BAB III. METODE PENELITIAN
E. Jalan Penelitian
Larutan CMC Na 1 % dibuat dengan cara menimbang secara seksama 1 gram CMC Na dan ditaburkan sedikit demi sedikit diatas air panas sambil diaduk hingga mengembang. Lalu dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml dan ditambah air hingga 100 ml.
2. Pembuatan larutan asam asetat 1%
Larutan asam asetat dibuat dari asam asetat glacial (100%) dengan cara pengenceran menggunakan rumus V1 C1 = V2 C2.
3. Penetapan dosis asetosal
Asetosal digunakan sebagai kontrol positif dalam penelitian ini adalah asetosal murni. Dalam penelitian ini diasumsikan bahwa dosis asetosal untuk orang dewasa (50 kg) adalah 0,5 gram. Supaya dosis tersebut dapat dikonversikan ke mencit, maka terlebih dahulu dihitung dosis untuk manusia 70 kg sebagai berikut:
Dosis untuk manusia 70 kg = 70 kg/50 kg x 0,5 g
= 0,7 g
Jika dosis tersebut dikonversikan ke mencit 20 g dengan angka konversi 0,0026 maka diperoleh sebagai berikut:
Dosis untuk mencit 20 g = 0,0026 x 0,7 g = 1,82 x 10-3 g maka dosis asetosal = 1000 g/20 g x 1,82 x 10-3
= 0,091 g/kg BB
= 91 mg/kg BB
Untuk menetapkan dosis asetosal digunakan 3 peringkat dosis. Dosis hasil perhitungan digunakan sebagai dosis tengah, 2 dosis lainnya diperoleh dengan cara menentukan kelipatannya. Angka kelipatan yang digunakan yaitu kelipatan 2 sehingga diperoleh dosis 250, 500, dan 1000 mg. Setelah dikonversikan ke mencit diperoleh dosis 45,5; 91; 182 mg/kg BB.
4. Pembuatan suspensi asetosal dalam CMC Na 1%
Asetosal yang akan digunakan sebagai kontrol positif dibuat dengan menimbang secara seksama sejumlah asetosal dan disuspensikan dalam CMC Na 1 % sesuai dengan volume yang akan dibuat.
5. Penetapan dosis jamu kunyit asam instan
Penetapan dosis jamu kunyit asam instan berdasarkan dosis yang digunakan manusia dewasa (50 kg) yaitu 25 g/50 kg BB, sesuai dengan aturan pakai yang terdapat pada kemasan jamu instan. Supaya dosis tersebut dapat dikonversikan ke mencit, maka dihitung dosis untuk manusia 70 kg sebagai berikut:
Dosis untuk manusia 70 kg = 70 kg/50 kg x 25 g
= 35 g
Jika dosis tersebut dikonversikan ke mencit 20 g dengan angka konversi 0,0026 maka diperoleh sebagai berikut:
Dosis mencit 20 g : 35 g/70 kg BB x 0,0026 : 0,091 g/20g BB
: 4,55 mg/g BB : 4.550 mg/kg BB
Dosis 4.550 mg/kg BB merupakan dosis terapi. Dalam penelitian ini ditetapkan 3 peringkat dosis, dengan cara menentukan kelipatannya. Angka kelipatan yang digunakan sebesar 2 kalinya, sehingga diperoleh 3 peringkat dosis yaitu 4.550 mg/kg BB (1 x 4.550 mg/kg BB); 9.100 mg/kg BB (2 x 4.550 mg/kg BB); dan 18.200 mg/kg BB (2 x 9.100 mg/g BB).
6. Pembuatan larutan jamu kunyit asam instan
Jamu kunyit asam instan ditimbang sebanyak 18,2 g dan dilarutkan dengan aquadest hingga 25 ml.
7. Penetapan dosis jamu kunyit asam ramuan segar
Penetapan dosis jamu kunyit asam ramuan segar berdasarkan komposisi ekstrak kunyit : asam = 20% : 10% dalam jamu kunyit asam instan produksi PT. “SM”.
Kunyit : 20% x 25 g = 5 g Asam : 10% x 25 g = 2,5 g
Sehingga dosis untuk manusia dewasa (50 kg) adalah 7,5 g/50 kg BB. Supaya dosis tersebut dapat dikonversikan ke mencit, maka dihitung dosis untuk manusia 70 kg sebagai berikut:
Dosis untuk manusia 70 kg = 70 kg/50 kg x 7,5 g
= 10,5 g
Jika dosis tersebut dikonversikan ke mencit 20 g dengan angka konversi 0,0026 maka diperoleh sebagai berikut:
Dosis mencit 20 g : 10,5 g/70 kg BB x 0,0026 : 0,0273 g/20g BB
: 27,3 mg/20g BB : 1.365 mg/kg BB
Dosis 1.365 mg/kg BB merupakan dosis terapi. Dalam penelitian ini ditetapkan 3 peringkat dosis, dengan cara menentukan kelipatannya. Angka kelipatan yang digunakan sebesar 2 kalinya, sehingga diperoleh 3 peringkat dosis yaitu 1.365
mg/kg BB (1 x 1.365 mg/kg BB); 2.730 mg/kg BB (2 x 1.365 mg/kg BB); dan 5.460 mg/kg BB (2 x 2.730 mg/kg BB).
8. Pembuatan larutan jamu kunyit asam ramuan segar
Konsentrasi larutan jamu kunyit asam ramuan segar yaitu: V x C = D x BB 0,5 ml x C = 5.460 mg/kg x 20 g C = ml g kgx mg 5 , 0 20 / 460 . 5 C = 218,4 mg/ml
Larutan jamu ramuan segar kunyit asam dibuat dalam 100 ml sehingga konsentrasi yang diperoleh adalah 21,84 g/100 ml. Komposisi kunyit : asam = yang digunakan yaitu 20% : 10% .
Kunyit : 20/30 x 21,84 g =14,56 g Asam : 10/30 x 21,84 g = 7,28 g
Rimpang kunyit ditimbang sebanyak 14,56 g dan buah asam sebanyak 7,28 g; kemudian direbus dengan 100 ml air mendidih.
9. Seleksi hewan uji
Hewan uji yang digunakan yaitu mencit putih betina galur Swiss, berumur 2-3 bulan, dengan berat badan 20-30 gram. Semua hewan uji dipelihara dengan kondisi dan perlakuan yang sama meliputi pakan, minum, dan kandang. Sebelum diberi perlakuan, semua hewan uji diadaptasikan terlebih dahulu dengan kondisi yang sama dan dipuasakan terlebih dahulu selama 18-22 jam tanpa diberi makan, hanya diberi minum saja. Hal ini bertujuan untuk mengurangi variasi akibat adanya makanan.
10. Penetapan kriteria geliat
Respon yang diamati pada uji daya analgesik ini berupa geliat. Kriteria geliat perlu ditetapkan untuk mendapatkan geliat yang hampir sama. Gerakan mencit yang dianggap sebagai geliat adalah kedua kakinya ditarik ke belakang dan tubuhnya memanjang serta pada bagian perutnya menempel pada alas tempat berpijak.
11. Penetapan dosis asam asetat
Menurut Williamson, E. M., Okpako, D. T., dan Evans, F. J. (1996) asam asetat kadar 1-3 % digunakan sebagai iritant yang menyebabkan nyeri pada pengujian daya analgesik dengan metode geliat.
Penentuan dosis asam asetat bertujuan untuk menentukan dosis efektif asam asetat yang dapat memberikan jumlah geliat yang cukup dan mudah untuk diamati. Peringkat dosis yang digunakan yaitu 25, 50, dan 100 mg/kg BB dengan konsentrasi 1%. Ketiga dosis tersebut diinjeksikan secara interaperitoneal kepada masing-masing kelompok hewan uji. Geliat mencit diamati setiap 5 menit selama 60 menit. Dosis yang dipilih adalah dosis yang memberikan geliat tidak terlalu banyak, sehingga tidak kesulitan dalam pengamatan, tetapi juga tidak terlalu sedikit sehingga bila sebelumnya diberi perlakuan analgetika masih memberikan geliat sampai kurang lebih 1 jam.
12. Penetapan selang waktu pemberian rangsang
Selang waktu pemberian rangsang ditetapkan untuk mengetahui rentang waktu antara pemberian rangsang nyeri dengan pemberian larutan uji yang digunakan sebagai analgesik. Diharapkan pada selang waktu tersebut, larutan
uji yang diberikan secara per oral telah mengalami absorbsi dan bila diberikan rangsang nyeri berupa asam asetat, larutan uji dapat menimbulkan efek dan respon geliat hewan uji akan berkurang.
Rentang waktu yang diujikan adalah 5, 10, 15 dan 30 menit. Sebanyak 12 ekor hewan uji, yang telah dipuasakan ± 18-22 jam dibagi ke dalam 4 kelompok. Hewan uji diberikan asetosal dengan dosis 91 mg/kg BB secara per oral kemudian setelah selang waktu tiap kelompok (5, 10, 15, dan 30 menit) diinjeksi dengan asam asetat 1% secara intraperitoneal menggunakan dosis efektif asam asetat yang diperoleh dari penetapan dosis asam asetat.
13. Uji daya analgesik
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 72 ekor. Hewan uji dibagi secara acak menjadi 8 kelompok meliputi: kelompok I yaitu kontrol negatif digunakan aquadest, kelompok II yaitu kontrol positif digunakan asetosal dosis 91 mg/kg BB, kelompok III-V yaitu kelompok perlakuan jamu kunyit asam instan dengan 3 peringkat dosis yaitu 4.550; 9.100; 18.200 mg/kg BB, dan kelompok VI-VIII yaitu kelompok perlakuan jamu ramuan segar kunyit asam dengan 3 peringkat dosis yaitu 1.365; 2.730; 5.460 mg/kg BB.
Hewan uji diberi perlakuan secara oral dengan larutan uji dan setelah 30 menit diinjeksi dengan asam asetat 1% secara intraperitoneal. Pengujian daya analgesik dilakukan dengan pengamatan respon nyeri berupa geliat setelah mencit diinjeksi asam asetat. Pengamatan dilakukan tiap lima menit selama 60 menit. Persen penghambatan terhadap rasa nyeri dari masing-masing perlakuan dihitung dengan persamaan Handersot dan Forsaith yaitu :
% penghambatan terhadap rasa nyeri = 100 – [(P/K) x 100] Keterangan :
P = jumlah kumulatif geliat hewan uji setelah perlakuan K = jumlah rata-rata geliat hewan uji kontrol negatif
Perubahan persen penghambatan geliat terhadap asetosal dosis 91 mg/kg BB sebagai kontrol positif pada tiap kelompok perlakuan dihitung dengan rumus:
% perubahan penghambatan rangsang = ( )x100
Kp Kp P−
Keterangan:
P = % penghambatan terhadap geliat pada setiap kelompok perlakuan Kp = rata-rata % penghambatan terhadap geliat pada kelompok kontrol positif
