BAB III METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.2 Karakterisasi Senyawa
3.4.2.1 Spektroskopi LCMS/MS (Rudiana et al, 2019)
Sampel diidentifikasi dengan cara melarutkan senyawa dalam metanol.
Larutan sampel sebanyak 1µL diinjeksikan ke dalam instrumen LCMS/MS Xevo G2-XS QTof dengan kolom C18 dan laju alir 0,3 mL/menit. Campuran 0,1%
28 asam format (FA) dalam air (WA) (0,1% FA:WA) dan asetonitril dalam 0,1%
asam format (Acetonitrile+0,1FA) digunakan sebagai fasa gerak dengan perbandingan yang berbeda-beda.
3.4.2.2 Spektroskopi 1H-NMR (Azkiyah, 2013)
Isolat murni ditimbang sebanyak 1 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL pelarut bebas proton yaitu aseton-d6. Larutan sampel isolat dimasukkan kedalam tabung injeksi kemudian diletakkan dalam spektrometer NMR.
3.4.3 Uji AktivitasAntioksidanMetode DPPH (Molyneux, 2004)
Sebanyak 2,5 mg sampel dilarutkan dengan 25 mL metanol (100 ppm) sebagai larutan induk. Larutan induk 100 ppm diencerkan menjadi konsentrasi 20;
10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 dan 0,3125 ppm. Masing-masing larutan sampel sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 2 mL DPPH 0,002%.
Larutan sampel di-vorteks sampai homogen dan diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit dalam ruang gelap. Nilai absorbansi didapatkan dengan cara mengukur larutan sampel dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum. Pengujian dilakukan sebanyak dua kali (duplo). Larutan DPPH 0,002% bertindak sebagai blanko dan kuersetin sebagai kontrol positif.
Nilai persentase inhibisi dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% Inhibisi = Ablanko − Asampel
Ablanko 𝑥 100%
Konsentrasi sebagai sumbu x dan %inhibisi sebagai sumbu y untuk memperoleh persamaan regresi linear. Nilai IC50 ditentukan menggunakan persamaan regresi linear y = ax + b, yaitu konsentrasi sampel yang dibutuhkan untuk mendapatkan persen inhibisi sebesar 50%.
29 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Senyawa dari Ekstrak Metanol Batang Gandaria (Bouea macrophylla Griff)
Isolasi senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak metanol batang B. macrophylla bertujuan untuk memperoleh senyawa murni (isolat) dari ekstrak metanol batang B. macrophylla. Ekstrak metanol batang B. macrophylla yang berwarna coklat tua sebanyak 37,96 gram dianalisis menggunakan KLT yang bertujuan untuk mencari eluen yang sesuai untuk pemisahan pada proses selanjutnya. Hasil KLT ekstrak kasar (crude extract) terbaik adalah menggunakan eluen n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 3:7 yang dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6. Kromatogram KLT ekstrak kasar (crude extract) metanol batang gandaria
Berdasarkan hasil kromatogram KLT tersebut, eluen n-heksana:EA digunakan sebagai eluen untuk tahap fraksinasi/pemisahan menggunakan KVC.
Fungsi fraksinasi menggunakan KVC adalah untuk memisahkan senyawa yang sangat beraneka ragam yang terkandung dalam sampel menjadi beberapa fraksi berdasarkan tingkat kepolarannya. Pemisahan menggunakan KVC ini
λ 254 nm λ366 nm
Tanpa lampu UV
30 menggunakan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Silika gel 60 F254 sebagai fase diam, dan fase gerak yang digunakan adalah perbandingan eluen pelarut organik dengan kepolaran yang bertingkat (n-heksana 100%, n-heksana:etil asetat, etil asetat 100%, etil asetat:metanol, metanol 100%). Fraksi hasil KVC dikumpulkan dalam botol vial dandidapatkan sebanyak 6 fraksi. Bobot masing-masing fraksi hasil KVC dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Berat fraksi hasil KVC
Fraksi Berat (g)
Masing-masing fraksi hasil KVC diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase gerak (eluen) n-heksana:etil asetat (2:8).
Identifikasi ini dilakukan untuk melihat pola pemisahan yang baik dari fraksi hasil KVC. Nilai faktor retensi (Rf) diperoleh dengan cara menghitung jarak noda yang ditempuh oleh senyawa dibagi jarak yang ditempuh oleh eluen (fase gerak). Nilai Rf spesifik pada suatu senyawa dengan menggunakan eluen tertentu. Hal itu dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya variasi senyawa dalam sampel yang diuji. Jika senyawa mempunyai nilai Rf lebih besar berarti kepolarannya tinggi, begitu juga sebaliknya (Dewi et al., 2015). Hasil KLT dari 6 fraksi KVC dapat dilihat pada Gambar 7.
31 Gambar 7. Kromatogram KLT fraksi KVC (F1-F6)
Hasil KLT 6 fraksi KVC disemprot menggunakan pereaksi semprot AlCl3
5% yang bertujuan untuk meningkatkan kepekaan dalam mendeteksi spot noda flavonoid pada plat KLT. Larutan AlCl3 bila disemprotkan pada plat KLT akan terlihat spot noda kuning tanpa perlu diamati di bawah sinar UV (366 nm), yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Markham, 1988). Reaksi antara flavonoid dan AlCl3 dapat dilihat pada Gambar 8.
O
Gambar 8. Reaksi antara flavonoid dan AlCl3 (Markham, 1988)
Berdasarkan hasil KLT yang diamati pada lampu UV panjang gelombang 254 nm dan 366 nm (Gambar 7), menunjukkan bahwa spot noda yang terdapat pada fraksi F1-F4 merupakan senyawa nonpolar karena dapat terelusi dengan tinggi menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:8), sedangkan pada fraksi F5 dan F6 diduga terdapat senyawa polar karena spot noda setelah dielusi dengan eluen n-heksana:etil asetat (2:8) masih tertahan di bawah. Setelah disemprot
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F1 F2 F3 F4 F5 F6 Senyawa target
λ 254 nm λ366 nm
n-Heksana:EA (2:8) n-Heksana:EA (2:8)
32 menggunakan pereaksi AlCl3, fraksi F5 diduga terdapat senyawa target yaitu flavonoid, karena menunjukkan spot noda berwarna kuning ketika diamati di bawah sinar UV 366 nm.
Fraksi F5 (1,1693 g) selanjutnya dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Fraksinasi menggunakan KKG berfungsi untuk memisahkan senyawa bahan alam yang masih bercampur pada fraksi hasil KVC sebelumnya. Campuran yang akan dipisahkan diletakkan pada bagian atas fase diam berupa silika gel G60 yang berada dalam tabung kaca (kolom). Fase gerak yang merupakan campuran pelarut organik (eluen) dibiarkan mengalir melalui kolom yang disebabkan oleh gaya gravitasi bumi(Gritter et al., 1991).
Fase gerak yang digunakan berupa campuran pelarut kloroform:etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (gradien). Pemilihan eluen kloroform:etil asetat (EA) ini berdasarkan hasil pola noda yang diidentifikasi dengan KLT sebelumnya, berikut adalah hasil KLT fraksi F5 dengan eluen kloroform:EA (5:5) yang diamati di bawah lampu UV pada λ 254 dan 366 nm.
Gambar 9. Kromatogram KLT fraksi F5 menggunakan eluen kloroform:EA (5:5)
F5 F5
Klorofom:etil asetat 5:5
λ 254 nm λ366 nm
33 Berdasarkan hasil KLT tersebut, pelarut campuran kloroform:EA digunakan sebagai eluen fase gerak pada fraksinasi menggunakan KKG. Sampel yang dipisahkan dielusi dengan menggunakan fase gerak berupa eluen dengan kepolaran bertingkat, yaitu n-heksan 100%, n-heksan:kloroform, kloroform 100%, kloroform:EA, EA 100%, aseton 100% dan metanol 100%. Analit hasil elusi pada KKG ditampung dalam botol vial. Tampungan analit hasil KKG diperoleh sebanyak 49 botol vial dan masing-masing fraksi tersebut digabungkan berdasarkan kesamaan noda pada plat KLT sehingga menghasilkan 10 fraksi (F5A – F5J) seperti pada Gambar 10.
Gambar 10. Kromatogram fraksi F5A-F5J hasil KKG (a) sebelum disemprot pereaksi AlCl3 (b) setelah disemprot pereaksi AlCl3
Hasil identifikasi menggunakan KLT dari fraksi F5A-F5J hasil KKG selanjutnya disemprot menggunakan pereaksi AlCl3 untuk mengetahui fraksi mana yang mengandung senyawa flavonoid. Hasilnya adalah fraksi F5D dan F5E masing-masing mengandung senyawa flavonoid, yang ditandai dengan munculnya warna kuning pada pola noda hasil KLT yang diamati pada lampu UV λ 366 nm.
Seluruh fraksi hasil KKG ditimbang untuk mengetahui massa masing-masing yang dapat dilihat pada Tabel 4.
Klorofom:aseton:MeOH 5:4:1
(a) (b)
λ 254 nm λ 366 nm
34 Tabel 4. Berat fraksi hasil KKG F5
Fraksi Berat (mg)
Fraksi F5D dilanjutkan untuk proses pemisahan selanjutnya karena mempunyai massa yang cukup banyak dan pola pemisahan noda pada KLT cukup sederhana. Pemisahan selanjutnya digunakan metode sentrifugal kromatografi dengan menggunakan alat kromatotron. Fraksi F5D dilakukan analisis dengan KLT untuk melihat eluen yang sesuai untuk proses kromatotron. Kromatogram hasil KLT terbaik dari fraksi F5D yang ditunjukkan pada Gambar 11.
Pemilihan kromatotron untuk pemisahan ini adalah karena pada hasil KLT (Gambar 11) menunjukkan pola noda yang cukup rapat. Pemisahan dengan metode kromatotron ini lebih cepat dan pelarut yang digunakan lebih sedikit dibandingkan menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Fasa diamnya berupa silika gel 60 F254 (seperti pada KLT) yang dilapisi pada plat kaca kuarsa dan untuk fasa gerak berupa pelarut yang sesuai dengan pola noda KLT.
35 Gambar 11. Kromatogram KLT fraksi F5D menggunakan eluenklo:aseton
Teknik pemisahan pada kromatotron menggunakan gaya sentrifugal dan gravitasi. Pemisahan dapat berlangsung lebih cepat karena adanya gaya sentrifugal yang akan mempercepat proses penyerapan pelarut yang membawa komponen yang dipisahkan (Atun, 2014). Selama jalannya proses elusi ini, plat kromatotron dimonitoring dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Analit hasil pemisahan dari kromatotron ditampung menggunakan botol vial, selanjutnya diamati menggunakan lampu UV untuk penggabungan fraksi.
Tampungan analit hasil kromatotron diperoleh sebanyak 35 botol vial dan menghasilkan 9 fraksi (F5D.1 – F5D.9) seperti pada Gambar 12.
Klorofom:aseton (6:4), (5:5), (4:6)
λ 254 nm λ 366 nm
36 Gambar 12. Kromatogram KLT fraksi F5D.1-F5D.9 hasil kromatotron
Seluruh fraksi hasil kromatotron ditimbang untuk mengetahui massa masing-masing yang dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Massa fraksi hasil kromatotron F5D
Fraksi Berat (mg) noda yang sederhana, terlihat seperti noda tunggal jika dilihat dibawah lampu UV λ 254 nm. Oleh karenanya, fraksi F5D.4 ini dilanjutkan untuk memperoleh hasil isolat senyawa murni. Proses pemisahan pada fraksi F5D.4 ini menggunakan metode KLT preparatif.
Klorofom:aseton 6:4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
λ 254 nm λ 366 nm
37 Metode KLT preparatif (KLTP) berguna untuk memisahkan campuran sehingga diperoleh senyawa murni (isolat). Pemilihan metode KLTP ini dikarenakan fraksi yang akan dipisahkan massanya sangat kecil yaitu hanya 22,9 mg dan pola nodanya masih berdekatan, sehingga tidak disarankan untuk menggunakan metode KKG atau kromatotron karena dikhawatirkan sampel akan banyak terjerat pada silika atau hasil tampungan (analit) mengalami overlap dikarenakan pola noda yang hampir menumpuk sehingga akan cukup sulit untuk mendapatkan senyawa murni.
KLT preparatif dilakukan menggunakan plat KLT silika gel 60 F254 yang berukuran 10 x 10 cm dengan batas atas dan bawah masing-masing 1 cm dan chamber sebagai wadah penampung eluen. Sampel fraksi F5D.4 (22,9 mg) dilarutkan dengan pelarut aseton kemudian ditotolkan menggunakan pipa kapiler pada batas bawah plat KLT sampai benar-benar habis tak bersisa. Selanjutnya dielusi menggunakan pelarut kloroform:aseton (9:1) sebanyak 3x elusi. Hasil identifikasi pola noda KLTP diamati dibawah lampu UV λ 254 nm dan 366 nm memperlihatkan ada 4 noda yang terbentuk pada plat KLT yang ditunjukkan pada Gambar 13.
Gambar 13. Hasil KLT preparatif di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm
Klorofom:aseton (9:1) (3x elusi)
Target Rf= 0,375
λ 254 nm λ 366 nm
38 Noda target yang mempunyai nilai Rf= 0,375 selanjutnya dikerok dan dilarutkan di dalam botol vial menggunakan pelarut aseton. Vial dikocok dengan kencang menggunakan vortex agar senyawa yang menempel pada silika dapat larut dalam pelarut aseton dan membentuk filtrat, selanjutnya vial disimpan selama ± 3 jam agar dapat larut sempurna. Selanjutnya, campuran disaring untuk memisahkan sampel yang berupa filtrat dengan silika gel hasil KLT preparatif.
Hasilnya, diperoleh fraksi F5D.4A berupa kristalputih dengan massa 3 mg.
Fraksi F5D.4A diuji kemurniannya menggunakan pelarut yang berbeda dari eluen pada KLT preparatif. Eluen yang digunakan adalah n-heksana:EA (2:8) dan dihasilkan noda tunggal dengan nilai Rf= 0,625 yang dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Uji kemurnian dengan eluen n-heksana:EA (2:8)
Uji kemurnian selanjutnya adalah menggunakan KLT 2 dimensi, yang bertujuan untuk membuktikan isolat yang diperoleh sudah murni dan tidak ada
n-heksana:EA (2:8)
F5D.4A F5D.4A
Rf= 0,625
λ 254 nm λ 366 nm
39 noda lain yang mempunyai Rf berbeda. Plat pada KLT 2D berukuran 5 x 5 cm danmenggunakan 2 jenis eluen yang berbeda sebagai fasa geraknya, yaitu (1) kloroform:aseton (7:3) dan (2) n-heksana:EA (2:8). Hasil KLT 2D bisa dilihat pada Gambar 15.
Gambar 15. Hasil KLT 2D fraksi F5D.4A
Berdasarkan hasil KLT 2D tersebut, pada pengelusian pertama menggunakan pelarut kloroform:aseton (7:3) menghasilkan noda tunggal dengan nilai Rf= 0,375 dan tidak ada noda lain dengan Rf yang berbeda. Selanjutnya plat KLT diputar ke kanan 90° dan dilakukan pengelusian kedua yang ditingkatkan kepolarannya dengan eluenn-heksana:EA (2:8) menghasilkan noda tunggal juga dengan nilai Rf lebih tinggi yaitu 0,875. Bercak noda tunggal yang dihasilkan
Pengelusian pertama
Pengelusian kedua
Rf= 0,375
Rf= 0,875
λ 254 nm λ 366 nm
40 pada KLT menandakan bahwa isolat yang diperoleh merupakan senyawa tunggal atau murni dan tidak ada campuran senyawa lain (Mathias et al., 1987).
Hasil uji kemurnian dengan KLT 2D menunjukkan bahwa fraksi F5D.4A memiliki spot noda tunggal dan merupakan senyawa murni yang berbentuk padatan berwarna putih dengan massa 3 mg. Isolat 1 ini selanjutnya dilakukan karakterisasi struktur molekulnya dengan menggunakan instrumen spektroskopi LCMS/MS dan1H-NMR.
4.2 Karakterisasi Senyawa Isolat 1
4.2.1 Hasil Analisis Spektroskopi LCMS/MS
Isolat 1 (3 mg) dianalisis dengan menggunakan spektroskopi LCMS/MS untuk mengetahui puncak area, bobot molekul serta kemurnian senyawa dalam fraksi tersebut. Jika spektrum hasil LCMS/MS menghasilkan puncak tunggal maka dapat dikatakan senyawa pada fraksi tersebut sudah murni, namun jika masih terdapat beberapa puncak area dengan waktu retensi (Rt) yang berbeda menunjukkan bahwa fraksi masih memiliki campuran beberapa senyawa.
Hasil karakterisasi dengan LCMS/MS pada isolat 1 dengan ionisasi ESI positif [M+H]+ diperoleh 1 puncak area dengan waktu retensi (Rt) tertentu.
Berikut adalah data kromatogram LCMS/MS isolat 1 dapat dilihat pada Gambar 16.
41 Gambar 16. Kromatogram LCMS/MS isolat 1
Pada Gambar 16 terlihat bahwa isolat 1 memiliki satu puncak tunggal yang muncul pada waktu retensi 5,19 menit. Kromatogram LCMS/MS isolat1 yang dideteksi dengan spektroskopi massa menghasilkan spektrum MS yang dapat dilihat pada Lampiran 1. Hasil analisis data LCMS/MS diolah dengan software UNIFI, kemudian hasil dugaan senyawa dibandingkan dengan menggunakan database pubchem untuk melihat struktur molekul senyawa yang diperoleh dengan melihat bobot molekul dari hasil spektrum LCMS/MS. Adapun perkiraan senyawa yang terdapat pada isolat 1 dari hasil analisa LCMS/MS dapat dilihat pada Tabel 6.
Senyawa tunggal
42 Tabel 6. Hasil analisis LCMS/MS pada isolat1
No. Rt
(menit) [M+H]+ Mr Rumus
Molekul Dugaan senyawa 1 5,19 273,0758 272,06847 C15H12O5
4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon (10)
Kromatogram yang dihasilkan menunjukkan hanya terdapat 1 puncak, hal tersebut menandakan bahwa isolat 1 sudah murni (berupa senyawa tunggal). Hasil puncak pada kromatogram isolat 1 diidentifikasi pada waktu retensi 5,19 menit dengan rumus molekul C15H12O5 dan mempunyai bobot molekul sebesar 272 g/mol yang diperkirakan merupakan senyawa turunan genistein, yaitu senyawa metabolit sekunder golongan flavonoid (Singh et al., 2020).
Setelah mengetahui rumus molekul dan bobot molekul dari senyawa isolat 1, selanjutnya senyawa tersebut dilihat pola fragmentasinya untuk memperkuat dugaan senyawa yang terkandung di dalamnya. Fragmentasi suatu molekul menyebabkan pola unik pada spektrum, dimana pola fragmentasi suatu senyawa akan berbeda dengan senyawa yang lain. Pola fragmentasi berguna untuk menentukan berat molekul dan informasi struktur molekul yang belum diketahui sebelumnya .
Dugaan struktur senyawa 4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon yang terkandung dalam isolat 1 dapat dilihat pada Gambar 17.
Gambar 17. Dugaan struktur senyawa 4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon (10) pada isolat 1
Singh et al. (2020) melakukan isolasi senyawa dari ekstrak metanol biji hijau Cullen corylifolium (L.) Medik. Didapatkan bahwa ekstrak metanol biji hijau C. corylifolium mengandung beberapa senyawa, salah satu diantaranya
(10)
43 adalah senyawa genistein. Zhang et al. (2017) telah melakukan penelitian tentang isolasi senyawa dari produk kedelai yang difermentasi, hasilnya terdapat 3 senyawa yang berhasil diisolasi, yaitu genistein, daidzein, dan kaempferol.
Senyawa genistein menunjukkan nilai aktivitas penghambatan enzim tertinggi terhadap AchE dengan nilai IC50 sebesar 17,48 µg/mL (Nilai IC50 dihitung dari kurva penghambatan konsentrasi vs persen inhibisi). Senyawa isoflavon seperti genistein umumnya terdapat pada ekstrak kedelai, Riyanto dan Soetjipto (2017) melakukan penelitian tentang ekstraksi senyawa genistein pada tempe busuk dengan menggunakan metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Hasilnya adalah kadar genistein tempe busuk tertinggi terdapat pada waktu fermentasi 4 hari yaitu 26,199 ± 25,146 mg/g sampel. Hasil inilebih tinggi dibandingkan kadar genistein pada ekstrak kacang kedelai dan susu kedelai yaitu 4,6 μg/g dan 13,9 μg/g yang dilakukan oleh Fukutake et al. (1996).
Analisis puncak tunggal dari spektrum massa isolat 1 pada waktu retensi 5,19 menit mempunyai berat molekul 272 g/mol dengan rumus molekul C15H12O5, memiliki kesamaan struktur dengan senyawa golongan isoflavonoid yaitu turunan genistein. Data spektrum MS isolat 1 (Lampiran 1) dibandingkan dengan spektrum MS senyawa genistein dari penelitian Coldham et al. (1999) yang dapat dilihat pada Lampiran 2, dapat diperkiraan pola fragmentasi pada senyawa isolat 1 dapat dilihat pada Gambar 18.
44 Gambar 18. Perkiraan pola fragmentasi senyawa isolat 1 sesuai spektrum MS
Elusidasi struktur senyawa isolat 1 dapat dilihat dari pola fragmentasi yang membuktikan adanya puncak spektrum MS pada m/z yang berbeda-beda.
Senyawa 4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon mempunyai nilai m/z 2 satuan massa lebih banyak daripada genistein, karena adanya perbedaan atom H antara keduanya. Spektrum MS senyawa 4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon muncul pada m/z 273, 255, 227 dan 197. Masing-masing m/z tersebut dibuat pola fragmentasinya sesuai jalur pola fragmentasi genistein menurut Coldham et al.
(1999). Dari pola fragmentasi senyawa 4,5,7,4'-tetrahidroksi-isoflavon (10) menggambarkan adanya kemungkinan isomer karena kehilangan molekul air (H2O) dan/atau CO dapat terjadi dari beberapa situs molekul (Coldham et al., 1999).
45 4.2.2 Hasil Analisis Spektroskopi 1H-NMR
Isolat 1 dilakukan karakterisasi menggunakan instrumen spektroskopi 1 H-NMR yang bertujuan untuk mengkonfirmasi struktur senyawa isolat.Spektroskopi
1H-NMR memberikan gambaran mengenai jenis atom, jumlah, maupun lingkungan atom hidrogen dalam senyawa organik. Atom hidrogen dalam lingkungan kimia yang berbeda akan menghasilkan spektrum yang bervariasi (Sastrohamidjojo, 1991).
Analisis menggunakan 1H-NMR ini beroperasi pada frekuensi 500 MHz dan menggunakan pelarut aseton-d6. Pelarut aseton-d6 disebut juga dengan aseton terdeuterasi dengan rumus molekul (CD3)2CO. Penggunaan pelarut terdeuterasi ini bertujuan untuk menggantikan semua atom 1H dengan D (2H) sehingga keberadaan hidrogen pada pelarut tidak akan menutupi sinyal-sinyal 1H dari sampel. Selain itu juga, adanya sinyal dari deuterium dimanfaatkan untuk proses penghomogenan lebih lanjut pada medan magnet di sekitar sampel (Syah, 2016).
Hasil analisis isolat 1 dengan 1H-NMR menunjukkan adanya 6 sinyal proton yang muncul pada spektrum yang dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 19. Spektrum 1H-NMR dari isolat 1 ((CD3)2CO), 500 MHz)
8,59 (H-2)
6,40 (H-6)
6,63 (H-8) 7,44
(H-2’,6’)
6,89 (H-3’,5’)
46 Berdasarkan hasil spektrum tersebut, memperlihatkan bahwa terdapat sinyal khas proton flavonoid yaitu pada pergeseran kimia 6,0 – 8,0 ppm yang menunjukkan adanya 2 cincin aromatik yang merupakan ciri khas dari senyawa golongan flavonoid (Markham, 1988). Terdapat masing-masing 2 sinyal pada cincin A dan cincin B, yang menandakan ada 2 lingkungan hidrogen yang berbeda. Pada cincin A muncul sinyal pada geseran kimia 6,40 ppm (1H, d, J= 2.0 Hz, H-6), dan 6,63 ppm (1H, dd,J= 2.0, 6.5 Hz, H-8). Berdasarkan sinyal geseran kimia tersebut, diprediksikan struktur pada cincin A adalah sebagai berikut.
Gambar 200. Prediksi struktur pada cincin A isolat 1
Berdasarkan prediksi struktur tersebut, dapat dilihat bahwa posisi gugus H pada cincin aromatik terdapat pada H-meta. Hal tersebut diperkuat dengan nilai J atau kopling yaitu sebesar 2.0 Hz, yang menandakan bahwa nilai tersebut sesuai dengan kopling meta, yaitu pada rentang 1 – 3 Hz (Syah, 2016).
Pada cincin B muncul sinyal proton pada geseran kimia 7,44 ppm (2H, d, J= 8.5 Hz, H-2’,6’) dan 6,89 ppm (2H, d, J= 9 Hz, H-3’,5’). Nilai J kopling dari 2 sinyal tersebut menunjukkan bahwa posisi gugus H pada cincin aromatik terletak
H-6 (6,40 ppm; d; J= 2,0 Hz)
H-8 (6,63; dd; J= 2,0 & 6,5 Hz)
47 pada posisi orto. Menurut Syah (2016), nilai kopling orto yaitu pada rentang 7 – 9 Hz. Prediksi struktur pada cincin B dapat dilihat pada Gambar 21.
Gambar 211. Prediksi struktur pada cincin B isolat 1
Senyawa isolat merupakan jenis isoflavonoid, hal itu dibuktikan dengan adanya sinyal proton pada geseran kimia 8,59 ppm (1H, s, H-2) yang menunjukkan adanya proton di posisi nomor 2, dimana ciri khas senyawa isoflavon akan muncul sinyal proton pada geseran kimia 7,5 – 8,5 ppm dengan multiplisitas singlet (Markham, 1988). Berdasarkan sinyal tersebut, dapat diprediksikan struktur pada cincin C adalah sebagai berikut.
H-2’,6’ (7,44 ppm; d; J= 8,5 Hz)
H-3’,5’ (6,89 ppm; d; J= 9 Hz)
48 Gambar 222. Prediksi struktur pada cincin C isolat1
Hasil interpretasi berdasarkan data spektrum 1H-NMR isolat dibandingkan dengan referensi penelitian terdahulu yang mengisolasi senyawa genistein. He et al. (2018) melakukan penelitian tentang isolasi isoflavon dari ekstrak etanol Hericium erinaceum Mycelium, menghasilkan senyawa genistein. Singh et al.
(2020) melakukan isolasi senyawa dari ekstrak metanol biji hijau Cullen corylifolium (L.) Medik, hasilnya genisteinberhasil diperoleh dari isolasi tumbuhan ini. Zhang et al. (2017) telah melakukan isolasi senyawa dari produk kedelai yang difermentasi, hasilnya terdapat 3 senyawa yang berhasil diisolasi, salah satunya adalahgenistein. Hasil korelasi data spektrum 1H-NMR dari hasil isolat yang dibandingkan dengan penelitian terdahulu dapat dilihat pada Tabel 7.
H-2 (8,59 ppm; s)
49 Tabel 7. Data perbandingan spektrum 1H-NMR senyawa isolat dengan senyawa
genistein
(****) 500 MHz dalam aseton-d6
Berdasarkan pada Tabel 7 bahwa isolat mempunyai kesesuaian yang tinggi dengan genistein dari penelitian-penelitian terdahulu, sehingga isolat 1 disarankan merupakan senyawa turunan genistein. Senyawa genistein mempunyai gugus karbonil (C=O) pada posisi karbon nomor 4, sedangkan pada senyawa isolat 1 yang merupakan derivat genistein, pada posisi karbon nomor 4 gugus karbonil digantikan oleh gugus hidroksil (-OH). Hal itu dibuktikan dengan adanya sinyal singlet pada geseran kimia 3,86 ppm untuk gugus metin yang mengikat atom oksigen (-CH-O-). Menurut Syah (2016), gugus alkil yang terikat pada golongan alkohol (dan eter) lazimnya akan muncul sinyal pada geseran kimia sekitar 3 - 4
50 ppm. Berdasarkan hasil interpretasi data spektrum 1H-NMR dapat diprediksikan struktur isolat 1 ditunjukkan oleh Gambar 23 dengan nama IUPAC 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon (10) yang merupakan senyawa golongan isoflavonoid.
O
4.3 Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan pada penelitian ini menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) free radical scavengerdengan menghitung nilai persentase scavenging activity, yaitu kemampuan antioksidan untuk menghambat aktivitas radikal bebas. Sampel yang diukur nilai aktivitas antioksidannya yaitu ekstrak kasar (crude extract) metanol batang gandaria dan isolat 1. Kedua sampel tersebut dibandingkan nilai aktivitas antioksidannya dengan senyawa kuersetin sebagai kontrol positif.
Hasil uji aktivitas antioksidan pada ekstrak kasar (crude extract) dan senyawa 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon dibandingkan dengan kuersetin sebagai kontrol positif, perbandingan nilai IC50 tersebut dapat dilihat pada tabel 8.
Tabel 8. Perbandingan aktivitas antioksidan pada ekstrak kasar, senyawa 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon, dan kuersetin
Sampel Nilai IC50 Aktivitas Antioksidan
Ekstrak kasar 9,11 ppm Sangat kuat
4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon 707,08 Tidak aktif Kuersetin (kontrol positif) 0,97 ppm Sangat kuat
51 Berdasarkan data tersebut, menunjukkan bahwa nilai aktivitas antioksidan ekstrak metanol batang gandaria tergolong antioksidan sangat kuat, sedangkan senyawa 4,5,7,4’-tetrahidroksi-isoflavon tidak aktif sebagai antioksidan. Berikut disajikan data tingkat kekuatan aktivitas antioksidan sesuai nilai IC50nya.
Tabel 9. Tingkat kekuatan aktivitas antioksidan sesuai nilai IC50
Nilai IC50 Tingkat aktivitas antioksidan
< 50 ppm Sangat kuat
50 - 100 ppm Kuat
101 - 150 ppm Sedang
151 - 200 ppm Lemah
> 200 ppm Tidak aktif
Sumber: Molyneux(2004)
Jika dibandingkan dengan nilai IC50 kuersetin sebagai kontrol positif, ekstrak metanol lebih lemah dibandingkan dengan senyawa kuersetin yang mempunya nilai IC50 sebesar 0,97 ppm. Kuersetin digunakan sebagai kontrol positif karena kuersetin merupakan senyawa golongan flavonoid yang dapat
Jika dibandingkan dengan nilai IC50 kuersetin sebagai kontrol positif, ekstrak metanol lebih lemah dibandingkan dengan senyawa kuersetin yang mempunya nilai IC50 sebesar 0,97 ppm. Kuersetin digunakan sebagai kontrol positif karena kuersetin merupakan senyawa golongan flavonoid yang dapat