BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.6 Metode DPPH Free Radical Scavenging
Metode DPPH umumnya digunakan untuk mengetahui efektivitas suatu antioksidan dalam menghambat radikal bebas. DPPH merupakan senyawa radikal yang dapat menyerap cahaya tampak (visible) pada panjang gelombang 517 nm.
Perubahan warna yang terjadi dikarenakan adanya reaksi antara DPPH dan
21 antioksidan yang nilai absorbansinya dapat diamati pada panjang gelombang 517 nm (Andina dan Musfirah, 2017).
Pengukuran uji aktivitas antioksidan menggunakan metode 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenger. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam persentase scavenging activity, yaitu kemampuan antioksidan untuk menghambat aktivitas radikal bebas. Persentase scavenging activity ini diperoleh dari perbedaan serapan antara blanko dengan sampel yang diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515 nm (Margaretta et al., 2011).
DPPH assay merupakan metode yang paling umum digunakan untuk mengetahui scavenging activity radikal bebas dari berbagai macam ekstrak tumbuhan, senyawa murni dan obat. DPPH merupakan radikal bebas stabil yang dapat memberikan warna ungu ketika dilarutkan dalam etanol dan mempunyai nilai absorbsi maksimal pada panjang gelombang 520 nm (Adam et al., 2011).
Antioksidan mengikat radikal bebas dengan mendonorkan hidrogen, warna ungu akan berubah menjadi lebih terang atau menjadi kuning yang menandakan telah terjadi reaksi peredaman radikal bebas oleh senyawa antioksidan (Li et al., 2009).
Nilai scavenging activity dari metode radikal DPPH pada ekstrak akar B.
macrophylla mempunyai potensi antioksidan yang kuat ditandai dengan nilai aktivitas antioksidan IC50 yang sangat rendah yaitu 4,73 µg/mL dan nilai tersebut dibandingkan dengan asam askorbat (5,89 µg/mL) yang merupakan antioksidan alami. Berdasarkan hasil tersebut dapat membuktikan bahwa ekstrak akar B. macrophylla mempunyai potensi sebagai antioksidan dengan nilai IC50 yang hampir serupa dengan asam askorbat (Adam et al., 2011).
22 Senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar, berbentuk kristal berwarna ungu dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam (Simanjuntak et al., 2004). Radikal bebas DPPH akan ditangkap oleh senyawa antioksidan oleh radikal bebas untuk mendapatkan pasangan elektron dan mengubahnya menjadi difenil pikrilhidrazin (Cholisoh dan Utami, 2008).
DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH (Simanjuntak et al., 2004; Cholisoh dan Utami, 2008). Senyawa DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) mempunyai visual berwarna ungu, radikal bebas dari DPPH akan ditangkap oleh senyawa antioksidan untuk mendapatkan pasangan elektron dan mengubahnya menjadi difenil pikrilhidrazin (DPPH-H) yang non-radikal berwarna bening kekuningan.Reaksi peredaman DPPH dengan senyawa antioksidan disajikan pada Gambar 5.
.
Gambar 5. Reaksi peredaman radikal bebas DPPH dengan antioksidan (Molyneux, 2004)
23 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2019 - Oktober 2020 di Laboratorium Penelitian Kimia Pusat Laboratorium Terpadu Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Kromatotron dilakukan di Laboratorium Kimia FSI Universitas Jenderal Achmad Yani. Karakteristisasi senyawa dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI PUSPIPTEK Serpong.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah berbagai alat gelas laboratorium, vacuum rotary evaporator, plat KLT, chamber, kolom kromatografi, kolom KVC dan vacuum, kromatotron, vorteks serta botol vial.
Instrumen yang digunakan adalah Spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S), spektroskopi 1H-NMR beroperasi pada 500 MHz (JEOL JN Meca), dan spektroskopi LCMS/MS (Xevo G2-XS QTOF).
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak metanol batang gandaria (B. macrophylla) dari penelitian Rudiana et al. (2020), berbagai pelarut organik grade teknis terdestilasi seperti metanol, etil asetat, aseton dan n-heksana, kloroform p.a (Merck), kapas, serbuk silika gel G60 (Merck) dan silika gel 60 F254
(Merck), DPPH (Himedia), kuersetin (Aldrich) dan alumunium (III) klorida.
24 3.3 Diagram Alir Penelitian
- 49 tampungan
Kromatografi Vakum Cair dengan kepolaran bertingkat
(n-Heksana 100%, n-Heksana:EA, EA 100%, EA:MeOH, MeOH 100%) Ekstrak metanol batang
gandaria (B. macrophylla)
Isolat murni (3 mg)
Karakterisasi senyawa dengan spektroskopi LCMS/MS dan 1H-NMR
Uji aktivitas antioksidan
Kromatografi kolom gravitasi secara gradien
(n-Heksana 100%, n-Heksana:kloroform, kloroform 100%, Kloroform:EA, EA 100%, aseton 100%, MeOH 100%)
Kromatografi lapis tipis (dipandu dengan AlCl3)
10 fraksi (F5A-F5J)
25 3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pemisahan Senyawa dari Ekstrak Metanol Batang Gandaria 3.4.1.1 Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Husna, 2015)
Plat KLT berukuran 1x5 cm diberi batas bawah setinggi 0,5 cm dan batas atas pada plat KLT setinggi 0,5 cm. Sampel ekstrak metanol dilarutkan dalam aseton hingga cair kemudian ditotolkan pada garis batas bawah plat KLT silika gel 60 F254 dengan bantuan pipa kapiler pada garis start. Sebanyak 2 mL eluen dengan perbandingan pelarut organik tertentu dimasukkan ke dalam chamber. Plat KLT yang telah diberi spot dimasukkan ke dalam chamber berisi eluen yang telah dijenuhkan, kemudian ditutup. Eluen dibiarkan naik hingga garis batas atas plat KLT. Plat KLT kemudian diambil, dikering udarakan dan diamati spot pada plat KLT di bawah lampu UV. Plat KLT kemudian disemprot dengan pereaksi AlCl3
untuk mengetahui senyawa yang terdapat pada masing-masing spot di plat KLT.
3.4.1.2 Metode Kromatografi Vakum Cair (Nuari et al., 2017)
Sampel ekstrak pekat metanol ditimbang dan ditambahkan silika gel 60 F254
dengan perbandingan 1:1, kemudian dilarutkan dengan aseton dan diaduk hingga homogen dan menjadi serbuk, tahap ini disebut impregnasi. Tahap selanjutnya adalah preparasi kolom. Silika gel 60 F254 dimasukkan ke dalam kolom, silika harus dipastikan rapat dan padat agar silika gel tidak terjadi cracking pada saat proses pemisahan berlangsung. Sampel yang sudah diimpregnasi dimasukkan kedalam kolom yang sudah diisi silika dan ditutup dengan kertas saring pada bagian bawah dan atas sampel. Elusi dilakukan secara gradien dengan meningkatkan kepolarannya dimulai dari n-heksana 100%, n-heksana:etil asetat, etil asetat 100%, etil asetat:metanol sampai metanol 100%. Hasil KVC ditampung
26 dalam botol vial 100 mL kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator dan dipantau dengan metode KLT (3.4.1.1) untuk melihat pola pemisahannya.
Pola noda yang sama kemudian disatukan menjadi sebuah fraksi.
3.4.1.3 Metode Kromatografi Kolom (Rudiana et al., 2019)
Kapas dimasukkan pada bagian bawah kolom kromatografi sebagai penahan penyerap. Silika gel G60 ditambahkan dengan n-heksana hingga diperoleh bubur silika. Bubur silika dimasukkan ke dalam kolom setinggi 2/3 dari panjang kolom.
Sampel diimpregnasi dengan silika gel dan dimasukkan ke dalam kolom penyerap sambil ditambahkan pelarut (permukaan penyerap tidak boleh sampai kering).
Proses ditunggu beberapa saat sampai pita-pita berwarna dihasilkan pada bubur silika. Analit yang dihasilkan ditampung ke dalam botol vial.Tampungan hasil kromatografi kolom dianalisis dengan KLT (3.4.1.1) untuk melihat pola hasil pemisahannya. Berdasarkan pola KLT, tampungan yang memiliki spot yang sama kemudian digabung menjadi 1 fraksi. Pemisahan dilanjutkan sampai diperoleh isolat flavonoid.
3.4.1.4 Metode Kromatotron (Agrawal dan Desai, 2015)
Fase diam dalam kromatotron berupa silika gel 60 F254 yang dibentuk menjadi piringan cakram. Proses pemisahan menggunakan kromatotron yaitu dengan cara sampel dilarutkan dengan eluen yang digunakan sebagai fase gerak yang diteteskan dengan menggunakan pipet tetes yang berbentuk seperti kran dan diatur kecepatan alirnya secara perlahan untuk dimasukkan ke dalam lubang pengaliran fase gerak, selanjutnya eluen berupa campuran pelarut organik dialirkan pada lubang tersebut dengan perbandingan secara gradien. Selama
27 jalannya proses elusi ini, plat kromatotron dimonitoring dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
3.4.1.5 Metode KLT Preparatif (Nuari et al., 2017)
Fraksi yang positif mengandung senyawa flavonoid selanjutnya dipreparatif.
Plat KLT yang digunakan pada KLT preparatif berukuran 10 x 10 cm dan fase gerak berupa eluen dengan perbandingan pelarut tertentu. Pita noda hasil KLTP yang diamati dibawah lampu UV ditandai dan dikerok. Hasil kerokan pita noda tersebut dilarutkan dalam pelarut aseton dan divorteks agar senyawa larut sempurna pada pelarut aseton. Larutan disaring untuk memisahkan endapan silika dengan filtrat larutan senyawa, selanjutnya dikeringkan sampai terbentuk padatan isolat.
3.4.1.6 Uji Kemurnian Isolat (Husna, 2015)
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan KLT 2 dimensi. Pengerjaan KLT 2 dimensi dilakukan dengan cara sampel ditotolkan pada lempeng 5x5 cm lalu dikembangkan dengan satu sistem eluen sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90o dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi eluen kedua sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak di bagian bawah sepanjang lempeng.
3.4.2 Karakterisasi Senyawa
3.4.2.1 Spektroskopi LCMS/MS (Rudiana et al, 2019)
Sampel diidentifikasi dengan cara melarutkan senyawa dalam metanol.
Larutan sampel sebanyak 1µL diinjeksikan ke dalam instrumen LCMS/MS Xevo G2-XS QTof dengan kolom C18 dan laju alir 0,3 mL/menit. Campuran 0,1%
28 asam format (FA) dalam air (WA) (0,1% FA:WA) dan asetonitril dalam 0,1%
asam format (Acetonitrile+0,1FA) digunakan sebagai fasa gerak dengan perbandingan yang berbeda-beda.
3.4.2.2 Spektroskopi 1H-NMR (Azkiyah, 2013)
Isolat murni ditimbang sebanyak 1 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL pelarut bebas proton yaitu aseton-d6. Larutan sampel isolat dimasukkan kedalam tabung injeksi kemudian diletakkan dalam spektrometer NMR.
3.4.3 Uji AktivitasAntioksidanMetode DPPH (Molyneux, 2004)
Sebanyak 2,5 mg sampel dilarutkan dengan 25 mL metanol (100 ppm) sebagai larutan induk. Larutan induk 100 ppm diencerkan menjadi konsentrasi 20;
10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 dan 0,3125 ppm. Masing-masing larutan sampel sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2 mL DPPH 0,002%.
Larutan sampel di-vorteks sampai homogen dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit dalam ruang gelap. Nilai absorbansi didapatkan dengan cara mengukur larutan sampel dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo). Larutan DPPH 0,002% bertindak sebagai blanko dan kuersetin sebagai kontrol positif.
Nilai persentase inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% Inhibisi = Ablanko − Asampel
Ablanko 𝑥 100%
Konsentrasi sebagai sumbu x dan %inhibisi sebagai sumbu y untuk memperoleh persamaan regresi linear. Nilai IC50 ditentukan menggunakan persamaan regresi linear y = ax + b, yaitu konsentrasi sampel yang dibutuhkan untuk mendapatkan persen inhibisi sebesar 50%.
29 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Senyawa dari Ekstrak Metanol Batang Gandaria (Bouea macrophylla Griff)
Isolasi senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak metanol batang B. macrophylla bertujuan untuk memperoleh senyawa murni (isolat) dari ekstrak metanol batang B. macrophylla. Ekstrak metanol batang B. macrophylla yang berwarna coklat tua sebanyak 37,96 gram dianalisis menggunakan KLT yang bertujuan untuk mencari eluen yang sesuai untuk pemisahan pada proses selanjutnya. Hasil KLT ekstrak kasar (crude extract) terbaik adalah menggunakan eluen n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 3:7 yang dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Kromatogram KLT ekstrak kasar (crude extract) metanol batang gandaria
Berdasarkan hasil kromatogram KLT tersebut, eluen n-heksana:EA digunakan sebagai eluen untuk tahap fraksinasi/pemisahan menggunakan KVC.
Fungsi fraksinasi menggunakan KVC adalah untuk memisahkan senyawa yang sangat beraneka ragam yang terkandung dalam sampel menjadi beberapa fraksi berdasarkan tingkat kepolarannya. Pemisahan menggunakan KVC ini
λ 254 nm λ366 nm
Tanpa lampu UV
30 menggunakan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Silika gel 60 F254 sebagai fase diam, dan fase gerak yang digunakan adalah perbandingan eluen pelarut organik dengan kepolaran yang bertingkat (n-heksana 100%, n-heksana:etil asetat, etil asetat 100%, etil asetat:metanol, metanol 100%). Fraksi hasil KVC dikumpulkan dalam botol vial dandidapatkan sebanyak 6 fraksi. Bobot masing-masing fraksi hasil KVC dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Berat fraksi hasil KVC
Fraksi Berat (g)
Masing-masing fraksi hasil KVC diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase gerak (eluen) n-heksana:etil asetat (2:8).
Identifikasi ini dilakukan untuk melihat pola pemisahan yang baik dari fraksi hasil KVC. Nilai faktor retensi (Rf) diperoleh dengan cara menghitung jarak noda yang ditempuh oleh senyawa dibagi jarak yang ditempuh oleh eluen (fase gerak). Nilai Rf spesifik pada suatu senyawa dengan menggunakan eluen tertentu. Hal itu dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya variasi senyawa dalam sampel yang diuji. Jika senyawa mempunyai nilai Rf lebih besar berarti kepolarannya tinggi, begitu juga sebaliknya (Dewi et al., 2015). Hasil KLT dari 6 fraksi KVC dapat dilihat pada Gambar 7.
31 Gambar 7. Kromatogram KLT fraksi KVC (F1-F6)
Hasil KLT 6 fraksi KVC disemprot menggunakan pereaksi semprot AlCl3
5% yang bertujuan untuk meningkatkan kepekaan dalam mendeteksi spot noda flavonoid pada plat KLT. Larutan AlCl3 bila disemprotkan pada plat KLT akan terlihat spot noda kuning tanpa perlu diamati di bawah sinar UV (366 nm), yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Markham, 1988). Reaksi antara flavonoid dan AlCl3 dapat dilihat pada Gambar 8.
O
Gambar 8. Reaksi antara flavonoid dan AlCl3 (Markham, 1988)
Berdasarkan hasil KLT yang diamati pada lampu UV panjang gelombang 254 nm dan 366 nm (Gambar 7), menunjukkan bahwa spot noda yang terdapat pada fraksi F1-F4 merupakan senyawa nonpolar karena dapat terelusi dengan tinggi menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:8), sedangkan pada fraksi F5 dan F6 diduga terdapat senyawa polar karena spot noda setelah dielusi dengan eluen n-heksana:etil asetat (2:8) masih tertahan di bawah. Setelah disemprot
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F1 F2 F3 F4 F5 F6 Senyawa target
λ 254 nm λ366 nm
n-Heksana:EA (2:8) n-Heksana:EA (2:8)
32 menggunakan pereaksi AlCl3, fraksi F5 diduga terdapat senyawa target yaitu flavonoid, karena menunjukkan spot noda berwarna kuning ketika diamati di bawah sinar UV 366 nm.
Fraksi F5 (1,1693 g) selanjutnya dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Fraksinasi menggunakan KKG berfungsi untuk memisahkan senyawa bahan alam yang masih bercampur pada fraksi hasil KVC sebelumnya. Campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas fase diam berupa silika gel G60 yang berada dalam tabung kaca (kolom). Fase gerak yang merupakan campuran pelarut organik (eluen) dibiarkan mengalir melalui kolom yang disebabkan oleh gaya gravitasi bumi(Gritter et al., 1991).
Fase gerak yang digunakan berupa campuran pelarut kloroform:etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (gradien). Pemilihan eluen kloroform:etil asetat (EA) ini berdasarkan hasil pola noda yang diidentifikasi dengan KLT sebelumnya, berikut adalah hasil KLT fraksi F5 dengan eluen kloroform:EA (5:5) yang diamati di bawah lampu UV pada λ 254 dan 366 nm.
Gambar 9. Kromatogram KLT fraksi F5 menggunakan eluen kloroform:EA (5:5)
F5 F5
Klorofom:etil asetat 5:5
λ 254 nm λ366 nm
33 Berdasarkan hasil KLT tersebut, pelarut campuran kloroform:EA digunakan sebagai eluen fase gerak pada fraksinasi menggunakan KKG. Sampel yang dipisahkan dielusi dengan menggunakan fase gerak berupa eluen dengan kepolaran bertingkat, yaitu n-heksan 100%, n-heksan:kloroform, kloroform 100%, kloroform:EA, EA 100%, aseton 100% dan metanol 100%. Analit hasil elusi pada KKG ditampung dalam botol vial. Tampungan analit hasil KKG diperoleh sebanyak 49 botol vial dan masing-masing fraksi tersebut digabungkan berdasarkan kesamaan noda pada plat KLT sehingga menghasilkan 10 fraksi (F5A – F5J) seperti pada Gambar 10.
Gambar 10. Kromatogram fraksi F5A-F5J hasil KKG (a) sebelum disemprot pereaksi AlCl3 (b) setelah disemprot pereaksi AlCl3
Hasil identifikasi menggunakan KLT dari fraksi F5A-F5J hasil KKG selanjutnya disemprot menggunakan pereaksi AlCl3 untuk mengetahui fraksi mana yang mengandung senyawa flavonoid. Hasilnya adalah fraksi F5D dan F5E masing-masing mengandung senyawa flavonoid, yang ditandai dengan munculnya warna kuning pada pola noda hasil KLT yang diamati pada lampu UV λ 366 nm.
Seluruh fraksi hasil KKG ditimbang untuk mengetahui massa masing-masing yang dapat dilihat pada Tabel 4.
Klorofom:aseton:MeOH 5:4:1
(a) (b)
λ 254 nm λ 366 nm
34 Tabel 4. Berat fraksi hasil KKG F5
Fraksi Berat (mg)
Fraksi F5D dilanjutkan untuk proses pemisahan selanjutnya karena mempunyai massa yang cukup banyak dan pola pemisahan noda pada KLT cukup sederhana. Pemisahan selanjutnya digunakan metode sentrifugal kromatografi dengan menggunakan alat kromatotron. Fraksi F5D dilakukan analisis dengan KLT untuk melihat eluen yang sesuai untuk proses kromatotron. Kromatogram hasil KLT terbaik dari fraksi F5D yang ditunjukkan pada Gambar 11.
Pemilihan kromatotron untuk pemisahan ini adalah karena pada hasil KLT (Gambar 11) menunjukkan pola noda yang cukup rapat. Pemisahan dengan metode kromatotron ini lebih cepat dan pelarut yang digunakan lebih sedikit dibandingkan menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Fasa diamnya berupa silika gel 60 F254 (seperti pada KLT) yang dilapisi pada plat kaca kuarsa dan untuk fasa gerak berupa pelarut yang sesuai dengan pola noda KLT.
35 Gambar 11. Kromatogram KLT fraksi F5D menggunakan eluenklo:aseton
Teknik pemisahan pada kromatotron menggunakan gaya sentrifugal dan gravitasi. Pemisahan dapat berlangsung lebih cepat karena adanya gaya sentrifugal yang akan mempercepat proses penyerapan pelarut yang membawa komponen yang dipisahkan (Atun, 2014). Selama jalannya proses elusi ini, plat kromatotron dimonitoring dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Analit hasil pemisahan dari kromatotron ditampung menggunakan botol vial, selanjutnya diamati menggunakan lampu UV untuk penggabungan fraksi.
Tampungan analit hasil kromatotron diperoleh sebanyak 35 botol vial dan menghasilkan 9 fraksi (F5D.1 – F5D.9) seperti pada Gambar 12.
Klorofom:aseton (6:4), (5:5), (4:6)
λ 254 nm λ 366 nm
36 Gambar 12. Kromatogram KLT fraksi F5D.1-F5D.9 hasil kromatotron
Seluruh fraksi hasil kromatotron ditimbang untuk mengetahui massa masing-masing yang dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Massa fraksi hasil kromatotron F5D
Fraksi Berat (mg) noda yang sederhana, terlihat seperti noda tunggal jika dilihat dibawah lampu UV λ 254 nm. Oleh karenanya, fraksi F5D.4 ini dilanjutkan untuk memperoleh hasil isolat senyawa murni. Proses pemisahan pada fraksi F5D.4 ini menggunakan metode KLT preparatif.
Klorofom:aseton 6:4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
λ 254 nm λ 366 nm
37 Metode KLT preparatif (KLTP) berguna untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh senyawa murni (isolat). Pemilihan metode KLTP ini dikarenakan fraksi yang akan dipisahkan massanya sangat kecil yaitu hanya 22,9 mg dan pola nodanya masih berdekatan, sehingga tidak disarankan untuk menggunakan metode KKG atau kromatotron karena dikhawatirkan sampel akan banyak terjerat pada silika atau hasil tampungan (analit) mengalami overlap dikarenakan pola noda yang hampir menumpuk sehingga akan cukup sulit untuk mendapatkan senyawa murni.
KLT preparatif dilakukan menggunakan plat KLT silika gel 60 F254 yang berukuran 10 x 10 cm dengan batas atas dan bawah masing-masing 1 cm dan chamber sebagai wadah penampung eluen. Sampel fraksi F5D.4 (22,9 mg) dilarutkan dengan pelarut aseton kemudian ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada batas bawah plat KLT sampai benar-benar habis tak bersisa. Selanjutnya dielusi menggunakan pelarut kloroform:aseton (9:1) sebanyak 3x elusi. Hasil identifikasi pola noda KLTP diamati dibawah lampu UV λ 254 nm dan 366 nm memperlihatkan ada 4 noda yang terbentuk pada plat KLT yang ditunjukkan pada Gambar 13.
Gambar 13. Hasil KLT preparatif di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm
Klorofom:aseton (9:1) (3x elusi)
Target Rf= 0,375
λ 254 nm λ 366 nm
38 Noda target yang mempunyai nilai Rf= 0,375 selanjutnya dikerok dan dilarutkan di dalam botol vial menggunakan pelarut aseton. Vial dikocok dengan kencang menggunakan vortex agar senyawa yang menempel pada silika dapat larut dalam pelarut aseton dan membentuk filtrat, selanjutnya vial disimpan selama ± 3 jam agar dapat larut sempurna. Selanjutnya, campuran disaring untuk memisahkan sampel yang berupa filtrat dengan silika gel hasil KLT preparatif.
Hasilnya, diperoleh fraksi F5D.4A berupa kristalputih dengan massa 3 mg.
Fraksi F5D.4A diuji kemurniannya menggunakan pelarut yang berbeda dari eluen pada KLT preparatif. Eluen yang digunakan adalah n-heksana:EA (2:8) dan dihasilkan noda tunggal dengan nilai Rf= 0,625 yang dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Uji kemurnian dengan eluen n-heksana:EA (2:8)
Uji kemurnian selanjutnya adalah menggunakan KLT 2 dimensi, yang bertujuan untuk membuktikan isolat yang diperoleh sudah murni dan tidak ada
n-heksana:EA (2:8)
F5D.4A F5D.4A
Rf= 0,625
λ 254 nm λ 366 nm
39 noda lain yang mempunyai Rf berbeda. Plat pada KLT 2D berukuran 5 x 5 cm danmenggunakan 2 jenis eluen yang berbeda sebagai fasa geraknya, yaitu (1) kloroform:aseton (7:3) dan (2) n-heksana:EA (2:8). Hasil KLT 2D bisa dilihat pada Gambar 15.
Gambar 15. Hasil KLT 2D fraksi F5D.4A
Berdasarkan hasil KLT 2D tersebut, pada pengelusian pertama menggunakan pelarut kloroform:aseton (7:3) menghasilkan noda tunggal dengan nilai Rf= 0,375 dan tidak ada noda lain dengan Rf yang berbeda. Selanjutnya plat KLT diputar ke kanan 90° dan dilakukan pengelusian kedua yang ditingkatkan kepolarannya dengan eluenn-heksana:EA (2:8) menghasilkan noda tunggal juga dengan nilai Rf lebih tinggi yaitu 0,875. Bercak noda tunggal yang dihasilkan
Pengelusian pertama
Pengelusian kedua
Rf= 0,375
Rf= 0,875
λ 254 nm λ 366 nm
40 pada KLT menandakan bahwa isolat yang diperoleh merupakan senyawa tunggal atau murni dan tidak ada campuran senyawa lain (Mathias et al., 1987).
Hasil uji kemurnian dengan KLT 2D menunjukkan bahwa fraksi F5D.4A memiliki spot noda tunggal dan merupakan senyawa murni yang berbentuk padatan berwarna putih dengan massa 3 mg. Isolat 1 ini selanjutnya dilakukan karakterisasi struktur molekulnya dengan menggunakan instrumen spektroskopi LCMS/MS dan1H-NMR.
4.2 Karakterisasi Senyawa Isolat 1
4.2.1 Hasil Analisis Spektroskopi LCMS/MS
Isolat 1 (3 mg) dianalisis dengan menggunakan spektroskopi LCMS/MS untuk mengetahui puncak area, bobot molekul serta kemurnian senyawa dalam fraksi tersebut. Jika spektrum hasil LCMS/MS menghasilkan puncak tunggal maka dapat dikatakan senyawa pada fraksi tersebut sudah murni, namun jika masih terdapat beberapa puncak area dengan waktu retensi (Rt) yang berbeda menunjukkan bahwa fraksi masih memiliki campuran beberapa senyawa.
Hasil karakterisasi dengan LCMS/MS pada isolat 1 dengan ionisasi ESI positif [M+H]+ diperoleh 1 puncak area dengan waktu retensi (Rt) tertentu.
Berikut adalah data kromatogram LCMS/MS isolat 1 dapat dilihat pada Gambar 16.
41 Gambar 16. Kromatogram LCMS/MS isolat 1
Pada Gambar 16 terlihat bahwa isolat 1 memiliki satu puncak tunggal yang muncul pada waktu retensi 5,19 menit. Kromatogram LCMS/MS isolat1 yang dideteksi dengan spektroskopi massa menghasilkan spektrum MS yang dapat dilihat pada Lampiran 1. Hasil analisis data LCMS/MS diolah dengan software UNIFI, kemudian hasil dugaan senyawa dibandingkan dengan menggunakan database pubchem untuk melihat struktur molekul senyawa yang diperoleh dengan melihat bobot molekul dari hasil spektrum LCMS/MS. Adapun perkiraan senyawa yang terdapat pada isolat 1 dari hasil analisa LCMS/MS dapat dilihat pada Tabel 6.
Senyawa tunggal
42 Tabel 6. Hasil analisis LCMS/MS pada isolat1
No. Rt
(menit) [M+H]+ Mr Rumus
Molekul Dugaan senyawa 1 5,19 273,0758 272,06847 C15H12O5
4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon (10)
Kromatogram yang dihasilkan menunjukkan hanya terdapat 1 puncak, hal tersebut menandakan bahwa isolat 1 sudah murni (berupa senyawa tunggal). Hasil puncak pada kromatogram isolat 1 diidentifikasi pada waktu retensi 5,19 menit dengan rumus molekul C15H12O5 dan mempunyai bobot molekul sebesar 272 g/mol yang diperkirakan merupakan senyawa turunan genistein, yaitu senyawa metabolit sekunder golongan flavonoid (Singh et al., 2020).
Setelah mengetahui rumus molekul dan bobot molekul dari senyawa isolat 1, selanjutnya senyawa tersebut dilihat pola fragmentasinya untuk memperkuat dugaan senyawa yang terkandung di dalamnya. Fragmentasi suatu molekul menyebabkan pola
Setelah mengetahui rumus molekul dan bobot molekul dari senyawa isolat 1, selanjutnya senyawa tersebut dilihat pola fragmentasinya untuk memperkuat dugaan senyawa yang terkandung di dalamnya. Fragmentasi suatu molekul menyebabkan pola