BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Senyawa dari Ekstrak Metanol Batang Gandaria (Bouea
Isolasi senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak metanol batang B. macrophylla bertujuan untuk memperoleh senyawa murni (isolat) dari ekstrak metanol batang B. macrophylla. Ekstrak metanol batang B. macrophylla yang berwarna coklat tua sebanyak 37,96 gram dianalisis menggunakan KLT yang bertujuan untuk mencari eluen yang sesuai untuk pemisahan pada proses selanjutnya. Hasil KLT ekstrak kasar (crude extract) terbaik adalah menggunakan eluen n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 3:7 yang dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Kromatogram KLT ekstrak kasar (crude extract) metanol batang gandaria
Berdasarkan hasil kromatogram KLT tersebut, eluen n-heksana:EA digunakan sebagai eluen untuk tahap fraksinasi/pemisahan menggunakan KVC.
Fungsi fraksinasi menggunakan KVC adalah untuk memisahkan senyawa yang sangat beraneka ragam yang terkandung dalam sampel menjadi beberapa fraksi berdasarkan tingkat kepolarannya. Pemisahan menggunakan KVC ini
λ 254 nm λ366 nm
Tanpa lampu UV
30 menggunakan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Silika gel 60 F254 sebagai fase diam, dan fase gerak yang digunakan adalah perbandingan eluen pelarut organik dengan kepolaran yang bertingkat (n-heksana 100%, n-heksana:etil asetat, etil asetat 100%, etil asetat:metanol, metanol 100%). Fraksi hasil KVC dikumpulkan dalam botol vial dandidapatkan sebanyak 6 fraksi. Bobot masing-masing fraksi hasil KVC dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Berat fraksi hasil KVC
Fraksi Berat (g)
Masing-masing fraksi hasil KVC diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase gerak (eluen) n-heksana:etil asetat (2:8).
Identifikasi ini dilakukan untuk melihat pola pemisahan yang baik dari fraksi hasil KVC. Nilai faktor retensi (Rf) diperoleh dengan cara menghitung jarak noda yang ditempuh oleh senyawa dibagi jarak yang ditempuh oleh eluen (fase gerak). Nilai Rf spesifik pada suatu senyawa dengan menggunakan eluen tertentu. Hal itu dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya variasi senyawa dalam sampel yang diuji. Jika senyawa mempunyai nilai Rf lebih besar berarti kepolarannya tinggi, begitu juga sebaliknya (Dewi et al., 2015). Hasil KLT dari 6 fraksi KVC dapat dilihat pada Gambar 7.
31 Gambar 7. Kromatogram KLT fraksi KVC (F1-F6)
Hasil KLT 6 fraksi KVC disemprot menggunakan pereaksi semprot AlCl3
5% yang bertujuan untuk meningkatkan kepekaan dalam mendeteksi spot noda flavonoid pada plat KLT. Larutan AlCl3 bila disemprotkan pada plat KLT akan terlihat spot noda kuning tanpa perlu diamati di bawah sinar UV (366 nm), yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Markham, 1988). Reaksi antara flavonoid dan AlCl3 dapat dilihat pada Gambar 8.
O
Gambar 8. Reaksi antara flavonoid dan AlCl3 (Markham, 1988)
Berdasarkan hasil KLT yang diamati pada lampu UV panjang gelombang 254 nm dan 366 nm (Gambar 7), menunjukkan bahwa spot noda yang terdapat pada fraksi F1-F4 merupakan senyawa nonpolar karena dapat terelusi dengan tinggi menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:8), sedangkan pada fraksi F5 dan F6 diduga terdapat senyawa polar karena spot noda setelah dielusi dengan eluen n-heksana:etil asetat (2:8) masih tertahan di bawah. Setelah disemprot
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F1 F2 F3 F4 F5 F6 Senyawa target
λ 254 nm λ366 nm
n-Heksana:EA (2:8) n-Heksana:EA (2:8)
32 menggunakan pereaksi AlCl3, fraksi F5 diduga terdapat senyawa target yaitu flavonoid, karena menunjukkan spot noda berwarna kuning ketika diamati di bawah sinar UV 366 nm.
Fraksi F5 (1,1693 g) selanjutnya dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Fraksinasi menggunakan KKG berfungsi untuk memisahkan senyawa bahan alam yang masih bercampur pada fraksi hasil KVC sebelumnya. Campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas fase diam berupa silika gel G60 yang berada dalam tabung kaca (kolom). Fase gerak yang merupakan campuran pelarut organik (eluen) dibiarkan mengalir melalui kolom yang disebabkan oleh gaya gravitasi bumi(Gritter et al., 1991).
Fase gerak yang digunakan berupa campuran pelarut kloroform:etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (gradien). Pemilihan eluen kloroform:etil asetat (EA) ini berdasarkan hasil pola noda yang diidentifikasi dengan KLT sebelumnya, berikut adalah hasil KLT fraksi F5 dengan eluen kloroform:EA (5:5) yang diamati di bawah lampu UV pada λ 254 dan 366 nm.
Gambar 9. Kromatogram KLT fraksi F5 menggunakan eluen kloroform:EA (5:5)
F5 F5
Klorofom:etil asetat 5:5
λ 254 nm λ366 nm
33 Berdasarkan hasil KLT tersebut, pelarut campuran kloroform:EA digunakan sebagai eluen fase gerak pada fraksinasi menggunakan KKG. Sampel yang dipisahkan dielusi dengan menggunakan fase gerak berupa eluen dengan kepolaran bertingkat, yaitu n-heksan 100%, n-heksan:kloroform, kloroform 100%, kloroform:EA, EA 100%, aseton 100% dan metanol 100%. Analit hasil elusi pada KKG ditampung dalam botol vial. Tampungan analit hasil KKG diperoleh sebanyak 49 botol vial dan masing-masing fraksi tersebut digabungkan berdasarkan kesamaan noda pada plat KLT sehingga menghasilkan 10 fraksi (F5A – F5J) seperti pada Gambar 10.
Gambar 10. Kromatogram fraksi F5A-F5J hasil KKG (a) sebelum disemprot pereaksi AlCl3 (b) setelah disemprot pereaksi AlCl3
Hasil identifikasi menggunakan KLT dari fraksi F5A-F5J hasil KKG selanjutnya disemprot menggunakan pereaksi AlCl3 untuk mengetahui fraksi mana yang mengandung senyawa flavonoid. Hasilnya adalah fraksi F5D dan F5E masing-masing mengandung senyawa flavonoid, yang ditandai dengan munculnya warna kuning pada pola noda hasil KLT yang diamati pada lampu UV λ 366 nm.
Seluruh fraksi hasil KKG ditimbang untuk mengetahui massa masing-masing yang dapat dilihat pada Tabel 4.
Klorofom:aseton:MeOH 5:4:1
(a) (b)
λ 254 nm λ 366 nm
34 Tabel 4. Berat fraksi hasil KKG F5
Fraksi Berat (mg)
Fraksi F5D dilanjutkan untuk proses pemisahan selanjutnya karena mempunyai massa yang cukup banyak dan pola pemisahan noda pada KLT cukup sederhana. Pemisahan selanjutnya digunakan metode sentrifugal kromatografi dengan menggunakan alat kromatotron. Fraksi F5D dilakukan analisis dengan KLT untuk melihat eluen yang sesuai untuk proses kromatotron. Kromatogram hasil KLT terbaik dari fraksi F5D yang ditunjukkan pada Gambar 11.
Pemilihan kromatotron untuk pemisahan ini adalah karena pada hasil KLT (Gambar 11) menunjukkan pola noda yang cukup rapat. Pemisahan dengan metode kromatotron ini lebih cepat dan pelarut yang digunakan lebih sedikit dibandingkan menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Fasa diamnya berupa silika gel 60 F254 (seperti pada KLT) yang dilapisi pada plat kaca kuarsa dan untuk fasa gerak berupa pelarut yang sesuai dengan pola noda KLT.
35 Gambar 11. Kromatogram KLT fraksi F5D menggunakan eluenklo:aseton
Teknik pemisahan pada kromatotron menggunakan gaya sentrifugal dan gravitasi. Pemisahan dapat berlangsung lebih cepat karena adanya gaya sentrifugal yang akan mempercepat proses penyerapan pelarut yang membawa komponen yang dipisahkan (Atun, 2014). Selama jalannya proses elusi ini, plat kromatotron dimonitoring dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Analit hasil pemisahan dari kromatotron ditampung menggunakan botol vial, selanjutnya diamati menggunakan lampu UV untuk penggabungan fraksi.
Tampungan analit hasil kromatotron diperoleh sebanyak 35 botol vial dan menghasilkan 9 fraksi (F5D.1 – F5D.9) seperti pada Gambar 12.
Klorofom:aseton (6:4), (5:5), (4:6)
λ 254 nm λ 366 nm
36 Gambar 12. Kromatogram KLT fraksi F5D.1-F5D.9 hasil kromatotron
Seluruh fraksi hasil kromatotron ditimbang untuk mengetahui massa masing-masing yang dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Massa fraksi hasil kromatotron F5D
Fraksi Berat (mg) noda yang sederhana, terlihat seperti noda tunggal jika dilihat dibawah lampu UV λ 254 nm. Oleh karenanya, fraksi F5D.4 ini dilanjutkan untuk memperoleh hasil isolat senyawa murni. Proses pemisahan pada fraksi F5D.4 ini menggunakan metode KLT preparatif.
Klorofom:aseton 6:4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
λ 254 nm λ 366 nm
37 Metode KLT preparatif (KLTP) berguna untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh senyawa murni (isolat). Pemilihan metode KLTP ini dikarenakan fraksi yang akan dipisahkan massanya sangat kecil yaitu hanya 22,9 mg dan pola nodanya masih berdekatan, sehingga tidak disarankan untuk menggunakan metode KKG atau kromatotron karena dikhawatirkan sampel akan banyak terjerat pada silika atau hasil tampungan (analit) mengalami overlap dikarenakan pola noda yang hampir menumpuk sehingga akan cukup sulit untuk mendapatkan senyawa murni.
KLT preparatif dilakukan menggunakan plat KLT silika gel 60 F254 yang berukuran 10 x 10 cm dengan batas atas dan bawah masing-masing 1 cm dan chamber sebagai wadah penampung eluen. Sampel fraksi F5D.4 (22,9 mg) dilarutkan dengan pelarut aseton kemudian ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada batas bawah plat KLT sampai benar-benar habis tak bersisa. Selanjutnya dielusi menggunakan pelarut kloroform:aseton (9:1) sebanyak 3x elusi. Hasil identifikasi pola noda KLTP diamati dibawah lampu UV λ 254 nm dan 366 nm memperlihatkan ada 4 noda yang terbentuk pada plat KLT yang ditunjukkan pada Gambar 13.
Gambar 13. Hasil KLT preparatif di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm
Klorofom:aseton (9:1) (3x elusi)
Target Rf= 0,375
λ 254 nm λ 366 nm
38 Noda target yang mempunyai nilai Rf= 0,375 selanjutnya dikerok dan dilarutkan di dalam botol vial menggunakan pelarut aseton. Vial dikocok dengan kencang menggunakan vortex agar senyawa yang menempel pada silika dapat larut dalam pelarut aseton dan membentuk filtrat, selanjutnya vial disimpan selama ± 3 jam agar dapat larut sempurna. Selanjutnya, campuran disaring untuk memisahkan sampel yang berupa filtrat dengan silika gel hasil KLT preparatif.
Hasilnya, diperoleh fraksi F5D.4A berupa kristalputih dengan massa 3 mg.
Fraksi F5D.4A diuji kemurniannya menggunakan pelarut yang berbeda dari eluen pada KLT preparatif. Eluen yang digunakan adalah n-heksana:EA (2:8) dan dihasilkan noda tunggal dengan nilai Rf= 0,625 yang dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Uji kemurnian dengan eluen n-heksana:EA (2:8)
Uji kemurnian selanjutnya adalah menggunakan KLT 2 dimensi, yang bertujuan untuk membuktikan isolat yang diperoleh sudah murni dan tidak ada
n-heksana:EA (2:8)
F5D.4A F5D.4A
Rf= 0,625
λ 254 nm λ 366 nm
39 noda lain yang mempunyai Rf berbeda. Plat pada KLT 2D berukuran 5 x 5 cm danmenggunakan 2 jenis eluen yang berbeda sebagai fasa geraknya, yaitu (1) kloroform:aseton (7:3) dan (2) n-heksana:EA (2:8). Hasil KLT 2D bisa dilihat pada Gambar 15.
Gambar 15. Hasil KLT 2D fraksi F5D.4A
Berdasarkan hasil KLT 2D tersebut, pada pengelusian pertama menggunakan pelarut kloroform:aseton (7:3) menghasilkan noda tunggal dengan nilai Rf= 0,375 dan tidak ada noda lain dengan Rf yang berbeda. Selanjutnya plat KLT diputar ke kanan 90° dan dilakukan pengelusian kedua yang ditingkatkan kepolarannya dengan eluenn-heksana:EA (2:8) menghasilkan noda tunggal juga dengan nilai Rf lebih tinggi yaitu 0,875. Bercak noda tunggal yang dihasilkan
Pengelusian pertama
Pengelusian kedua
Rf= 0,375
Rf= 0,875
λ 254 nm λ 366 nm
40 pada KLT menandakan bahwa isolat yang diperoleh merupakan senyawa tunggal atau murni dan tidak ada campuran senyawa lain (Mathias et al., 1987).
Hasil uji kemurnian dengan KLT 2D menunjukkan bahwa fraksi F5D.4A memiliki spot noda tunggal dan merupakan senyawa murni yang berbentuk padatan berwarna putih dengan massa 3 mg. Isolat 1 ini selanjutnya dilakukan karakterisasi struktur molekulnya dengan menggunakan instrumen spektroskopi LCMS/MS dan1H-NMR.