Simpulan
Hasil isolasi dan seleksi isolat kandidat probiotik diperoleh 2 isolat yang telah terbukti memenuhi prinsip keamanan pangan dan berperan dalam fungsi fisiologis pencernaan abalon, yaitu Vibriogalur Alg3.1 dan galur Abn1.2. Vibrio galur Alg3.1 dan galur Abn1.2 berpotensi sebagai probiotik penyedia enzim agarase eksogen, ditandai dengan derajat degradasi substrat dan aktivitas enzim agarase in vitro yang tinggi. Kultur campuran ini menampilkan kemampuan kolonisasi yang lebih baik bila dibandingkan dengan kultur tunggal. Aplikasi kultur campuran ini pada pakan dapat meningkatkan aktivitas enzim agarase dan amilase eksogen pada saluran pencernaan dan sekaligus memperbaiki pertumbuhan abalon bila dibandingkan dengan kontrol yang mendapatkan pakan yang disuplementasi antibiotik. Dengan demikian galur Alg3.1 dan Abn1.2 berpotensi untuk dikembangkan sebagai probiotik.
Saran
Ada beberapa hal yang perlu diteliti lebih lanjut sebelum kandidat probiotik ini diaplikasikan secara luas, yaitu
1. Perlu dilakukan uji patogenisitas isolat terhadap rumput laut yang tergolong agarofita dalam kondisi alamiahnya untuk menilai kemungkinan adanya interaksi dengan mikroba lain yang dapat menyebabkan munculnya penyakit ‘white tip’.
2. Fungsi sel bakteri probiotik sebagai sumber nutrisi terutama protein bagi abalon perlu dikaji melalui teknik radio labeling. Teknik ini menyediakan informasi mengenai kadar dan disposisi nutrisi dari sel bakteri pada berbagai jaringan abalon.
3. Perlu penelitian lanjutan mengenai konsentrasi asam lemak rantai pendek yang terbentuk pada saluran pencernaan abalon.
4. Pemberian probiotik sebaiknya dilakukan sewaktu fase larva bersamaan dengan kultur pengayaan pakan alami (bentik diatom), sehingga probiotik dapat menjadiprimary colonizerpada saluran cerna abalon
Abdallah FB, Chaieb K, Zmantar T, Kallel H, Bakhrouf A. 2009. Adherence assay and slime production of Vibrio alginolyticus and V. haemolyticus. Brazillian J Microbiol40:394-398
Abidi R. 2003. Use probiotics in larval rearing of New Candidate Species. Aquaculture Asia8:1-2
ACIAR Australian Center for international Agricultural Research2007. Abalone industry enhancement in estern Indonesia. Australia: Australia-Indonesia Partnership
Affandi R, Sjafei DS, Raharjo MF, Sulistiono. 2005. Fisiologi ikan-pencernaan dan penyerapan makanan. Bogor: Departemen MSP, FPIK IPB
Agbo JAC, Moss MO. 1979. The isolation and characterization of agarolityc bacteria from a Lowland river. J General Microbiol 115: 355-368
Allouch J et al.2003. The three-dimensional structures of two β-agarases. J Biol Chem 278: 47171-47180
Angka SL, Suhartono MT. 2000. Bioteknologi hasil laut. Bogor: PKSPL-IPB AOAC 1970. Official methods of analysis of AOAC. Virginia: Arlington, AOAC
Inc.
Aslamyah S. 2006. Penggunaan mikroflora saluran pencernaan sebagai probiotik untuk meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup ikan bandeng (Chanos chanos Forsskal) [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Atlas RM, Batha R. 1992. Microbial ecology : fundamental and applications. San Fransisco: The Benjamin/cummings publishing company, inc.
Balcazar JLet al. 2006. The role of probiotics in aquaculture. Vet Microbiol114: 173-186
Barsanti L, Gualtieri P. 2006. Algae: Anatomi, chemistry and biotechnology. USA: CRC Press -Taylor &Francis
Bautista-Teruel MN, Fermin AC, Kashio SS. 2003. Diet development and evaluation for juvenile abalone, Haliotis asinina: animal and plant protein sources. Aquaculture219: 645-653
Brashear MM, Jaroni D, Trimble J. 2003. Isolation, selection and characterization of Lactic Acid bacteria as Competitive exclusion product to reduced Escherichia coli0157:H7 in cattle. J Food Protec66: 355-363
Britz PJ. 1996. The suitability of selected protein sources for inclusion in formulated diets for the South African abalone, Haliotis midae. Aquaculture140: 63-73
Cai J, Han Y , Wang Z. 2006. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from abalone ( Haliotis diversicolor supertexta L.) postlarvae associated with mass mortalities. Aquaculture257: 161-166
Capinpin EC, Corre KG. 1996. Growth rate of the Philipine abalone, Haliotis asininafed an artificial diet and macroalga. Aquaculture144: 81-89
Dewanti R, Wong ACL. 1995. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. Int J Food Microbiol 26: 147- 164
Dewanti-Hariadi R. 1997. Pembentukan biofilm pada permukaan padat. Bul Teknol dan Industri Pangan8: 70-77
Doeschate KI, Coyne VE. 2008. Improved growth rate in farmed Haliotis midae through probiotic treatment. Aquaculture284:174-179
Dong J, Hashikawa S, Konishi T, Tamaru Y, Araki T. 2006. Cloning of the novel gene encoding agarase from a marine bacterium, Vibrio sp. strain PO- 303, and characterization of the gene product. J Appl Environ Microbiol 72: 6399-6401
Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP, Raoult D. 2000. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol 38:3623- 3630
Dybkaer R. 2001. Unit katal for catalytic activity. Pure Appl Chem6:927-931 Eckborg NA. 2005. The agarase system Of Saccharophagus degradans 2-40:
analysis of the agarase system and protein localization [Dissertation]. USA: University of Maryland , College Park.
Eckborg NA et al. 2006. Genomic and proteomic analyses of the agarolytic system expressed by Saccharophagus degradans 2-40. J Appl Environ Microbiol72: 3401-3405
Erasmus JH, Cook PA, Coyne VE. 1997. The role of bacteria in the digestion of seaweed by the abaloneHaliotis midae. Aquaculture155: 377-386
Fallu R. 1991. Abalone farming. Fishing News Books. USA: Blackwell Scientific Publications Inc.
Finlay BB, Falkow S. 1997. Common themes in microbial pathogenicity revised. Microbiol Mol Biol RevP: 136-169
Flament D. 2007. Alpha–agarase define a new family of glycocide hyrolases, distinct from beta-agarase families. J Appl Environ Microbiol 73: 4691- 4694
Fleming AE. 1995. Growth, intake, feed conversion efficiency and chemosensory preference of the Australian abalone Haliotis rubra. Aquaculture 132: 297-311
Fleming AE. 1996. Digestive efficiency of the Australian abalone Haliotis rubra in relation to growth and feed preference. Aquaculture134: 279-293 Foster GG, Hodgson AN, Boyd CS. Polysaccharolytic activity of the digestive
enzymes of the macroalgal herbivore, Turbo sarmaticus (Mollusca: Vetigastropoda: Turbinidae). CBPpart B 122: 47-52
Fu XT, Lin H, Kim SM. 2009. Optimization of medium composition and culture conditions for agarase production by Agarivorans albusYKW-34. Process Biochemistry44: 1158–1163
Fu XT, Kim SM. 2010. Agarase: review of major sources, categories, purification method, enzyme characteristics and applications. Mar Drugs 8: 200–218 Garcia-Carreno FL, del Toro MAN, Serviere-Zaragoza E. 2003. Digestive
enzymes in juvenile green abalone, Haliotis fulgens, fed natural food. CBP part B 134: 143-150
Garcia-Esquivel Z, Felbeck H. 2006. Activity of digestive enzymes along of the gut of juvenile red abalone, Haliotis rufescens, fed natural and balanced diet. Aquaculture261:615-625
Gatesoupe FJ. 2008. Updating the importance of lactic acid bacteria in fish farming: natural occurrence and probiotic treatments. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 14: 107-114
Gawlicka et al. 2000. Activity of digestive enzymes in yolk-sac larvae of atlantic halibut (Hippoglassus hippoglassus): indication of readiness for first feeding. Aquaculture184: 303-314
Gibson LF, Woodworth J, George AM. 1998. Probiotic activity of Aeromonas media on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii. Aquaculture169: 111-120
Gomez-Gill B, Roque A, Trunbull JF. 2000. The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms. Aquaculture 191: 259-270
Gomez-Pinchetti JL, Garcia-Reina G. 1993. Enzymes from marine phycophages that degrade cell walls of seaweeds. Mar Biol4: 553-558
Gordon RH, Cook PA. 2010. World abalone supply, market and pricing. J Shellfish Res29:569-571
Gram L, Lovold T, Nielsen JTF, Melchiorsen, Spanggaard B. 1999. Inhibition of Vibrio anguillarum by Pseudomonas fluorescens AH2, a possible probiotic treatment of fish. J Appl Environ Microbiol 65: 969-973
Gullian M, Thompson F, Rodriquez J. 2004. Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei. Aquaculture233: 1-14
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi dasar dalam praktek: teori dan praktek. Jakarta: PT. Gramedia,
Harris JM. 1993. The presence, nature dan role of gut microflora in aquatic invertebrates: a synthesis. Microb Ecol25:195-231
Hoffsten B, Malmqivst M. 1974. Degradation of agar by gram-negatrive bacteria. J General microb87:150-158
Hu Z, Lin BK, Xu Y, Zhong MQ, Liu GM. 2009. Production and purification of agarase from a marine agarolytic bacterium Agarivorans sp. HZ105. J Appl Microbiol 106: 181-90
Iehata S et al. 2010. Improved gut environment of abalone Haliotis gigantea through Pediacoccussp. Ab1 treatment. Aquaculture305: 59-65
Jacobsen CN et al. 1997. Secreening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans. J Appl Environ Microbiol 65: 4949-4956
Jaffray AE, Coyne VE. 1996. Development of an in situ assay to detect bacterial pathogens of the red alga Gracilaria gracilis. J Appl Phycol8:409-414 Johnson TR, Case CL. 2007. Laboratory experiment in microbiology. Singapore.
Pearson Benjamin Cummings.
Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan MJ, Gibson L. 2008. Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes. Aquaculture274: 1-14
Knauer J, Britz PJ, Hecht T. 1996. Comparative growth performance and digestive enzyme activity of juvenile South Africa abalone, Haliotis midae, fed on diatoms and a practical diet. Aquaculture140: 75-85
Leon O, Quintana L, Feruzzo G, Slebe JC. 1992. Purification and properties of an extracelluler .agarase from Alteromonas sp. Strain C-1. J Appl Environ Microbiol58:4060-4063
Macey BM, Coyne VE. 2005. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment. Aquaculture245: 249- 261
Macey BM, Coyne VE. 2006. Colonization of the gastrointestinal tract of the farmed abalone Haliotis midae by the probionts Vibrio midae SY9, Crytococcus sp. SS1, and Debaryomyces hanseii AY1. Mar Biotech 3:246-259
Macian MC, Ludwig W, Schleifer KH, Pujalte MJ, Garay E. 2001. Vibrio agarivorans sp. nov., a novel agarolytic marine bacterium. Int J Syst Bacteriol, 51:2031-2036
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock Biology of Microorganisms. Edisi 12. San Francisco: Pearson Benjamin Cummings Mai K, Mercer JP, Donlon J. 1995. Comparative studies on the nutrition of two
species of abalone, Haliotis tuberculata L and Haliotis discus hannaeIno. III. Response abalone to various levels of dietary lipids. Aquaculture134: 65-80
Malik A et al. 2003. Coaggregation among non flocculated bacteria from activated sludge. J Appl Environ Microbiol 69 : 6056-6063
Maniatis T, Sambrook J, Fritsh E. 1989. Molecular Cloning a Laboratory manual. USA: Cold Spring Harbor laboratory Press.
Marchesi JR. 1998. Design and evaluation of usefull bacterium-specific PCR primers that amplify gens coding for bacterial 16S rRNA. J Appl Environ Microbiol 64 : 795-799
Marques A, Ollevier F, Verstraete W, Sorgeloos P, Bossier P. 2006. Gnotobiotically grown aquatic animals : opportunies to investigate host- microbe interactions. [Review]. J Appl Microbiol 100: 903-918
Michel G, Nyval-Collen P, Barbeyron T, Czjzek M, Helbert W. 2006. Bioconversion of red seaweed galactans: a focus on bacterial agarases and carrageenases.J Appl Microbiol Technol71:23-33
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalysilic acid reagent of determinant of reducing sugar.Anal Chem31:426 – 428
Nichols DS. 2003. Prokariotes and the input of polysaturated fatty acids to the marine food web. FEMS Microbiol. Lett. 219:1-7
Olin P, McBridge S. 2000. Abalone Culture. Di dalam: Stickney RR, editor. Encyclopedia of Aquaculture California. Singapore: John Wiley & Son. Inc..
Picos-Garcia C, Garcia-Carreno FL, Serviere-Zaragoza E. 2000. Digestive proteases in juvenile Mexican green abalone, Haliotis fulgens. Aquaculture181:157-170
Prado S, Romalde JL, Barja JL. 2010. Review of probiotics for use in bivalve hatcheries. Vet Microbiol145:187-197.
Qi Z, Zhang XH, Boon N, Bossier P. 2009. Probiotics in aquaculture of China – Current state, problems and prospect. Aquaculture290: 15-21
Ramos-Vivas J et al. 2008. Influence of environmental conditions on biofilm formation by Hafnia alvei strains. Vet Microbiol129:1-2
Rengpipat S, Rukpratanporn S, Piyatoratitivorakul S, Menasaveta P. 2000. Immunity enhancement in black tiger shrimp / Penaeus monodon by a probiont bacterium Bacillus S11. Aquaculture191:271-288
Riemann L, Azam F. 2002. Widespread N-acetyl-D-glucosamine up-take among marine pelagic bacteria and its ecological implictions. Appl. Environ. Microbiol. 68:5554-5562
Santos Y et al. 1990. Comparison of the cell surface hyrophobicity of bacterial fish pathogen by different procedur. In Perkins FO and Cheng TC. Pathology in Marine Science. Ed. London: Academic Press.
Sawabe T et al. 1998. Vibrio halioticoli sp. nov., a motile alginolytic marine bacterium isolated from the gut of abalone Haliotis discus hannai. Int J Syst Bacteriol 48:573-580
Sawabe Tet al. 2003. Acetic acid production of Vibrio halioticoli from alginate: a possible role for establishment of abalone-V. halioticoli association. Aquaculture219:671–679.
Schulze AD, Alabi AO, Tattersall-Sheldrake AR, Miller KM. 2006. Bacterial diversity in a marine hatchery: Balance between phatogenic and potentially probiotic bacterial strains. Aquaculture256:50-73
Setyono DED. 2008. Biologi dan ekologi abalon. Oceana33:1-13. Setyono DED. 2009.Biologi dan Reproduksi Abalon. Jakarta: LIPI Press
Soegiarto A, Sulistijo, 1985. The potential of marine algae for biotechnology products in Indonesia. Di dalam : Workshop on marine algae biotechnology;Jakarta, December 11-13, 1985.
Sofyan Y, Sukriadi., Ade Y, Bagja I, Dadan K. 2005. Pembenihan Abalon (Haliotis
asinina) di Balai Budidaya Laut Lombok. Departemen Kelautan dan Perikanan
Direktorat Jenderal Perikanan Budidaya Departemen Kelautan dan Perikanan. Mataram.
Sugano Y, Terada I, Arita M, Noma M, Matsumoto T. 1993. Purification and characterization of a new agarase from a marine bacterium, Vibrio sp. Strain JT0107. J Appl Environ Microbiol 59:1549-1554
Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Bogor: IPB Press
Suzer C. 2008. Bacillus spp. bacteria as probiotics in gilthead sea bream (Sparus aurata, L.) larvae: Effects on growth performance and digestive enzyme activities. Aquaculture280:140-145
Suzuki H, Sawai Y, Takada M. 2001. The effect of apparent molecular weight and component of agar on gel formation. Food Sci Technol7:280
Swartz MN, Gordon N. 1958. Agarase from an agar-digesting bacterium. J Appl Microbiol 4:392-403
Takami H. 2002. Feeding ecology of an abalone, H. discus hannai, in their early life stages. Fukusima: Tohoku National Fisheries Research Institute
Tanaka R, Sawabe T, Yoshimizu M, Ezure Y. 2002. Distribution of Vibrio halioticoli around an Abalone-farming Center in Japan. Microb Environ 17: 6-9
Tanaka R, Ootsubo M, Sawabe T, Ezura Y, Tajima K. 2004. Biodiversity and in situ abundance of gut microflora of abalone (Haliotis discus hannai) determined by culture-independent techniques. Aquaculture241: 453-463 Thompson FL, Ida T, Swings J. 2004. Biodiversitas of Vibrios. Microbiol Mol
Thompson FLet al. 2003. Vibrio neptuniussp. nov., Vibrio brasiliensis sp. nov. and Vibrio xuii sp. nov., isolated from the marine aquaculture environment (bivalves, fish, rotifers and shrimps). Int J Syst Bacteriol, 53:245-252 Thongrod S, Tamtin M, Chairat C, Boonyaratpalin M. 2003. Lipid to
carbohydrates ratio in dongkey’s ear abalone (Haliotis asinina) diets. Aquaculture225:165-174
Vandevoorde L, Christiaens H, Verstraete W. 1992. Prevalence of coaggregation reacting among chiken Lactobacilli. J Appl Bacteriol72: 214-219
Vera J, Alvares R, Murano E, Slebe JC, Leon O. 1998. Identification of a marine agarolityc Pseudoalteromonas isolate and characterization of its extracellular agarase.J Appl Environ Microbiol 64: 4374-4383
Verschuere L, Rombout G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotic Bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol Mol Biol Rev 64: 655-671
Viana et al. 2007. Energy and nutrient utilization juvenile green abalone (Haliotis fulgens) during starvation. Aquaculture264: 323-329.
Viera MV. 2005. Suitability of three red macroalgae as a feed for abalone H. tuberculata cocccineaReeve. Aquaculture248: 75-82.
Villamil L, Tafalla C, Figueras A, Novoa B. 2002. Evaluation of immunomodulatory effects of lactic acid bacteria in turbot (Scophthalmus maximus). Clinical and Diagnos Lab Immun9:1318–1323
Wang YB. 2007. Effect probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture269: 259-264 Wang YB, Li JR, Lin J, 2008. Probiotics in aquaculture: Challenges and outlook.
Aquaculture281: 1-4
Wirawati CU. 2002. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari tempoyak sebagai probiotik [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Xiang-Hong W, Jun L, Huai-Shu X. 1998. Application of probiotics in aquaculture. http://www.alken-murray.com/China98.htm
Yuki et al. 2000. Colonization of the stratified squamous epithelium of the nonsecreting area of horse stomach by Lactobacilli. J Appl Environ Microbiol 66: 5030-5035
Zhang WW, Sun L. 2007. Cloning, characterization, and molecular application of beta-agarase gene from Vibrio sp. strain V134. J Appl Environ Microbiol 73: 2825-2831
Zhao J, Shi B, Jiang QR, Ke CH. 2012. Changes in gut-associated flora and bacterial digestive enzymes during the development stages of abalone (Haliotis diversicolor )
.
Aquaculture xxx: xxx-xxx (article In Press). doi: 10.1016/j.aquaculture.2012.01.016Zhou Xx, Wang Yf, Li Wf. 2009. Effect of probiotic on larva shrimp (Penaeus vannamei) based on water quality, survival rate and digestive enzyme activities. Aquaculture287: 349-353
Ziaei-Nejad S et al. 2006. The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture252: 516-524
1998 dan Leonet al. 1992) - Hidrolisat kasein : 0.25% - Yeast ekstrak : 0.05% - Proteose pepton : 0.5 % - NaH2PO4 : 0.06% - MgSO4 : 0.5% - CaCl2 : 0.01% - NaCl : 3% - FeSO4 : 0.002% - Agar : 1,5%
2. Media marine broth, digunakan untuk isolasi, peremajaan dan penyimpanan isolat - Yeast extract 0.1% - Casamino acid 0.5% - NaCl 3.0% - MgCl2.6H2O 0.23% - KCl 0.03%
3. Untuk produksi enzim agarase digunakan Basal Salt Solution (Medium B, gr/l) (Hofsten dan Malmqvis. 1974)
- NaNO3 : 2 - Yeast ekstrak : 1 - K2HPO4 : 0.5 - MgSO4 : 0.2 - CaCl2 : 0.02 - MnSO4 : 0.02 - FeSO4 : 0.02 - Agarosa : 2 pH 7.0
4. Phosphate buffered saline (PBS) : 10 mM K2PO4-KH2PO4, 0.14 M NaCl,
pH 7.2
5. Reagen dinitrosalisilic acid (DNS)(gr/l) :
- NaOH padat : 10
- KNa-Tartarat : 182
- Na2SO3 : 0.5
- DNS : 10
- Aquades : sampai dengan 1000 ml
Sebanyak 10g NaOH, 182 g KNa-tartarat dan 0.5 g Na2S03dimasukan
dalam Erlenmeyer 1000 ml dan dilarutkan dengan akudes sedikit demi sedikit. Setelah larut ditambahkan DNS sambil distrer perlahan-lahan. Larutan disaring dengan kertas saring dan simpan dalam botol gelap pada suhu dingin.
6. Pereaksi Bradford (500 ml) :
- commasi brilliant blue (CBB G-250) : 0.05 g
- ethanol 95% : 25 ml
- asam phosphate 85% : 50 ml
Sebanyak 0.05 g CBB dilarutkan dalam 25 ml etanol 95% dan diaduk selama 1 jam. Larutan kemudian ditambahkan 50 mL H3PO4 85% (b/v)
dan diencerkan dengan akuades hingga 500 ml. Setiap akan digunakan pereaksi ini harus disaring terlebih dahulu dan pereaksi ini tetap baik bila disimpan diruang gelap selama kurang lebih 1 bulan.
7. Lugol’s Iodine (100 ml) :
A. KI : 2 g
Akuades 20 ml
B. I2murni : 1 g
Lampiran 2. Prosedur uji degradasi substrat oleh bakteri
a. Memperoleh supernatan bebas sel
~ Persiapan kultur dilakukan dengan cara menginokulasikan 1 ml isolat ke dalam 100 ml media kultur cair yang masing-masing mengandung substrat (pati, kasein, agar, tepung Gracilariasp.). Kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 29oC.
~ Setelah 24 – 48 jam kultur cair disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit, supernatannya diambil dan digunakan sebagai sampel untuk pengujian degradasi substrat dan aktivitas enzim
b. Prosedur uji degradasi pati dan agar-agar
~ Standar pati dan agar-agar : 50 mg pati dan agar-agar masing-masing dilarutkan dalam 100 ml akuades.
~ Larutan standar dibuat secara seri di dalam tabung reaksi terpisah yaitu 0.4 ml (2 ppm), 0.8 ml (4 ppm), 1.2 ml (6 ppm), 1.6 ml (8 ppm), dan 2.0 ml (10 ppm) masing-masing ditambah akuades hingga menjadi 10 ml, tabung ditutup dengan karet penutup dan dikocok sampai homogen, kemudian ditambah dengan 1.0 ml larutan Lugol’s iodine.
~ Larutan blanko yaitu 10 ml akuades ditambah dengan 1.0 ml larutan Lugol’s iodine
~ Sampel 0 jam sebanyak 1 ml dimasukkan dalam tabung reaksi dan diencerkan dengan akuades sampai 10 ml dan ditambahkan 1.0 ml larutan Lugol’s iodine, kemudian dibandingkan dengan warna larutan standar 2.0 ml. Bila warnanya sudah mendekati pengenceran sudah cukup tetapi bila masih pekat harus diencerkan hingga warnanya hampir sama.
~ Supernatan (sampel 24 dan 48 jam) diambil sebanyak 0.5 ml dan dimasukan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah akuades hingga 10 ml dan 1.0 ml larutan Lugol’s iodine.
~ Absorbansi semua larutan diukur pada panjang gelombang 578 nm untuk pati dan 540 nm untuk agar-agar
~ Kemampuan bakteri dalam mendegradasi pati dan agar-agar dapat diketahui dengan memasukkan nilai absorbansi dalam persamaan regresi dan mempersiapkan sebuah grafik konsentrasi pati atau agar-agar vs absorbansi, konsentrasi yang tidak diketahui dibaca di luar kurva (ppm)
c. Prosedur uji degradasi karbohidrat Gracilaria (Metode Anthrone)
~ Standar D-galaktosa. : 200 mg galaktosa dilarutkan dalam 100 ml akuades, diambil 10 ml larutan dan diencerkan menjadi 100 ml dengan akudes.
~ Larutan standar dibuat secara seri di dalam tabung reaksi secara terpisah yaitu 0 ml (blanko), 0.2 ml (0.04 mg), 0.4 ml (0.08 mg), 0.06 ml (0.12 mg), 0.8 ml (0.16 mg), dan 1.0 ml (0.2 mg), lalu diencerkan dengan akuades hingga menjadi 1.0 ml, tabung ditutup dengan karet penutup dan dikocok sampai homogen, kemudian ditambah dengan 5.0 ml pereaksi anthrone dan ditutup. Divortek dan dikocok hingga merata.
~ Tabung reaksi dipanaskan di atas penangas air 100 oC selama 12 menit, didinginkan lalu absorbansi semua larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm
~ Sampel 0 jam sebanyak 1 ml dimasukkan dalam tabung reaksi ditambahkan 5.0 ml pereaksi anthrone, dipanaskan di atas penangas air 100 oC selama 12 menit, didinginkan lalu absorbansi semua larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm. Kemudian dibandingkan dengan warna larutan standar 1.0 ml. Bila warnanya sudah mendekati pengenceran sudah cukup tetapi bila masih pekat harus diencerkan hingga warnanya hampir sama.
~ Supernatan (sampel 24 dan 48 jam) diambil sebanyak 1.0 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah 5.0 ml pereaksi anthrone, dipanaskan di atas penangas air 100 oC selama 12 menit, didinginkan lalu absorbansi semua larutan diukur pada panjang gelombang 630 nm
~ Kemampuan bakteri dalam mendegradasi karbohidrat Gracilaria dapat diketahui dengan memasukkan nilai absorbansi dalam persamaan regresi dan mempersiapkan sebuah grafik konsentrasi pati atau agar-agar vs absorbansi, konsentrasi yang tidak diketahui dibaca di luar kurva (ppm)
~ Persamaan regresi Y = a + bx
d. Prosedur uji degradasi kasein
~ Standar kasein : 50 mg kasein masing-masing dilarutkan dalam 100 ml akuades.
~ Larutan standar dibuat secara seri di dalam tabung reaksi terpisah yaitu 0.4 ml (2 ppm), 0.8 ml (4 ppm), 1.2 ml (6 ppm), 1.6 ml (8 ppm), dan 2.0 ml (10 ppm) masing-masing ditambah akuades hingga menjadi 10 ml, tabung ditutup dengan karet penutup dan dikocok sampai homogen, kemudian ditambah dengan 1.0 ml larutan biuret.
~ Sampel 0 jam sebanyak 1 ml dimasukkan dalam tabung reaksi dan diencerkan dengan akuades sampai 10 ml dan ditambahkan 1.0 ml larutan biuret, kemudian dibandingkan dengan warna larutan standar 2.0 ml. Bila warnanya sudah mendekati pengenceran sudah cukup tetapi bila masih pekat harus diencerkan hingga warnanya hampir sama.
~ Supernatan (sampel 24 dan 48 jam) diambil sebanyak 0.5 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah akuades hingga 10 ml dan 1.0 ml larutan biuret.
~ Absorbansi semua larutan diukur pada panjang gelombang 520 nm
~ Kemampuan bakteri dalam mendegradasi pati dan agar-agar dapat diketahui dengan memasukkan nilai absorbansi dalam persamaan regresi dan mempersiapkan sebuah grafik konsentrasi kasein vs absorbansi, konsentrasi yang tidak diketahui dibaca di luar kurva (ppm)
Lampiran 3. Pengukuran aktivitas enzim agarase a. Pembuatan kurva standar D-galaktosa
Dibuat konsentrasi D-galaktosa stok 1000 ppm sebanyak 20 ml dengan