing perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5.000 mg kalus. Peubah yang diukur adalah persen kalus yang membentuk embrio somatik. Perkecambahan embrio dilakukan dengan sepuluh ulangan. Peubah yang diamati jumlah kecambah yang terbentuk.
- Analisis Data
Data yang diperoleh akan diuji secara statistik dengan metode 2 faktor untuk mencari nilai anova atau sidik ragamnya. Jika terdapat perbedaan yang nyata akan dilakukan uji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5%.
3. Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi Arabika
Perkembangan embrio somatik kopi Arabika dari mulai pembentukan kalus, embrio globular sampai planlet diamati dengan menggunakan mikroskop AxioVision type Zeiss. Mikroskop dihubungkan dengan komputer dengan program AxioVision Release 4.82.
4. Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP Eksplan yang digunakan untuk menginduksi embrio somatik sekunder adalah embrio somatik primer fase torpedo kopi Arabika dari varietas yang paling respon dalam membentuk embrio somatik primer. Media MS padat dan semi padat yang dimodifikasi (Etienne 2005) ditambahkan thidiazuron (4.54 µM dan 9.08 µM ), dan sebagai kontrol digunakan media perkecambahan (BAP 1.33 µM). Eksplan yang membentuk embrio somatik sekunder disub kultur ke media pendewasaan. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap dengan suhu ± 25 oC sampai terbentuk embrio somatik sekunder.
Rancangan percobaan menggunakan acak lengkap faktorial, faktor pertama adalah ZPT dan yang kedua adalah kepadatan media. Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 10 embrio fase kotiledonari. Peubah yang diamati meliputi: persentase pembentukan embrio somatik sekunder dan jumlah embrio somatik sekunder yang dihasilkan.
Hasil dan Pembahasan
1.Embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron Daun kopi Arabika varietas Kartika mulai membentuk kalus setelah 3 minggu dalam media perlakuan. Kalus muncul dari luka bekas potongan (Gambar 9). Hasil analisis statistik bobot basah eksplan satu bulan setelah tanam dapat dilihat pada Gambar 10. Peningkatan konsentrasi ZPT 2,4-D dan Thidiazuron dapat menambah bobot basah eksplan, dengan bobot basah tertinggi pada perlakuan 2,4-D 9.04 µM + Thidiazuron 9.08 µM (Gambar 10). Penggunaan 2,4-D yang dikombinasikan dengan Kinetin atau 2,4-D dengan BAP juga memperlihatkan pola yang sama, dimana penambahan 2,4-D sampai 0.94 µM dapat meningkatkan bobot kalus (Ibrahim et al. 2012; Ibrahim et al. 2013). Menurut Raghavan (1986) ini dikarenakan auksin dapat meningkatkan kuantitas sel-sel embriogenik dengan cara memacu pembelahan sel untuk membentuk massa pro embriogenik, serta mencegah inisiasi pertumbuhan yang teratur pada sel-sel tersebut.
Gambar 9. Keragaan kalus kopi Arabika varietas Kartika. (A). Pada media induksi kalus (2,4-D 9.04 µM + Thidiazuron 9.08 µM) 1 bulan setelah tanam. (B). Kalus embriogenik pada media induksi kalus lanjutan
Gambar 10. Rataan pertambahan bobot basah eksplan kopi Arabika setelah dikulturkan selama 1 bulan di dalam media induksi kalus awal. Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan (α = 0.05)
Persentase pembentukan kalus 3 bulan dalam media induksi kalus lanjutan terlihat bervariasi. Berat terendah pada konsentrasi 2,4-D 2.26 µM yang dikombinasikan dengan thidiazuron 4.54 atau 9.08 µM (Gambar 11). Secara morfologi proses pengkalusan tidak terjadi dan jika ada terlihat tidak embriogenik. Pada bekas potongan daun apabila diamati dibawah mikroskop justru terlihat adanya pro embrio dengan warna kekuningan. Hal ini berbeda dengan perlakuan 2,4-D 4.52 µM yang ditambahkan Thidiazuron 4.54 dan 9.08 µM, serta 2,4-D 9.04 µM + Thidiazuron 9.08 µM justru memperlihatkan proses pengkalusan yang nyata. Kalus non embriogenik kopi Arabika juga dilaporkan oleh Gatica et al. (2008). Penelitian Gatica et al. (2008) mendapatkan frekwensi kalus yang rendah dengan struktur kompak dalam menginduksi embriogenesis somatik kopi Arabica cv.Catura dan Catuai.
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa morphogenesis pembentukan kalus kopi sangat tergantung pada rasio auksin dan sitokinin yang ditambahkan dalam media induksi kalus. Umumnya pembentukan kalus ditemukan apabila konsentrasi auksin dan sitokinin diberikan dalam konsentrasi tinggi (George & Sherrington 1984; Tores 1989). Pemberian Auksin sangat diperlukan dalam embriogenesis somatik karena berkaitan dengan proses asidifikasi sitoplasma dan dinding sel tanaman (Kutschera 1994).
Adanya perbedaan respon eksplan dalam menghasilkan kalus dan pro embrio menandakan bahwa pada perlakuan 2,4-D 2.26 µM yang dikombinasikan dengan thidiazuron 4.54 atau 9.08 µM merupakan jalur embriogenesis somatik langsung sementara pada perlakuan lainnya melalui jalur embriogenesis tidak langsung. Kalus embriogenik yang muncul dari embriogenesis somatik tidak langsung berwarna kekuningan. Kalus terlihat muncul dari luka bekas potongan daun kopi Arabika dan bertambah banyak seiring dengan bertambahnya waktu (Gambar 9B). Menurut Williams dan Maheswaran (1986) karekteristik kalus embriogenik berwarna kekuningan, sitoplasma yang lebih padat, inti sel yang besar, dan vakuola yang banyak mengandung pati.
Gambar 11. Rataan persentase eksplan kopi Arabika membentuk kalus dalam media induksi kalus lanjutan 4 bulan setelah kultur. Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan (α = 0.05)
Perbedaan respon perkembangan eksplan menjadikan metoda yang ditempuh agak berbeda. Pada eksplan yang membentuk kalus, kalus embriogenik yang terbentuk ditimbang seberat 100 mg L-1, lalu di subkultur ke media induksi embrio somatik. Sementara eksplan tidak membentuk kalus tetapi langsung menghasilkan pro embrio juga disubkultur ke media yang sama tanpa dilakukan penimbangan.
Pada proses embriogenesis tidak langsung, dua bulan dalam media pendewasaan, kalus berubah warna dari kuning menjadi kuning kecoklatan. Pengamatan dibawah mikroskop di bulan ketiga, dari kalus yang berwarna kuning kecoklatan muncul pro embrio, yang dibulan keempat berkembang menjadi embrio globular. Dibulan ke lima dan enam, globular mengalami pemanjangan dan pada bulan ke delapan torpedo sudah terbentuk sempurna dan akan memasuki tahap kotiledonari. Perkembangan embriogenesis tidak langsung kopi Arabika varietas Kartika dari fase globular sampai kotiledonari dapat dilihat pada Gambar 12.
Perkembangan pro embrio menjadi embrio globular pada embriogenesis somatik langsung terlihat setelah dua bulan dalam media regenerasi. Perkembangan embriogenesis somatik langsung terlihat tidak serentak, dimana embrio globular, hati, pemanjangan embrio dan torpedo dapat dijumpai pada saat yang besamaan dalam media yang sama (Gambar 13). Fenomena ini juga dijumpai pada penelitian Gatica et al. (2008) dan Oktavia et al. (2003) ketika menginduksi embriogenesis somatik langsung Coffea arabica dengan ZPT yang berbeda. Ketidak serentakan perkembangan embrio ini terkadang menyebabkan embriogenesis langsung jarang digunakan dalam proses mutasi dan perbanyakan tanaman.
Gambar 12. Keragaan perkembangan embriogenesis tidak langsung kopi Arabika
varietas Kartika. (A). Embrio globular. (B). Torpedo. (C). Kotiledonari.
Gambar 13. Keragaan perkembangan embriogenesis somatik langsung kopi Arabika varietas Kartika. (A). Pro embrio dan Globular tumbuh dan berkembang dari jaringan daun. (B). Globular [G (Panah merah)], Heart [H (Panah hitam)], Elongated embryo [EG (Panah hijau)] and torpedo [T (Panah biru)].
Gambar 14. A. Rataan jumlah embrio globular kopi Arabika varietas Kartika melalui jalur embriogenesis tidak langsung setelah 4 bulan dalam media regenerasi. B. Rataan jumlah torpedo kopi Arabika melalui jalur embriogenesis tidak langsung setelah enam bulan dalam media regenerasi. Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan α= 0.05. A B C A B EG T H G A B
Gambar 15. Rataan jumlah kecambah kopi Arabika varietas Kartika melalui jalur embriogenesis tidak langsung setelah sepuluh bulan dalam media regenerasi. Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan α= 0.05.
Gambar 16. A. Rataan jumlah embrio globular kopi Arabika varietas Kartika melalui jalur embriogenesis langsung setelah 3 bulan dalam media regenerasi. B. Rataan jumlah globular dan torpedo kopi Arabika melalui jalur embriogenesis langsung setelah 6 bulan dalam media regenerasi. Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan α= 0.05.
A
Gambar 17. Rataan jumlah torpedo, kecambah dan planlet kopi Arabika melalui jalur embriogenesis langsung setelah 9 bulan dalam media regenerasi. Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji Duncan α= 0.05.
Hasil analisis statistik terhadap rataan jumlah globular, torpedo dan kecambah yang dihasilkan dari embriogenesis somatik tidak langsung berbeda nyata antar pelakuan yang diuji. Jumlah embrio globular, torpedo dan kecambah yang tertinggi berasal dari media perlakuan induksi kalus 2,4-D 9.00 µM + thidiazuron 9.10 µM dan terendah pada 2,4-D 4.52 µM + thidiazuron 4.54 µM (Gambar 14 dan 15). Hal ini diduga karena adanya interaksi antara auksin (2,4-D) dan sitokinin (thidiazuron) yang ditambahkan ke dalam media perlakuan. Kebutuhan auksin atau sitokinin untuk inisiasi embriogenesis somatik sangat besar peranannya dalam tahap perkembangan dari jaringan eksplan kopi. Salah satu mekanismenya, auksin dapat mengatur embriogenesis melalui asidifikasi pada sitoplasma dan dinding sel (Kutshera 1994).
Hasil pengamatan terhadap perkembangan embrio globular, torpedo dan kecambah yang dihasilkan dari jalur embriogenesis somatik langsung terlihat lebih cepat dibandingkan dengan embriogenesis tidak langsung. Akan tetapi jumlah embrio globular, torpedo dan kecambah yang dihasilkan lebih sedikit. Jumlah embrio globular, torpedo dan kecambah pada perlakuan 2,4-D 2.26 µM + thidiazuron 9.08 µM selalu lebih tinggi dibandingkan 2,4-D 2.26 µM + thidiazuron 4.54 µM. (Gambar 16 dan 17). Hasil ini mengindikasikan penambahan thidiazuron dapat meningkatkan jumlah embrio globular, torpedo dan kecambah yang diperoleh.
Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa embriogenesis somatik langsung dan tidak langsung pada kopi Arabika bisa didapatkan dengan meningkatkan atau menurunkan konsentrasi ZPT tumbuh yang digunakan. Penambahan konsentrasi auksin (2,4-D) dan sitokinin (Thidiazuron) dalam media induksi kalus berperan penting dalam mempengaruhi perkembangan embriogenesis somatik kopi Arabika. Jika bandingkan dengan penelitian di BAB sebelumnya dimana induksi kalus menggunakan auksin (2,4-D) dan sitokinin (BAP), hasil yang didapatkan pada penelitian ini lebih baik, karena dapat meningkatkan persentase jumlah kecambah yang dihasilkan.
2. Optimasi 2,4-D dan Thidiazuron pada beberapa genotipe kopi Arabika Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa dari semua varietas yang diuji memperlihatkan bahwa keberhasilan eksplan membentuk kalus kopi Arabika cukup tinggi (diatas 80%). Bagi tanaman tahunan yang banyak mengandung fenol seperti kopi Arabika, keberhasilan ini merupakan hal yang menjanjikan mengingat embriogenesis tidak langsung sangat tergantung pada jumlah kalus yang dihasilkan.
Varietas yang diuji tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap persentase pembentukan kalus, namun memberikan pengaruh yang nyata untuk bobot basah kultur jumlah torpedo dan kecambah yang dihasilkan (Tabel 2). Varietas AS2K memberikan respon terbaik jika dibandingkan dengan S 795, Kartika, dan Sigarar Utang. Hasil penelitian memperlihatkan respon varietas terhadap kebutuhan media untuk induksi embriogenesis somatik berbeda. Hal ini