Isolasi Bakteri Agarolitik
Bakteri agarolitik diperoleh dari abalon dan alga merah dari perairan pantai Kuta, pantai Gerupuk dan Tanjung An Lombok Tengah; kultur pengkayaan dan isolasi bakteri agarolitik dilakukan menurut prosedur Agbo and Moss (1979). Indikasi isolat bakteri agarolitik adalah terjadinya pencairan atau pendangkalan agar-agar dan terbentuknya zona bening di sekitar koloni setelah ditetesi indikator Lugol’s iodine.
Pengambilan Sampel. Sampel abalon (20 ekor) yang sehat diperoleh dari hasil tangkapan nelayan di perairan pantai Gerupuk dan pantai Kuta Lombok Tengah dan disimpan dalam plastik. Sampel pakan alami alga merah diperoleh
dari pantai Kuta (9 sampel), Tanjung An (6 sampel) dan pantai Gerupuk (3 sampel) lalu dimasukkan ke dalam kantong plastik. Semua sampel dimasukkan dalam ice box dan segera dibawa ke laboratorium untuk dikulturkan.
Gambar 4. Bagan alur kerja penelitian TAHAP I
Identifikasi isolat
Degradasi substrat & Aktivitas enzim agarase
Kemampuan kolonisasi
Efek terhadap pertumbuhan abalon
Kontribusi enzimatik Kandidat Probiotik TAHAP II TAHAP III TAHAP IV TAHAP V TAHAP VI
Pengayaan bakteri agarolitik Pengambilan sampel
Isolasi selektif bakteri agarolitik
Isolat terseleksi Uji patogenisitas Resistensi antibiotik Kecepatan tumbuh Viabilitas sel Ketahanan pH rendah Uji penempelan Uji koagregasi Uji hidrofobisitas Derajat agarolitik
Kultur Pengayaan Bakteri Agarolitik. Abalon dibagi kedalam 3 kelompok berdasarkan ukurannya: >5 cm (4 ekor), 3.5-5 cm (7 ekor) dan < 3.5 cm (9 ekor). Selanjutnya cangkang abalon dicuci dan didesinfeksi dengan etanol 95% (Schulzeet al. 2006). Isi rongga perut (viscera) dibedah secara steril di atas es, lalu dihomogenisasi dalam 10 ml bufer kalium fosfat 100mM pH 7.5. Rumput laut (Gracilaria spp.) dibilas 2-3 kali dengan air laut steril lalu diblender secara aseptis. Pengayaan bakteri dilakukan dengan memasukkan 100 ml air laut steril ke dalam labu erlenmeyer 250 ml dan diberi agar-agar 0.2% (w/v, oxoid) sebagai sumber karbon. Kedalam tiap-tiap erlenmeyer diinokulasikan masing-masing 10 ml suspensi rumput laut, dan 5 g isi perut abalon untuk tiap-tiap kelompok. Erlenmeyer kemudian diinkubasi selama 4-7 hari pada 29 oC sambil digoyang (Agbo and Moss, 1979 yang dimodifikasi).
Isolasi Bakteri Agarolitik. Sebanyak 0.1 ml kultur sampel disebar pada medium agar-agar A (Vera et al. 1998) dan medium marine agar (MA), lalu diinkubasi pada 29oC. Isolasi selektif Vibrionaceae dilakukan dengan menanam suspensi pada medium Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS), kemudian diinkubasi pada 29 oC. Setelah 24 jam, koloni yang tumbuh diambil, dibuat replikanya dan dimurnikan dengan metode cawan gores. Selanjutnya cawan dituangi dengan Lugol’s iodin dan penampakan warna kuning-pucat di sekitar koloni pada latar cawan berwarna merah-violet menunjukkan adanya aktivitas degradasi agar-agar. Verifikasi adanya aktivitas agarolitik dilakukan setiap hari selama 7 hari dengan melihat ada tidaknya pencairan agar-agar (liquification) atau terjadi pendangkalan agar-agar di sekitar koloni (Agbo dan Moss, 1979). Selain itu, verifikasi juga dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada medium marine broth(MB) selama 24 jam pada 29 oC. Selanjutnya sel dan supernatannya dipisah dengan cara disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 100 µL supernatan yang mengandung ekstrak kasar enzim yang dimasukkan ke dalam sumur pada media agar-agar (1.2% agar Merck), diinkubasi selama 4 jam dan diamati ada tidaknya zona bening setelah dituangi Lugol’s iodin.
Isolat bakteri agarolitik dipelihara dalam larutan Dubos’ yang mengandung (gr/L) : NaNO3, 0.5; K2HPO4, 0.1; MgSO4.7H2O, 0.5; dan
FeSO4.7H2O, 0.01, agar 0.2%; dituang dalam botol Bijou dan sebelum
diautoklaf, pH disesuaikan menjadi 7.2.
Seleksi Bakteri Agarolitik Sebagai Kandidat Probiotik
Seleksi bakteri agarolitik sebagai kandidat probiotik didasarkan pada sejumlah kriteria, diantaranya adalah kerentanan isolat terhadap antibiotik, laju pertumbuhan, derajat agarolitik isolat tunggal dan kombinasi terbaik, patogenisitas terhadap inang, ketahanan terhadap pH asam, viabilitas pada air laut, kemampuan penempelan pada lempeng baja stainless, derajat hidrofobisitas, dan koagregasi isolat.
Resistensi Antibiotik. Isolat diuji resistensinya terhadap 4 jenis antibiotik mewakili kategori agen anti mikroba yang umumnya digunakan pada hewan dan manusia. Antibiotik yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Vankomisin, ampisilin, tetrasiklin dan rifampisin. Resistensi antibiotik dihitung berdasarkan ukuran zona hambatan yang terbentuk menggunakan metode cakram (paper disk). Interpretasi zona hambatan untuk resistensi, intermediat dan rentan ditentukan berdasarkan Johnson dan Case (2007). Isolat yang memiliki profil resistensi terhadap salah satu dari ke-4 antibiotik dieliminasi sebagai kandidat probiotik
Fase Pertumbuhan Isolat. Fase pertumbuhan berguna untuk menentukan bentuk kurva pertumbuhan bakteri sehingga dapat digunakan untuk menentukan waktu generasi, kecepatan tercapainya fase eksponensial dan perhitungan laju pertumbuhan spesifik. Isolat kandidat probiotik harus memiliki laju pertumbuhan yang tinggi atau pencapaian fase logaritmik yang cepat agar bisa bersaing dengan bakteri lainnya untuk dapat berkolonisasi pada permukaan sel saluran pencernaan inangnya. Uji pertumbuhan dilakukan sebagai berikut: 1 ose dari koloni tunggal isolat kandidat diinokulasikan ke dalam 10 ml medium cair, diinkubasi 24 jam pada suhu 29 oC. Kemudian sebanyak 1 ml kultur segar ini diinokulasikan ke dalam 99 ml medium marine broth (Lampiran 1) steril dan diinkubasi pada suhu 29oC, digoyang pada 120 putaran per menit selama 24 jam. Pertumbuhan bakteri diamati setiap 2-4 jam dengan mengukur nilai kerapatan optik (optical density, OD) pada panjang gelombang 620 nm (Hadioetomo 1993).
Kekuatan Pencairan Agar-Agar dan Kombinasi Terbaik. Uji kekuatan pencairan agar-agar dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada medium SWM agar dalam tabung reaksi dan diinkubasi selama 7 hari pada 29oC. Kekuatan pencairan agar-agar diukur berdasarkan kedalaman agar-agar yang mencair dalam milimeter (mm). Uji kombinasi terbaik isolat dalam mendegradasi agar-agar dilakukan dengan prosedur sebagai berikut: 1 ose dari koloni tunggal isolat kandidat diinokulasikan kedalam 10 ml medium cair, diinkubasi 24 jam pada suhu 29oC. Kemudian sebanyak 0.1 ml dari kultur segar ini diinokulasikan kedalam 25 ml medium cair steril dan diinkubasi pada suhu 29
o
C, digoyang pada 120 putaran per menit selama 36 jam. Selanjutnya sel dan supernatannya dipisah dengan cara disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 80 µL supernatan yang mengandung ekstrak kasar enzim dimasukkan ke dalam sumur pada media agar-agar dalam cawan (1.5% agar Merck), dan diinkubasi selama 4 jam (pada uji kombinasi digunakan 80 µl supernatan). Derajat hidrolisis agar-agar diukur berdasarkan ukuran diameter zona bening yang terbentuk setelah dituangi Lugol’s iodin.
Uji Patogenisitas Isolat Kandidat Probiotik (Cai et al. 2006). Uji ini dilakukan terhadap spat abalon umur 60 hari (ukuran 0.5-0.7 cm) dan Gracilaria sp. yang diperoleh dari Balai Budidaya Laut Lombok NTB. Mula-mula isolat kandidat probiotik diprakultur pada medium SWM broth pada 29 oC selama 24 jam. Kemudian prakultur dibuat serial pengenceran 105, 106, dan 107 CFU/ml menggunakan larutan fisiologis. Sebelum digunakan benih abalon yang masih melekat pada substratnya direndam dalam larutan antibiotik (rifampisin 50 µg/ml, tetrasiklin 10 µg/ml, kloramfenikol 20 µg/ml). Selanjutnya ke dalam 1000 ml air laut steril dalam stoples yang berisi 10 ekor benih ditambahkan masing masing serial pengenceran isolat kandidat probiotik dan satu kontrol tanpa probiotik (K0 = Kontrol, K1= 105 cfu/ml, K2= 106 cfu/ml, dan K3= 107 cfu/ml). Tiap-tiap perlakuan diulang 3 kali. Pengamatan terhadap mortalitas dilakukan tiap hari selama 6 hari.
Berikutnya kandidat probiotik diuji patogenisitasnya terhadap Gracilaria sp. yang dilakukan menurut prosedur Jaffray dan Coyne (1996). Potongan alga dimasukan kedalam air laut steril dan diberi ekstrak kasar enzim sebanyak 100
dan 500 µL dan sel bakteri dengan konsentrasi 107cfu/mL sebanyak 500 µL dan 1000 µL, lalu diinkubasi selama 6 hari. Patogenisitas isolat ditandai oleh adanya kerusakan berupa pemutihan pada ujung talus (white tip).
Uji Viabilitas Isolat Kandidat Probiotik pada Air Laut. Sebanyak 1% inokulum bakteri probiotik (108 cfu/ml) ditumbuhkan pada 99 ml air laut steril dalam erlenmeyer 250 ml dan hanya diberi substrat berupa agar-agar (0.1%, Merck), diinkubasi pada 29 oC selama 48 jam. Pengamatan dan penghitungan populasi bakteri dihitung tiap 12 jam selama 48 jam.
Uji Ketahanan terhadap Asam Lambung. Uji kemampuan isolat untuk bertahan pada lambung yang ber-pH rendah dan kolom air yang ber-pH basa dilakukan menurut Jacobsen et al. (1999) dengan sedikit perubahan pada pH dan suhu inkubasi yang digunakan. Sebanyak 1 ml isolat diinokulasikan dalam satu seri tabung reaksi yang berisi 99 ml media MB dengan pH 2.5, pH 4.5, pH 6.5 (diatur dengan penambahan HCl), kontrol pH 7.0 dan kondisi basa pada pH 7.5 (diatur dengan penambahan NaOH), selanjutnya diinkubasi pada 29oC selama 24 jam. Sel yang tumbuh dihitung dengan metode hitung cawan setiap 8 dan 24 jam. Ketahanan isolat terhadap asam lambung dan garam empedu ditentukan oleh selisih log jumlah bakteri dalam media kontrol dengan perlakuan selama periode inkubasi. Semakin kecil selisihnya maka semakin tahan terhadap asam lambung.
Uji Hidrofobisitas. Uji ini bertujuan untuk mengukur distribusi komponen sel antara fase hidrofobik dan air. Prinsip dari uji ini adalah bahwa komponen-komponen sel yang bersifat hidrofobik akan bersatu dan terpisah dari yang non-hidrofobik. Caranya sebagai berikut: mula-mula sel bakteri dipanen dengan cara sentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang diperoleh dibilas dan dilarutkan dalam Phosphat Buffer Saline (PBS: NaCl 8.5 g/L, KH2PO4 0.34 g/L, dan K2HPO4 1.21 g/L) sehingga mencapai OD pada 600 nm
sebesar 0.4 – 0.6 menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya 3 ml suspensi bakteri dimasukkan dalam tabung uji steril dan ditambahkan heksadekana 150 µl. Campuran divortek 2 kali (masing-masing 10 detik) dengan interval 5 detik. Campuran didiamkan 10 menit agar komponen hidrofob terpisah dengan yang
nonhidrofobik dan diukur densitasnya pada OD 600 nm. Selanjutnya komponen bakteri yang berpindah ke heksadekana dihitung dengan rumus :
=( − ) 100%
Ao = Nilai OD600 nm suspensi awal
A = Nilai OD600 nm setelah dicampur heksadekana
Uji Koagregasi. Uji koagregasi dilakukan untuk menentukan besarnya kemampuan interaksi antar kultur bakteri untuk saling menempel dalam saluran pencernaan sehingga tidak mudah keluar karena pergerakan usus. Pendekatannya adalah tiap isolat bakteri dipasangkan dan kemampuan untuk berkoagregasi dinyatakan dalam penurunan optical density (OD) relatif antara bakteri yang dipasangkan dengan yang tidak. Prosedurnya sebagai berikut: sel bakteri dipanen dengan cara disentrifugasi pada 6000 rpm selama 10 menit, kemudian dicuci 2 kali dengan PBS. Tiap-tiap kultur disuspensikan kembali dalam PBS sehingga mencapai OD pada 600 nm sebesar 0.6 ± 0.02 menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya kultur dipasangkan atau dicampur dengan perbandingan 1:1. Campuran digoyang selama 30 menit pada 120 putaran per menit, lalu didiamkan selama 4 jam pada suhu ruang, dan diamati OD 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer (Yuki et al. 2000). Persentase koagregasi dihitung dengan rumus
Koagregasi(%)=( . . ) . .
( . . ) x 100%
OD.1 = optical densitygalur 1 OD.2 = optical densitygalur 2
OD.1.2 = optical densitycampuran galur 1 dan 2
Uji Penempelan pada Lempeng Baja Stainless. Sebelum digunakan lempeng baja stainless (SS) ukuran 2 x 15 cm direndam dalam larutan deterjen panas (40-45 oC) selama 24 jam, kemudian dibilas dengan air panas (40-50 oC) hingga tidak berbusa dan licin, lalu dikeringanginkan. Salah satu sisi lempengan diberi tanda, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada 121 oC selama 20 menit. Uji penempelan dilakukan dengan cara meletakkan lempeng ke dalam 250 ml medium Marine Broth yang diinokulasikan dengan 1 ml kultur isolat bakteri
agarolitik (108cfu/ml) dalam erlenmeyer 1000 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 29oC dengan digoyang 120 putaran per menit selama 2 hari.
Densitas biofilm dianalisis pada 24 dan 48 jam dengan cara membilas lempeng dengan PBS, setelah itu dengan menggunakan swab permukaan lempeng diseka secara merata. Setelah itu swab dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan garam fisiologis. Kemudian tabung divorteks selama 1 menit, dan dibuat seri pengenceran. Pertumbuhan koloni setelah 2 hari dihitung dengan metode cawan sebar dan jumlah sel dinyatakan dalam cfu/cm2. Jumlah sel planktonik yang tumbuh pada fase cair juga dihitung dengan cara yang sama dan dinyatakan dalam cfu/ml.