METODE PENELITIAN
PRE-INKUBASI
NaCl: 0%, 10%; Waktu: 0, 6, 12, 24 jam; Suhu: 53-55oC Fermentasi moromi
Suhu: 15+2oC pada 30 hari pertama, selanjutnya: suhu
ruang;
Waktu fermentasi: 3 bulan. Inokulasi khamir: umur
moromi 30 hari.
Penyaringan
Ampas moromi Ekstrak moromi
Bumbu Pemasakan & Penyaringan
Kecap Asin Larutan garam Pemasakan 100oC, 30 menit Penggilingan dan penyangraian Fermentasi moromi
1-3 bulan; suhu ruang. Inokulasi khamir: umur 7
hari moromi
Starter
25
dan pH; sedangkan analisis mikrobiologi meliputi jumlah bakteri asam laktat, jumlah khamir dan angka lempeng total.
Fermentasi moromi
Penelitian pada tahap ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh pre-inkubasi koji dan lama fermentasi moromi terhadap perubahan kimia dan mikrobiologi moromi. Pada moromi yang berasal dari pre-inkubasi koji, fermentasi moromi dilakukan pada suhu ruang. Sedangkan moromi kontrol, fermentasi moromi dilakukan pada suhu 14-16oC selama 30 hari pertama, dilanjutkan dengan fermentasi pada suhu kamar.
Fermentasi moromi dari koji pre-inkubasi. Dengan menggunakan wadah beaker glass yang sama dari tahap pre-inkubasi koji, sebanyak 3.700 g moromi yang berasal dari koji pre-inkubasi difermentasi pada suhu ruang. Sebanyak 0,1%(b/b) starter khamir dengan jumlah minimal 1,0 x 108 koloni/ml ditambahkan ke da lam moromi umur seminggu. Selama 10 hari pertama moromi diaduk setiap hari, selanjutnya moromi diaduk 3 kali seminggu. Masing-masing pengadukan (100 rpm) selama 15 menit.
Fermentasi moromi kontrol. Fermentasi moromi kontrol dilakukan pada suhu 14-16oC selama 30 hari pertama. Selanjutnya, moromi difermentasi pada suhu ruang. Ke dalam beaker glass ukuran 5 liter, dimasukkan moromi sebanyak 3.700 g. Moromi berasal dari campuran 1.700 g koji umur 3 hari dan 2.040 g larutan garam (28,2% kadar garam). Produk ini disebut sebagai moromi. Moromi selanjutnya diinkubasi pada suhu 14-16oC selama 30 hari pertama dan dilanjutkan fermentasi pada suhu ruang. Sejumlah 0,1%(b/b) starter khamir dengan jumlah minimal 1,0 x 108 koloni/ml ditambahkan pada moromi umur 30 hari. Satu minggu pertama, moromi diaduk setiap hari. Tiga hari pertama setelah penambahan kultur khamir, moromi diaduk setiap hari; selanjutnya moromi diaduk 3 kali seminggu. Masing-masing pengadukan (100 rpm) selama 15 menit.
Analisis. Sampel moromi sebanyak 150 gram diambil pada hari ke -0, 14, 28, 42, 56, 75 dan 90 untuk tiga pengujian, yaitu: komposisi kimia, mikrobiologi dan organoleptik. Pengujian komposisi kimia meliputi total nitrogen terlarut,
26
nitrogen formol, gula reduksi dan pH. Sedangkan pengujian mik robiologi meliputi jumlah bakteri asam laktat, jumlah khamir dan angka lempeng total.
Formulasi kecap asin
Penyaringan moromi. Sebanyak 100 g moromi disaring secara alami
(natural dripping) dengan menggunakan kain saring selama 24 jam pada suhu
ruang. Ekstrak moromi yang diperoleh kemudian dipasteurisasi pada suhu 80+2oC selama 30 menit , selanjutnya disimpan pada suhu -10oC hingga digunakan untuk pembuatan kecap asin. Berdasarkan komposisi kimia – yaitu kadar total nitrogen terlarut (TN), formol nitrogen (FN) dan rasio FN/TN – yang paling mendekati moromi standar, dipilih moromi terbaik untuk diformulasi menjadi kecap asin.
Pembuatan kecap asin. Bumbu-bumbu dipersiapkan bumbu-bumbu dengan cara sebagai berikut: 2,5 g daun salam, 5 g sereh dan 2,5 g daun jeruh, masing-masing disangrai, kemudian digiling halus dan dicampur merata. Larutan gula dipersiapkan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 75 ml air dididihkan, kemudian ditambahkan gula merah sebanyak 17,5 g dan diaduk hingga gula merah larut. Selanjutnya, ke dalam larutan gula merah ditambahkan ekstrak moromi sebanyak 50 g, bumbu-bumbu tersebut di atas, 1 g lengkuas dan 0,5 g pokak. Campuran dididihkan selama 30 menit, kemudian disaring dengan menggunakan kain saring yang telah disterilkan (direbus selama 30 menit). Larutan hasil penyaringan merupakan kecap asin.
Metode Analisis
Persiapan sampel moromi mengikuti Roling et al. (1994b), sedangkan metode analisis kimia mengikuti Draft ke -3 SNI Kecap Asin (Anonim, 2005).
Persiapan sampel moromi. Secara aseptik, sampel moromi diambil dari
glass beaker fermentasi moromi dan dimasukkan ke dalam botol steril dengan
menggunakan sendok steril. Cairan moromi diambil dari sampel moromi untuk keperluan analisis mikrobiologi. Setelah dilakukan pengukuran pH, sisa moromi disentrifugasi pada kecepatan 4.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Supernatan disimpan pada suhu -10oC untuk keperluan analisis kimia.
27
Analisis total nitrogen terlarut. Ditimbang sebanyak 0,51 g sampel dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml. Ditambahkan 2 g campuran selen dan 25 ml H2SO4 pekat. Selanjutnya sampel dipanaskan di atas pemanas listrik sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan (sekitar 2 jam). Setelah dingin, sampel diencerkan dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, kemudian ditepatkan sampai tanda garis. Dipipet sebanyak 5 ml larutan dan dimasukkan ke dalam alat penyuling, kemudian ditambahkan 5 ml NaOH 30% dan beberapa tetes indikator PP. Selanjutnya dilakukan penyulingan selama lebih kurang 10 menit. Sebaga i penampung digunakan 10 ml larutan asam borat 25% yang telah dicampur indikator. Sampel dititrasi dengan larutan HCl 0,01N. Dilakukan pula penetapan blanko. Kadar total nitrogen terlarut dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Total Nitrogen Terlarut (%) = (V1 – V2) x N x 0,014 x fp W
dimana, W adalah bobot cuplikan, V1 adalah volume HCl 0,01 N yang dipergunakan penitaran sampel, V2 adalah volume HCl 0,01 N yang dipergunakan penitaran blanko, N ada lah normalitas HCl dan fp adalah faktor pengenceran.
Analisis N-Formol. Ditimbang sebanyak 25 g sampel (ekstrak moromi) dan dimasukkan ke dalam beaker glass 50 ml. Sampel diatur pH-nya menjadi 8,0 dengan menggunakan larutan NaOH 1 N dengan alat pH meter dan magnetic
stirrer. Selanjutnya sampel dip indahkan ke dalam labu ukur 250 ml dan ditera
dengan akuades netral. Diambil sebanyak 100 ml larutan sampel dan dimasukkan ke dalam beaker glass, kemudian dimasukkan elektroda pH-meter dan batang magnet ke dalam larutan tersebut. Larutan sampel selanjutnya diaduk dan diatur kembali pHnya bila perlu apabila pH-nya tidak sama dengan 8,0. Ke dalam larutan sampel ditambahkan 6,25 ml larutan formaldehida netral dan diaduk hingga homogen. Selanjutnya dilakukan titrasi terhadap larutan sampel tersebut hingga nilai pH= 8,0 dengan menggunakan larutan NaOH 0,1 N. Selama titrasi tersebut pH sampel diukur dengan menggunakan pH meter. Kadar formol nitrogen dihitung dengan rumus sebagai berikut:
28
N - Formol (mg/kg) = (ml NaOH) x (N NaOH 0,1N) x (250 ml/100 ml) x 1.000 x 14 mg N/mmol g sampel
Untuk memperoleh nilai kadar formol nitrogen dalam persen (%), nilai di atas dikalikan dengan 10.000.
Total Gula (gula pereduksi). Ditimbang sebanyak 0,1 – 5,0 gram sampel ke dalam tabung hidrolisis, kemudian ditambahkan 2,5 ml HCl 25%. Sampel dihidrolisis diatas air mendidih selama 15 menit. Selanjutnya, sampel didinginkan. Sampel dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditera dengan akuades, kemudian dikocok dan disaring. Sebanyak 10 ml sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam gelas piala 150 ml yang telah berisi 10 ml larutan Fehling A dan 10 ml larutan Fehling B. Sampel dip anaskan dan dididihkan di atas hot
plate sampai terbentuk endapan Cu2O yang berwarna merah bata selama 3 menit.
Setelah sampel didinginkan, sampel disentrifus selama 3-5 menit dengan kecepatan 3.500 rpm untuk mempermudah mengambil endapan Cu2O. Selanjutnya, dibuang larutan yang ada di bagian atas. Endapan dicuci dengan akuades, kemudian disentrifus lagi selama 3 menit dengan kecepatan yang sama . Secara kuantitaif endapan yang diperoleh dipindahkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan 10 ml larutan Fehling C. Endapan dititrasi dengan larutan standar KMnO4 0,1 N sampai terbentuk warna merah muda yang bertahan selama 10 detik. Kadar gula pereduksi dihitung dengan rumus sebagai berikut:
ml KMnO4 tabel = ml contoh x N KMnO4 0,1
% Total gula = mg glukosa pada tabel x fp x 100 %_ gram contoh
Pengukuran pH. pH meter dikalibrasi dengan menggunakan larutan penyangga setiap kali sebelum pengukuran dilakukan. Elektroda yang telah dibersihkan dengan air suling dicelupkan ke dalam sampel. Selanjutnya nilai pH pada pH-meter dibaca dan dicatat.
Analisis penghitungan angka lempeng total (ALT) atau mikroba aerobik . Dipipet sampel sebanyak 1 ml, kemudian dilakukan pengenceran desimal sampel dengan menggunakan larutan pepton 0.1% dengan kadar garam
29
15%. Selanjutnya sampel diinokulasikan ke dalam medium PCA (Plate Count Agar). Sampel diinkubasi pada suhu 30+1oC selama 72+2 jam.
Analisis penghitungan khamir. Dipipet sampel sebanyak 1 ml, kemudian dilakukan pengenceran desimal sampel dengan menggunakan larutan
Tryptone Soy Broth. Selanjutnya sampel diinokulasikan ke dalam medium DG18
dan diinkubasi pada suhu 25+2oC selama 72 - 120 jam (ISO 7954:1987).
Analisis penghitungan bakteri asam laktat (BAL) (Fardiaz 1989).
Dipipet sampel sebanyak 1 ml dan diencerkan desimal dengan menggunakan larutan pepton 0.1% berkadar garam 15%. Selanjutnya, dip ipet 1 ml suspensi sampel dan dimasukkan ke dalam petri. Sebanyak 10 ml Rogosa-Agar
ditambahkan ke dalam petri. Sampel diinkubasikan pada suhu 37+1oC selama 24-48 jam.
Jumlah kolo ni, baik untuk analisis ALT, khamir maupun BAL dihitung dengan rumus sebagai berikut (ISO 4833:1991) :
c
Jumlah koloni (koloni/ml) = --- (n1 + 0,1n2)d
dimana c adalah jumlah koloni pada semua cawan yang menunjukkan pertumbuhan, n1 adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang menunjukkan pertumbuhan, n2 adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang menunjukkan pertumbuhan, dan d adalah faktor pengenceran yang dipakai pada pengenceran pertama.
Pengujian organoleptik. Pengujian organoleptik kecap asin dilakukan dengan Uji Hedonik dengan menggunakan 20 panelis terlatih (Rahayu 2001) dengan parameter aroma dan rasa. Uji organoleptik dilakukan di laboratorium
Sensory Evaluation dimana ruangan terisolasi, bebas dari kebisingan, bebas bau,
pencahayaan ruangan baik dan memiliki kelembaban udara antara 65-70%. Uji organoleptik dilakukan pada jam 09.00-10.00 dan jam 14.00-15.00 WIB. Sampel kecap asin disajikan pada suhu yang seragam (sekitar 45º -50ºC).
Uji organoleptik metod a hedonik untuk parameter aroma. Dituang sampel kecap asin sebanyak kira-kira 1 sendok makan pada wadah yang bersih dan tidak berbau. Panelis diminta melakukan penciuman terhadap sampel uji
30
tersebut untuk mengetahui aromanya (jarak hidung dengan contoh uji kira-kira ½ cm). Panelis diminta melakukan penilaian aroma sampel kecap asin pada skala 1 (sangat tidak suka) hingga 9 (sangat suka).
Uji organoleptik metoda hedonik untuk parameter rasa. Dituang sampel kecap asin sebanyak 10-15 ml ke dalam wadah yang bersih dan tidak berbau. Dengan menggunakan sendok teh, sampel diambil dan dilakukan pencicipan dengan menggunakan lidah untuk mengetahui rasanya. Panelis dapat melakukan pengulangan apabila diperlukan. Panelis diminta melakukan penilaian rasa sampel kecap asin pada skala 1 (sangat tidak suka) hingga 9 (sangat suka).
31