BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Gandaria (Bouea macrophylla Griff)
Gandaria merupakan tumbuhan yang berasal dari Sumatera Utara, Jawa Barat (Indonesia), Peninsular (Malaysia), dan juga dapat tumbuh di Thailand.
Gandaria (Bouea macrophylla Griff) merupakan famili Anacardiaceae. Tumbuhan ini mempunyai buah yang cukup populer di negara Thailand.
Pohon gandaria (Gambar 1) dapat mencapai tinggi 27 m, dengan warna batang coklat cerah, dan daun yang hijau. Daunnya dapat mencapai panjang 45 cm dengan lebar 13 cm, tetapi umumnya lebih kecil (Subhadrabandhu, 2001).
Morfologi dari batang pohon gandaria ini memiliki tinggi mencapai 27 meter.
Batang pohon tanaman gandaria memiliki tajuk yang membulat, untaiannya atau cabangnya pun juga sangat banyak sehingga pohon ini dapat terasa rimbun.
Pertumbuhan batang pohon gandaria ini sangatlah lambat. Oleh karenanya, tanaman gandaria ini merupakan salah satu tanaman yang langka untuk saat ini.
Berikut adalah taksonomi tumbuhan Gandaria (Heyne, 1987) Kerajaan : Plantae
Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Sapindales Famili : Anacardiaceae Genus : Bouea
Spesies : Bouea macrophylla
Tumbuhan gandaria dapat tumbuh di berbagai negara dengan istilah nama yang berbeda-beda. Di Indonesia dinamakan tumbuhan ramania atau gandaria, di
7 Malaysia dinamakan tumbuhan kundang, dan di Thailand dinamakan tumbuhan maprang (Khoo et al., 2016).
Gambar 1. Tumbuhan gandaria (Subhadrabandhu, 2001)
Gandaria disebut dengan berbagai nama berbeda di Indonesia, seperti gandoriah (Minangkabau), barania (Dayak), jatake, gandaria (Sunda), buwamelawe (Bugis), dan gondariya (Jawa). Pemanfaatan tumbuhan ini masih sangat terbatas. Kayu gandaria banyak digunakan untuk membuat alat pertanian, daun muda dapat digunakan sebagai salad, buahnya dapat dikonsumsi untuk dibuat salad, acar dan jus, serta digunakan sebagai pengganti jus lemon atau asam jawa (Isnawati, 2012). Buah B. macrophylla mirip seperti mangga namun ukurannya lebih kecil, buah ini biasa dikonsumsi oleh masyarakat Malaysia (Rajan dan Bhat, 2014). Kurangnya pemanfaatan tumbuhan ini karena keterbatasan studi tentang B. macrophylla.
Novalianti (2006) telah melakukan uji fitokimia kulit batang tumbuhan gandaria, diketahui bahwa kulit batang tumbuhan gandaria mengandung senyawa fenolik dan flavonoid. Berdasarkan hasil penelitian tersebut, diketahui bahwa
8 fraksi etil asetat kulit batang memiliki potensi untuk dilakukan penelitian lebih lanjut guna mengisolasi senyawa golongan fenolik lainnya.
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Adam et al. (2011), menunjukkan bahwa ekstrak daun B. macrophylla mengandung beberapa senyawa fitokimia penting seperti antrakuinon, terpenoid, flavonoid, tanin, alkaloid, steroid, triterpenoid, fenol, kumarin, karbohidrat, dan protein. Penemuan ini mengindikasikan bahwa tumbuhan ini memiliki potensial yang tinggi untuk dijadikan agen farmasi yang baru.
Rudiana et al. (2018) telah melakukan analisis total fenolik dan flavonoid dari ekstrak batang B. macrophylla dengan pelarut n-heksana, etil asetat dan metanol. Hasil analisis total fenolik dan flavonoid dapat dilihat pada Tabel 1 di bawah ini.
Tabel 1. Hasil analisis total fenolik dan flavonoid dari ekstrak batang B. macrophylla
Ekstrak Total fenolik (mg GAE/g)
Sumber: Rudiana et al. (2018)
Berdasarkan Tabel 1, ekstrak etil asetat memiliki nilai total fenolik dan flavonoid paling besar. Etil asetat memiliki polaritas semipolar sehingga senyawa senyawa golongan fenolik dan flavonoid banyak terekstrak pada pelarut etil asetat. Fenolik dan flavonoid memiliki sifat kepolaran mendekati etil asetat karena memiliki gugus benzena yang bersifat nonpolar dan gugus hidroksi yang memberikan sifat polar (Rudiana et al., 2018). Menurut Ghasemzadeh dan Ghasemzadeh (2011), senyawa fenolik dan flavonoid berperan penting dalam menangkal radikal bebas, khususnya senyawa DPPH.
9 2.2 Flavonoid
Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok fenol terbesar yang ditemukan di alam yang tersusun atas 15 buah atom karbon dengan dua cincin aromatik yang dihubungkan dengan sebuah jembatan 3 buah karbon, sehingga membentuk susunan C6-C3-C6. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru dan sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan.
Bergantung pada posisi ikatan dari cincin aromatik benzena pada rantai penghubung tersebut, kelompok flavonoid dibagi menjadi 3 kelas utama, flavonoid, isoflavonoid, dan neoflavonoid (Grotewold, 2006).
O
O O
(1) (2) (3)
Gambar 2. Struktur umum flavonoid (1), isoflavonoid (2), dan neoflavonoid (3) (Grotewold, 2006).
Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang ditemukan di tumbuhan yang sangat melimpah di alam. Senyawa flavonoid berperan penting bagi tanaman untuk pertumbuhan dan perkembangannya. Fungsi tersebut diantaranya sebagai stimulan fiksasi nitrogen pada bakteri Rhizobium, penarik perhatian hewan pada proses penyerbukan dan penyebaran benih, resorpsi nutrisi dan mineral dari proses penuaan daun, serta peningkat pertumbuhan tabung serbuk sari. Senyawa flavonoid juga dipercaya dapat berperan sebagai alat pertahanan tanaman dari serangan serangga atau hewan herbivora dan juga penyebab penyakit, serta dapat membentuk dasar untuk melakukan interaksi
10 alelopati antar tanaman (Andersen dan Markham, 2006). Selain itu, senyawa flavonoid memiliki aktivitas antioksidan yang cukup tinggi (Zuhra et al., 2008).
Okothet al. (2013) telah melakukan penelitian tentang isolasi senyawa golongan flavonoid dari batang dan akar Lannea alata. Isolasi dari akar L.Alata menghasilkan 4 senyawa golongan flavonoid, dimana 2 di antaranya adalah senyawa baru flavonoid terprenilasi, yaitu lanneaflavonol (4) dan dihidrolanneaflavonol (5), dan 2 senyawa yang lain adalah senyawa flavonoid yang sudah diketahui sebelumnya, yaitu miricetin-3-O-α-ramnopiranosida (miricitrin) (6) dan miricetin-3-O-α-arabinofuranosida (betmidin) (7). Struktur dari masing-masing senyawa flavonoid tersebut disajikan pada Gambar 3 di bawah ini.
Gambar 3. Struktur lanneaflavonol (4), dihidrolanneaflavonol (5), miricitrin (6), dan betmidin (7) (Okoth et al., 2013)
11 Persentase aktivitas peredaman radikal bebas untuk glikosida flavonol hasil isolasi dibandingkan dengan asam askorbat yang merupakan antioksidan alami.
Urutan nilai % penghambatan radikal bebas dari senyawa flavonoid yang didapatkan dari hasil isolasi adalah senyawa 7>6>4>5. Hal ini sesuai dengan gagasan bahwa glikosida dapat menghasilkan radikal hidrogen ekstra karena jumlah gugus hidroksil bebas yang lebih banyak, mampu meredam radikal bebas lebih baik daripada aglikon.
Rudiana et al. (2019) telah melakukan penelitian tentang karakterisasi senyawa flavonoid yang terdapat pada ekstrak etil asetat batang gandaria (Bouea macrophylla Griff). Pelarut etil asetat digunakan karena menurut penelitian sebelumnya dari Rudiana et al. (2018), ekstrak etil asetat batang B. macrophylla memiliki nilai aktivitas antioksidan paling baik dibandingkan ekstrak n-heksana dan metanol, yaitu sebesar 4,89 ppm. Berdasarkan hasil karakterisasi fraksi aktif ekstrak etil asetat batang B. macrophylla, menunjukkan adanya 2 senyawa golongan flavonoid yaitu naringenin (8) dan luteolin (9), yang strukturnya dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 4. Struktur senyawa naringenin (8) dan luteolin (9) (Rudiana et al., 2019)
Fraksi aktif ekstrak etil asetat batang B. macrophylla yang mengandung senyawa naringenin dan luteolin memiliki aktivitas antioksidan yang potensial
12 dengan nilai IC50 sebesar 2,13 ppm dan lebih kuat dibandingkan dengan senyawa asam askorbat (vitamin C) sebagai kontrol positif, yaitu sebesar 2,22 ppm.
2.3 Metode Isolasi Senyawa Flavonoid
Flavonoid merupakan senyawa polar karena memiliki sejumlah gugus hidroksil yang tidak tersubstitusi. Pelarut polar seperti etanol, metanol, atau campuran dari pelarut tersebut dapat digunakan untuk mengekstrak flavonoid dari jaringan tumbuhan (Rijke, 2005).
Isolasi senyawa aktif metabolit sekunder dari suatu tanaman, dapat dilakukan dengan ekstraksi. Dalam proses ekstraksi ini, senyawa metabolit sekunder akan terlarut oleh zat penyari yang sesuai sifat kepolarannya. Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti sifat dari bahan mentah obat, daya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi dan kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna (Sjahid, 2008).
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan senyawa yang didasarkan atas perbedaan laju perpindahan dari komponen dalam campuran. Pemisahan dengan metode kromatografi dilakukan dengan memanfaatkan sifat fisik dari komponen campuran tersebut, seperti kelarutan, adsorbsi, dan kepolaran (Skoog et al., 2014).
2.3.1 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan jenis kromatografi padat cair yang menggunakan bahan padat sebagai fasa diam dan pelarut sebagai fasa geraknya. Fasa diam yang terdiri dari bahan berbutir-butir ditempatkan dalam penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang
13 akan dipisahkan, yang berupa larutan, kemudian ditotolkan pada plat KLT (fasa diam). Plat diletakkan dalam bejana tertutup yang telah terisi larutan eluen (fasa gerak). Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan laju alir dari senyawa terhadap fasa diamnya. Senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan di bawah sinar UV atau disemprotkan larutan alumunium klorida (Stahl, 1985). Eluen yang umum digunakan untuk memisahkan senyawa flavonoid di antaranya butanol-asam asetat-air (Markham, 1988).
Penggunaan KLT untuk isolasi senyawa flavonoid juga dapat dipandu dengan pereaksi semprot, salah satu diantaranya adalah dengan larutan AlCl3 5%.
Pemakaian pereaksi semprot berguna untuk meningkatkan kepekaan mendeteksi bercak flavonoid pada plat KLT. Larutan AlCl3 bila disemprotkan pada KLT yang selanjutnya dikeringkan, menunjukkan semua 5-hidroksi-flavonoid sebagai bercak berfluoresensi kuning bila dilihat di bawah sinar UV (366 nm). Selain itu, bercak yang semula tak tampak pada plat KLT akan menjadi terlihat seperti warna kuning (Markham, 1988).
Senyawa flavonoid jika bereaksi dengan AlCl3 akan membentuk kelat logam antara gugus hidroksil (-OH) dan karbonil (C=O) yang bertetangga dan membentuk kompleks tak tahan asam dengan gugus orto-dihidroksil, dengan adanya kelat logam ini akan menimbulkan warna yang berpendar ketika dideteksi di bawah sinar UV (Markham, 1988).
2.3.2 Kromatografi Vakum Cair
Kromatografi vakum cair (KVC) digunakan untuk fraksinasi ekstrak total secara cepat. Metode ini dilakukan dengan menggunakan kolom kromatografi yang dihubungkan dengan pompa vakum. Fase diam yang digunakan adalah sama
14 seperti pada KLT yaitu silika gel 60 F254, dan fase gerak yang digunakan adalah eluen campuran pelarut organik dari yang non-polar secara bertahap ke yang polar. Hasil pemisahan dari KVC merupakan fraksi-fraksi yang dapat dikelompokkan menjadi kelompok senyawa non-polar, semi-polar, dan polar (Atun, 2014).
Penggunaan vakum ini bertujuan agar laju alir eluen meningkat sehingga meminimalisir terjadinya proses difusi karena ukuran silika gel yang halus yaitu sekitar 200-400 mesh (Gibbons, 2012). Kromatografi vakum cair merupakan modifikasi dari kromatografi kolom gravitasi. Metode ini biasanya digunakan untuk fraksinasi sampel dalam jumlah besar (10-50 g). Kolom yang digunakan biasanya terbuat dari gelas dengan lapisan berpori pada bagian bawah. Kolom disambungkan dengan penampung eluen yang dihubungkan dengan pompa vakum. Pompa vakum akan menghisap eluen dalam kolom, sehingga proses pemisahan berlangsung lebih cepat (Atun, 2014).
2.3.3 Kromatografi Kolom Gravitasi
Kromatografi kolom gravitasi (KKG) merupakan jenis kromatografi padat cair berdasarkan serapan yang dilakukan di dalam kolom (fasa diam), metode ini merupakan metode yang paling banyak digunakan dan terbaik dalam pemisahan campuran dalam jumlah besar. Campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas penyerap (fasa diam) yang berada dalam tabung kaca (kolom). Fasa gerak yang merupakan campuran pelarut (eluen) dibiarkan mengalir melalui kolom yang disebabkan oleh gaya gravitasi bumi. Senyawa yang terlarut akan bergerak melalui kolom dengan laju berbeda, perbedaan laju dikarenakan adanya interaksi antara senyawa terlarut, penyerap (fasa diam), dan pelarut (fasa gerak).
15 Hasil pemisahan kemudian dikumpulkan berupa fraksi-fraksi pada saat keluar dari bawah kolom (Gritter et al., 1991).
2.3.4 Kromatotron
Kromatotron atau kromatografi sentrifugal merupakan metode kromatografi yang teknik pemisahannya menggunakan gaya sentrifugal dan gravitasi sekaligus.
Metode ini menggunakan silika gel 60 F254 berpendar sebagai fase diamnya.
Prinsip pemisahan dengan kromatotron sama seperti kromatografi yang lainnya, akan tetapi proses pemisahan menggunakan kromatotron akan berlangsung lebih cepat karena adanya gaya sentrifugal yang akan mempercepat proses penyerapan pelarut yang membawa komponen yang dipisahkan (Atun, 2014).
Fase gerak ditambahkan dengan laju alir yang konstan. Saat fase gerak terelusi akan membawa sampel secara bersamaan sehingga menghasilkan pola noda dari komponen yang terpisah. Komponen yang terpisah kemudian ditampung dari tepi rotor bersama dengan fase gerak (Agrawal dan Desai, 2015).
2.4 Karakterisasi Senyawa Flavonoid 2.4.1 Spektroskopi LCMS/MS
Liquid chromatography-Mass spectroscopy (LCMS) merupakan kombinasi metode analisis yang lebih spesifik antara kromatografi dan spektroskopi massa.
Data hasil analisis LCMS digunakan untuk menentukan: bobot molekul (BM), struktur, identitas dan kuantitas dari sampel tertentu. Instrumen LCMS sangat sensitif dan selektif (spektrum massa dari setiap senyawa bersifat unik dan spesifik) dan bisa dijadikan sebagai “finger print” dalam analisis (Eichhorn dan Knepper, 2001).
16 Pemisahan-pemisahan di dalam kolom terjadi atas dasar kepolaran yang berbeda-beda, sehingga kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam akan berpengaruh. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya terhadap fase diam akan keluar terlebih dahulu dari kolom (Skoog et al., 1991)
Sampel yang telah terpisah dengan liquid chromatography (LC) diidentifikasi berat molekulnya menggunakan mass spectroscopy (MS).
Spektroskopi massa merupakan teknik analisis instrumen yang mempunyai prinsip dasar pemisahan ion-ion sesuai dengan perbandingan massa dengan muatan (m/z) dan pengukuran intensitas dari ion-ion tersebut (Khopkar, 2002).
Spektrometer massa pada umumnya digunakan untuk (Dachriyanus, 2004):
a. Menentukan massa suatu molekul.
b. Menentukan rumus molekul dengan menggunakan spektrum massa beresolusi tinggi (High Resolution Mass Spectra).
c. Mengetahui informasi dari struktur dengan melihat pola fragmentasinya.
Kelebihan utama dari spektroskopi massa bila dibandingkan dengan sebagian besar cara fisika lain adalah cuplikan yang diperlukan untuk analisis hanya beberapa sub-miligram saja, jadi metode ini cocok digunakan untuk analisis senyawa yang jumlah zatnya sedikit sekali. Spektrum massa terdiri atas sederetan sinyal yang masing-masing menunjukkan pecahan flavonoid induk yang bermuatan, yang terbentuk karena tumbukan elektron dalam spektrometer. Sinyal terlihat sebagai sederetan garis spektrum atau sebagai bentuk numerik dan tersusun berdasarkan bobot molekul, atau lebih tepatnya bobot molekul per muatan (m/z) dari pecahan molekul yang ditunjukkannya (Markham, 1988).
17 Tujuan utama pada interpretasi data spektrum massa flavonoid adalah untuk mengidentifikasi ion molekul utuh atau ion induk (M+) dan kemudian menghubungkannya dengan fragmen-fragmen yang terbentuk. Hal ini dilakukan dengan memperhatikan bobot molekul ion induk dan fragmentasi molekul serta alur pola fragmentasi yang telah diketahui. Ion molekul (M+) biasanya tampak berupa puncak (peak) utama pada spektrum massa aglikon. Penentuan struktur molekul flavonoid dapat dilihat dari nilai M+ yang muncul pada spektrum massa.
Flavon, isoflavon dan auron mempunyai bobot molekul 222; flavon dan calkon berbobot molekul 224; flavonol 238; dan dihidroflavonol 240. Untuk setiap gugus –OH harus ditambahkan 16 satuan massa, untuk gugus –OCH3 ditambahkan 30 satuan massa, dan untuk gugus –OCD3 ditambahkan 33 satuan massa (Markham, 1988).
2.4.2 Spektroskopi 1H-NMR
NMR adalah teknik analisis yang didasarkan pada penyerapan gelombang radio oleh inti-inti tertentu dalam molekul organik, apabila molekul tersebut berada dalam medan magnet yang kuat. Radiasi sampel oleh sinar gelombang radio menyebabkan inti-inti atom pada sampel mengalami transisi (resonansi) magnetik antar berbagai tingkat keadaan (Syah, 2016).
Menurut Sastrohamidjojo (1991), ada beberapa informasi yang didapatkan dari spektrum 1H-NMR, antara lain:
1. Jumlah sinyal: Berapa banyak jenis hidrogen dalam molekul.
2. Posisi sinyal (chemical shift): Jenis hidrogen.
3. Daerah relatif di bawah sinyal (integrasi): Berapa banyak hidrogen dari setiap jenis.
18 4. Pola pemisahan (splitting pattern): Berapa banyak hidrogen tetangga.
MenurutMarkham (1988), penggunaan spektroskopi 1H-NMR dalam karakterisasi flavonoid mempunyai beberapa fungsi yaitu :
a. Penentuan pola oksigenasi;
b. Penentuan jumlah gugus metoksil (dan kedudukannya);
c. Pembedaan isoflavon, flavanon dan dihidroflavonol;
d. Penentuan jumlah gula yang ada (dan penentuan apakah ikatannya α- atau β);
e. Pendeteksian rantai samping hidrokarbon seperti –CH3 yang terikat pada C dan prenil yang terikat pada C (atau O).
Spektrum 1H-NMR terlihat terutama di daerah 0 – 10 ppm medan bawah dari sinyal acuan tetrametilsilan (TMS). Hanya proton yang menghasilkan sinyal (beresonansi) di daerah ini dan proton yang secara kimia sama memberikan sinyal yang sama. Ukuran sinyal (integrasi) berbanding lurus dengan jumlah proton yang menghasilkan sinyal. Jadi, sinyal yang dihasilkan oleh gugus –OCH3 akan menunjukkan hasil integrasi yang ukurannya 3 kali ukuran sinyal yang dihasilkan oleh proton atom tunggal. Berikut disajikan data geseran kimia (ppm) dari berbagai jenis proton yang memungkinkan untuk senyawa flavonoid pada Tabel 2 (Markham, 1988).
19 Tabel 2. Kemungkinan geseran kimia dari berbagai jenis proton flavonoid
Geseran Kimia (ppm) Jenis Proton
0 Tetrametilsilsilan (pembanding)
0 – 0,5 Gugus eter trimetilsilil
1,0 C-CH3 ramnosa (doblet lebar)
1,7 Gugus metil pada prenil (-CH2-CH=C(CH3)2) 2,0 Asetat (CH3COO- dan C-CH3 aromatik) 2 – 3 H-3 flavanon (multiplet – dua proton)
3,5 – 4,0 Kebanyakan C-H gula
4,2 – 6,0 H-1 gula (juga H-2 dihidroflavonol), 5,0 ppm Dan H-2 flavonon, 5 – 5,5 ppm
6,0 Metilendikoksi (O-CH2-O)(singlet)
6,0 – 8,0 Proton pada cincin A dan B 7,5 – 8,5 H-2 isoflavon (singlet)
12 – 14 5-OH (hanya terlihat bila pelarutnya DMSO-d6) Sumber: Markham (1988)
2.5 Aktivitas Antioksidan
Antioksidan merupakan kelompok senyawa yang dapat meredam radikal bebas sehingga sangat bermanfaat untuk memutuskan reaksi radikal bebas.
Radikal bebas merupakan molekul kimia yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas yang terdapat didalam tubuh bersifat reaktif. Radikal bebas dalam tubuh dapat mengalami reaksi oksidasi dengan cara mengikat elektron molekul sel yang dapat berbahaya bagi tubuh (Verrananda et al., 2016).
Radikal superoksida, peroksil, hidroksi, radikal superhidroksi, alkoksil, dan nitrogen dioksi merupakan contoh radikal bebas (Suwarni dan Cahyadi, 2016).
Tubuh manusia menghasilkan senyawa antioksidan endogen, contohnya seperti enzim SOD, glutation, superoplasmin, transferin, dan ferrin (Trilaksani, 2003).
Namun kebutuhan prooksidan di dalam tubuh seringkali kurang terpenuhi disebabkan oleh banyak faktor, salah satu diantaranya adalah banyaknya polusi,
20 paparan sinar ultraviolet (UV), pola makan yang kurang baik, dan sebagainya sehingga mengakibatkan timbulnya penyakit degeneratif seperti diabetes melitus, stroke, jantung koroner, katarak, kanker, dan lain-lain (Junior et al., 2017; Risky dan Suyatno, 2014).
Daun B. macrophylla mengandung flavonoid, terpenoid dan saponin (Fitrya et al., 2010). Pada buah B. macrophylla mengandung senyawa golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan dengan IC50 2,43 μg/mL (Londo et al., 2015).
Rajan dan Bhat (2016) menunjukkan ekstrak metanol buah B. macrophylla memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan ekstrak etanol dan air dengan nilai IC50 sebesar 16,29 mg/mL. Andina dan Musfirah (2017) menunjukkan aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol kulit batang B. macrophylla dengan nilai IC50 sebesar 20,03 mg/mL lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol daunnya dengan nilai IC50 sebesar 55,83 mg/mL. Sebagian besar senyawa yang berperan dalam memberikan aktivitas antioksidan adalah senyawa golongan flavonoid dan fenolik (Pokorny, 2007). Menurut Molyneux (2004), suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50 μg/mL, kuat untuk IC50 bernilai 50-100 μg/mL, sedang jika IC50 bernilai 100-150 μg/mL, dan lemah jika IC50 adalah 151-200 μg/mL.
2.6 Metode DPPH Free Radical Scavenging
Metode DPPH umumnya digunakan untuk mengetahui efektivitas suatu antioksidan dalam menghambat radikal bebas. DPPH merupakan senyawa radikal yang dapat menyerap cahaya tampak (visible) pada panjang gelombang 517 nm.
Perubahan warna yang terjadi dikarenakan adanya reaksi antara DPPH dan
21 antioksidan yang nilai absorbansinya dapat diamati pada panjang gelombang 517 nm (Andina dan Musfirah, 2017).
Pengukuran uji aktivitas antioksidan menggunakan metode 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenger. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam persentase scavenging activity, yaitu kemampuan antioksidan untuk menghambat aktivitas radikal bebas. Persentase scavenging activity ini diperoleh dari perbedaan serapan antara blanko dengan sampel yang diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515 nm (Margaretta et al., 2011).
DPPH assay merupakan metode yang paling umum digunakan untuk mengetahui scavenging activity radikal bebas dari berbagai macam ekstrak tumbuhan, senyawa murni dan obat. DPPH merupakan radikal bebas stabil yang dapat memberikan warna ungu ketika dilarutkan dalam etanol dan mempunyai nilai absorbsi maksimal pada panjang gelombang 520 nm (Adam et al., 2011).
Antioksidan mengikat radikal bebas dengan mendonorkan hidrogen, warna ungu akan berubah menjadi lebih terang atau menjadi kuning yang menandakan telah terjadi reaksi peredaman radikal bebas oleh senyawa antioksidan (Li et al., 2009).
Nilai scavenging activity dari metode radikal DPPH pada ekstrak akar B.
macrophylla mempunyai potensi antioksidan yang kuat ditandai dengan nilai aktivitas antioksidan IC50 yang sangat rendah yaitu 4,73 µg/mL dan nilai tersebut dibandingkan dengan asam askorbat (5,89 µg/mL) yang merupakan antioksidan alami. Berdasarkan hasil tersebut dapat membuktikan bahwa ekstrak akar B. macrophylla mempunyai potensi sebagai antioksidan dengan nilai IC50 yang hampir serupa dengan asam askorbat (Adam et al., 2011).
22 Senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar, berbentuk kristal berwarna ungu dan sering digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam (Simanjuntak et al., 2004). Radikal bebas DPPH akan ditangkap oleh senyawa antioksidan oleh radikal bebas untuk mendapatkan pasangan elektron dan mengubahnya menjadi difenil pikrilhidrazin (Cholisoh dan Utami, 2008).
DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen akan membentuk molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter radikal bebas dari DPPH (Simanjuntak et al., 2004; Cholisoh dan Utami, 2008). Senyawa DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) mempunyai visual berwarna ungu, radikal bebas dari DPPH akan ditangkap oleh senyawa antioksidan untuk mendapatkan pasangan elektron dan mengubahnya menjadi difenil pikrilhidrazin (DPPH-H) yang non-radikal berwarna bening kekuningan.Reaksi peredaman DPPH dengan senyawa antioksidan disajikan pada Gambar 5.
.
Gambar 5. Reaksi peredaman radikal bebas DPPH dengan antioksidan (Molyneux, 2004)
23 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2019 - Oktober 2020 di Laboratorium Penelitian Kimia Pusat Laboratorium Terpadu Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Kromatotron dilakukan di Laboratorium Kimia FSI Universitas Jenderal Achmad Yani. Karakteristisasi senyawa dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI PUSPIPTEK Serpong.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah berbagai alat gelas laboratorium, vacuum rotary evaporator, plat KLT, chamber, kolom kromatografi, kolom KVC dan vacuum, kromatotron, vorteks serta botol vial.
Instrumen yang digunakan adalah Spektrofotometer UV-Vis (Genesys 10S), spektroskopi 1H-NMR beroperasi pada 500 MHz (JEOL JN Meca), dan spektroskopi LCMS/MS (Xevo G2-XS QTOF).
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak metanol batang gandaria (B. macrophylla) dari penelitian Rudiana et al. (2020), berbagai pelarut organik grade teknis terdestilasi seperti metanol, etil asetat, aseton dan n-heksana, kloroform p.a (Merck), kapas, serbuk silika gel G60 (Merck) dan silika gel 60 F254
(Merck), DPPH (Himedia), kuersetin (Aldrich) dan alumunium (III) klorida.
24 3.3 Diagram Alir Penelitian
- 49 tampungan
Kromatografi Vakum Cair dengan kepolaran bertingkat
(n-Heksana 100%, n-Heksana:EA, EA 100%, EA:MeOH, MeOH 100%) Ekstrak metanol batang
gandaria (B. macrophylla)
Isolat murni (3 mg)
Karakterisasi senyawa dengan spektroskopi LCMS/MS dan 1H-NMR
Uji aktivitas antioksidan
Kromatografi kolom gravitasi secara gradien
(n-Heksana 100%, n-Heksana:kloroform, kloroform 100%, Kloroform:EA, EA 100%, aseton 100%, MeOH 100%)
Kromatografi lapis tipis (dipandu dengan AlCl3)
10 fraksi (F5A-F5J)
25 3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pemisahan Senyawa dari Ekstrak Metanol Batang Gandaria 3.4.1.1 Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Husna, 2015)
Plat KLT berukuran 1x5 cm diberi batas bawah setinggi 0,5 cm dan batas atas pada plat KLT setinggi 0,5 cm. Sampel ekstrak metanol dilarutkan dalam aseton hingga cair kemudian ditotolkan pada garis batas bawah plat KLT silika
Plat KLT berukuran 1x5 cm diberi batas bawah setinggi 0,5 cm dan batas atas pada plat KLT setinggi 0,5 cm. Sampel ekstrak metanol dilarutkan dalam aseton hingga cair kemudian ditotolkan pada garis batas bawah plat KLT silika