HASIL DAN PEMBAHASAN
PRE-INKUBASI KOJI
Pengaruh pre-inkubasi terhadap kadar formol nitrogen dan total nitrogen terlarut
Pengaruh kadar garam dan lama waktu pre-inkubasi koji pada suhu 53-55oC terhadap kadar formol nitrogen (FN), total nitrogen terlarut (TN) dan rasio FN/TN koji disajikan pada Gambar -5, 6 dan 7, sedangkan data lengkapnya diberikan pada Lampiran-1. Dari Gambar -5 tampak bahwa formol nitrogen yang terbentuk pada koji pre-inkubasi tanpa garam lebih tinggi daripada dengan 10% garam. Pembentukan formol nitrogen pada koji pre -inkubasi tanpa garam meningkat tajam hingga sampai dengan 12 jam (0,176%). Selanjutnya hingga 24 jam pre-inkubasi koji, pembentukan formol nitrogen melambat walaupun kadarnya (0,181%) berbeda nyata dengan kadar formol nitrogen pada jam ke-12 (á = 0,05). Wakt u (jam) F o rm o l N ( % ) 24 18 12 6 0 0,175 0,150 0,125 0,100 0,075 0,050 24 18 12 6 0 0 1 0
Gambar -5. Pengaruh kadar NaCl dan lama waktu pr e- inkubasi koji terhadap kadar formol nitrogen. Angka pada bagian panel menunjukkan kadar NaCl (%).
Pola yang sama terjadi pada pre-inkubasi koji dengan 10% garam, namun kadar formol nitrogen yang terbentuk lebih rendah. Pada 12 jam pertama pre-inkubasi, formol nitrogen yang terbentuk sebanyak 0,144%, sedangkan pa da jam ke-24 sebanyak 0,167%. Pada kedua pre-inkubasi tersebut, setelah 12 jam inkubasi pembentukan formol nitrogen melambat. Hal ini kemungkinan disebabkan karena pengaruh suhu yang relatif tinggi (53-55oC) pada tahap
pre-32
inkubasi koji yang menyebabkan turunnya aktivitas enzim protease Aspergillus
oryzae. Seperti dilaporkan oleh beberapa peneliti, pada suhu 55oC enzim protease
tidak stabil (Su et al. 2005) – walaupun suhu tersebut merupakan suhu optimumnya (Kundu & Manna 1975). Su et al. (2005) melaporkan bahwa pada suhu 55oC, inkubasi selama 240 menit mengakibatkan aktivitas protease menurun hingga tinggal 17%. Sedangkan rendahnya kadar formol nitrogen pada pre-inkubasi koji dengan 10% garam kemungkinan disebabkan karena enzim peptidase terhambat aktivitasnya oleh garam. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Su et al. (2005) yang menyebutkan bahwa pada konsentrasi garam (NaCl) 5%, aktivitas enzim protease Aspergillus oryzae tinggal sebesar 38%, sedangkan pada kadar garam 10% dan 14%, aktivitas enzim protease berturut-turut tinggal sebesar 17% dan 10%. Dalam penelitian ini dilakukan pre-inkubasi pada kadar garam 10% oleh karena kadar garam 10% dapat mengurangi kontaminasi mikroba (Hamada et al. 1989). Hal ini dapat dilihat pada profil jumlah mikroba mesofilik (angka lempeng total) seperti ditampilkan dalam Gambar-10. Peningkatan kadar formol nitrogen berarti peningkatan gugus amino terminal dari asam-asam amino, peptida rantai pendek ataupun amonia yang disebabkan karena penguraian protein dari bahan baku kedelai dan gandum oleh enzim protease yang dihasilkan kapang A sojae selama fermentasi koji (Fukushima 1982, Yokotsuka 1985, Roling et al. 1994b, Kobayashi & Hayashi 1998).
Gambar-6 memperlihatkan pembentukan total nitrogen terlarut selama pre-inkubasi koji. Dari Gambar tersebut terlihat bahwa hingga pada jam ke -24, pembentukan total nitrogen terlarut masih terus meningkat hingga diperoleh total nitrogen terlarut sebesar 0,88% pada pre-inkubasi tanpa garam dan 0,87% pada pre-inkubasi dengan 10% garam. Walaupun terjadi peningkatan terus, namun kadar total nitrogen terlarut pada jam ke-6 hingga jam ke -24 tidak berbeda nyata (á = 0,05). Hal ini terjadi baik pada pre-inkubasi tanpa garam maupun 10% garam. Pembentukan total nitrogen terlarut pada koji pre-inkubasi tanpa garam jam ke-24 (0,88%) tidak berbeda nyata (á = 0,05) dengan pembentukan total nitrogen terlarut pada pre-inkubasi dengan 10% garam selama 24 jam (0,87%).
33
Hal ini kemungkinan disebabkan karena enzim proteinase yang memecah molekul protein menjadi peptida relatif stabil pada kadar garam 10%.
Wakt u (jam ) T o ta l N ( % ) 24 18 12 6 0 0,90 0,85 0,80 0,75 0,70 24 18 12 6 0 0 10
Gambar -6. Pengaruh kadar NaCl dan lama waktu pre- inkubasi koji terhadap kadar total nitrogen terlarut . Angka pada bagian panel menunjukkan kadar NaCl (%).
Dari hasil penelitian ini (Gambar-5 dan 6) diduga enzim peptidase yang menguraikan peptida menjadi asam amino kurang stabil pada garam 10% dibandingkan enzim proteinase yang menguraikan protein menjadi peptida. Oleh karena itu, rasio formol nitrogen dan total nitrogen terlarut (rasio FN/TN) pada koji pre -inkubasi tanpa garam lebih tinggi daripada dengan 10% garam, seperti ditampilkan dalam Gambar-7. Rasio antara formol nitrogen dengan total nitrogen terlarut menunjukkan seberapa besar protein diurai oleh enzim protease (Fukushima 1982). Waktu ( jam) R a s io F N /T N 24 18 12 6 0 0,22 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 24 18 12 6 0 0 1 0
Gambar -7. Pengaruh kadar NaCl dan lama waktu pre- inkubasi koji terhadap rasio formol nitrogen dan total nitrogen terlarut (rasio FN/TN). Angka pada bagian panel menunjukkan kadar NaCl (%).
34
Bertambahnya waktu pre-inkubasi secara umum akan menaikkan kadar formol nitrogen, total nitrogen terlarut dan rasio FN/TN baik pada pre-inkubasi tanpa garam maupun dengan 10% garam. Dari Gambar-5 dapat diamati bahwa pada koji pre-inkubasi tanpa garam kadar formol nitrogen meningkat dari 0,057% (0 jam) menjadi 0,181% setelah 24 jam inkubasi. Sedangkan pada koji pre-inkubasi dengan 10% garam, kadar formol nitrogen meningkat menjadi 0,167% setelah 24 jam pre-inkubasi. Kadar formol nitrogen dan total nitrogen terlarut paling tinggi dicapai pada pre-inkubasi koji tanpa garam (0% NaCl) selama 24 jam, yaitu sebesar 0,181% dan 0,88%. Sedangkan rasio FN/TN paling tinggi dicapai pada pre-inkubasi koji tanpa garam selama 12 jam, yaitu sebesar 0,215 (Gambar-7). Berbeda dengan koji pre-inkubasi dengan 10% garam, perpanjangan waktu pre-inkubasi hingga 24 jam pada koji pre-inkubasi 0% garam garam tidak menaikkan kadar formol nitrogen secara drastis, yang artinya tidak terjadi kenaikan rasio FN/TN. Hal ini kemungkinan karena adanya penurunan akitivitas enzim peptidase akibat penurunan pH yang drastis yang terjadi pada koji tersebut (Gambar-9). Hal ini sesuai dengan pernyataan Nakadai (1977) dalam Fukushima (1982) yang menyatakan bahwa proteinase basa (alkaline proteinase) dan
semi-alkaline proteinase akan menurun aktivitasnya pada pH rendah. Kemungkinan
lain adalah adanya penurunan aktivitas enzim peptidase karena tidak stabil pada suhu 53-55oC (Kundu & Manna 1975, Su et al. 2005).
Pengaruh pre-inkubasi terhadap kadar gula pereduksi
Pengaruh pre-inkubasi koji terhadap kadar gula pereduksi dapat dilihat pada Gambar-8 dan data lengkapnya disajikan pada Lampira n-2. Dari Gambar tersebut tampak terjadi penurunan kadar gula pereduksi selama pre-inkubasi koji, baik pada inkubasi tanpa garam maupun dengan 10% garam. Pada pre-inkubasi koji tanpa garam, kadar gula pereduksi turun dari 2,38% menjadi 0,21% selama 24 jam. Sedangkan pada pre-inkubasi koji dengan 10% garam, turun dari 2,35% menjadi 0,45%. Turunnya kadar gula pereduksi ini kemungkinan disebabkan karena gula pereduksi yang telah terbentuk saat fermentasi koji berlangsung digunakan oleh mikroba – termasuk bakteri asam laktat – untuk pertumbuhannya. Hal ini didukung oleh data yang ditampilkan pada Gambar-10
35
yang memperlihatkan pertambahan angka lempeng total dan pertumbuhan bakteri asam laktat selama pre-inkubasi. Kemungkinan lainnya adalah adanya penurunan aktivitas amilase selama pre-inkubasi. Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Su
et al. (2005) yang menyatakan bahwa pada suhu 55oC, inkubasi selama 240 menit
akan menurunkan aktivitas enzim amilase hingga tinggal 47%. Akibat dari kedua hal tersebut adala h kadar gula pereduksi yang dibentuk selama pre-inkubasi koji lebih rendah daripada yang dikonsumsi oleh mikroba.
Wakt u (j am ) G u la P e re d u k s i ( % ) 24 18 12 6 0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 24 18 12 6 0 0 1 0
Gambar -8. Pengaruh kadar NaCl dan lama waktu pre-inkubasi koji terhadap kadar gula pereduksi. Angka pada bagian panel menunjukkan kadar NaCl (%).
Jika dibandingkan pada lama waktu pre-inkubasi yang sama, gula pereduksi yang terbentuk pada pre-inkubasi koji dengan 10% NaCl lebih rendah daripada gula pereduksi yang terbentuk pada pre-inkubasi koji tanpa garam. Kadar gula pereduksi pada moromi hasil pre -inkubasi dengan 10% NaCl selama 6, 12 dan 24 jam berturut-turut sebesar 1,23%, 0,67% dan 0,45%. Sedangkan kadar gula pereduksi pada moromi hasil pre-inkubasi tanpa garam yang berlangsung selama 6, 12 dan 24 jam berturut-turut sebesar 1,53%, 0,72% dan 0,56%. Rendahnya kadar gula pereduksi pada moromi hasil pre-inkubasi koji dengan 10% garam jika dibandingkan dengan pre-inkubasi tanpa garam disebabkan karena enzim amilase berkurang aktivitasnya pada 10% garam. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Su et al. (2005) yang menyatakan bahwa pada kadar garam 10%, aktivitas enzim amilase turun menjadi 87% .
36
Pengaruh pre-inkubasi terhadap pH
Hubungan antara kondisi pre-inkubasi koji dan pH koji hasil pre-inkubasi yang dihasilkan disajikan pada Gambar-9 dan data lengkapnya diberikan pada Lampiran-3. Bertambahnya waktu pre-inkubasi menurunkan pH baik pada koji pre-inkubasi tanpa garam maupun dengan 10% garam. Dari Gambar tersebut tampak bahwa pada koji pre-inkubasi tanpa garam selama 12 jam hingga 24 jam, pH koji turun sangat tajam hingga dibawah 5,0. Sementara itu, pada koji pre-inkubasi 10% garam, tidak terjadi penurunan pH hingga dibawah 5,0. Penurunan pH ini kemungkinan karena meningkatnya populasi bakteri asam laktat (Gambar-10) yang menghasilkan asam organik. Seperti dilaporkan oleh Noda et al. (1982), asam organik akan menurunkan pH moromi.
Wakt u (j am) p H 24 18 12 6 0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 24 18 12 6 0 0 1 0
Gambar -9. Pengaruh kadar NaCl dan lama waktu pre- inkubasi koji terhadap pH. Angka pada bagian panel menunjukkan kadar NaCl (%)
Jika dibandingkan pada lama waktu pre-inkubasi yang sama, maka pH koji pre-inkubasi dengan 10% NaCl lebih tinggi daripada pH koji pre-inkubasi tanpa garam. Nilai pH koji pre-inkubasi dengan 10% NaCl selama 6, 12 dan 24 jam berturut-turut adalah 6,10; 5,90 dan 5,83. Sedangkan pH koji pre-inkubasi tanpa garam yang berlangsung selama 6, 12 dan 24 jam berturut-turut adalah 5,34; 4,17 dan 3,93. Pada koji pre-inkubasi dengan kadar garam 10%, bakteri asam laktat pembentuk senyawa asam organik terhambat pertumbuhannya oleh garam sebesar 10% teseebut (Hamada et al. 1989), seperti diperlihatkan pada Gambar-10. Dari Gambar-10, secara umum dapat dikatakan bahwa jumlah
37
bakteri asam laktat pada pre-inkubasi dengan 10% garam lebih rendah daripada pre-inkubasi tanpa garam.
Pengaruh pre-inkubasi terhadap komposisi mikroba
Komposisi mikroba – yang meliputi angka lempeng total (ALT) , jumlah koloni bakteri asam laktat dan jumlah koloni khamir – pada koji pre-inkubasi disajikan pada Gambar-10, sedangkan data lengkap diberikan pada Lampiran-4. Dari Gambar -10 tampak bahwa angka lempeng total pada koji pre-inkubasi tanpa garam meningkat drastis seiring dengan bertambahnya waktu pre-inkubasi. Pada jam ke-0, angka lempeng total sebesar 4,3x106 koloni/ml, sementara setelah 24 jam pre -inkubasi angka lempeng total berjumlah 9,8x108 koloni/ml. Pada koji pre-inkubasi dengan 10% garam tidak terjadi peningkatan jumlah mikroba mesofilik yang berarti. Dari Gambar tersebut tampak bahwa jumlah mikroba mesofilik pada koji pre-inkubasi dengan 10% garam lebih rendah daripada tanpa garam. Hal ini kemungkinan disebabkan karena garam 10% menghambat pertumbuhan mikroba kontaminan (Kobayashi & Hayashi 1998).
A B
Gambar -10. Perubahan angka lempeng total ( ), jumlah bakteri asam laktat ( ) dan jumlah khamir ( ) selama pre-inkubasi koji tanpa garam (A) dan dengan 10% garam (B).
Gambar-10 memperlihatkan jumlah bakteri asam laktat pada pre-inkubasi koji tanpa garam meningkat dari 3,4x102 koloni/ml pada jam ke-0 menjadi 8,7x104 koloni/ml pada jam ke-24. Baik pada koji pre-inkubasi tanpa garam
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 5 10 15 20 25
Lama waktu pre-inkubasi (jam)
Jumlah koloni (Log kol/ml)
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 5 10 15 20 25
Lama waktu pre-inkubasi (jam)
38
maupun dengan 10% garam, jumlah bakteri asam laktat bertambah seiring dengan bertambahnya waktu pre-inkubasi koji. Jika dibandingkan pada lama waktu pre-inkubasi yang sama, jumlah bakteri asam laktat pada koji pre-inkubasi dengan 10% garam lebih rendah daripada jumlah bakteri asam laktat pada koji pre-inkubasi tanpa garam. Hasil penelitian ini sama seperti yang diindikasikan oleh Hamada et al. (1989) yang menyatakan bahwa kadar garam 10% menghambat pertumbuhan mikroba kontaminan. Namun, seperti dikatakan oleh Kobayashi dan Hayashi (1998), pada moromi dengan kadar garam 10%, bakteri asam laktat masih dapat tumbuh.
Gambar-10 tersebut diatas juga memperlihatkan jumlah khamir pada pre-inkubasi koji tanpa garam turun dari 1,2x102 koloni/ml menjadi 7,0x101 koloni/ml setelah 24 jam inkubasi. Penurunan jumlah khamir setelah pre-inkubasi tanpa garam berjalan lebih dari 12 jam kemungkinan karena turunnya pH koji pre-inkubasi, dimana pH rendah akan menghambat pertumbuhan khamir (Kobayashi & Hayashi 1998). Penurunan populasi khamir kemungkinan juga disebabkan karena khamir kalah bersaing dengan bakteri asam laktat dan bakteri lain yang masih mendominasi substrat tersebut – seperti diperlihatkan pada grafik meningkatnya angka lempeng total pada Gambar tersebut. Hal ini sesuai dengan pendapat Mizunuma dan Iguchi (1981) dalam Fukushima (1982) dan Yokotsuka (1985) yang menyebutkan bahwa di awal tahapan fermentasi moromi, komposisi mikroba didominasi oleh bakteri kontaminan yang berasal dari koji, seperti
Micrococcus dan Bacillus (Gambar-2).