Penghitungan kapasitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil). DPPH merupakan senyawa radikal stabil dalam metanol dan berwarna ungu tua saat belum bereaksi dengan senyawa pereduksi. Proses reduksi dari seyawa antioksidan akan mengakibatkan penurunan nilai absorbansi sehingga terjadi penurunan intensitas warna. Dalam metode ini digunakan asam askorbat sebagai kontrol positif karena serta metanol sebagai kontrol negatif. Kontrol positif di sini merupakan sampel yang mengandung senyawa antioksidan dengan konsentrasi tertentu, sedangkan kontrol negatif merupakan sampel yang tidak mengandung senyawa antioksidan.
Molekul suatu bahan pangan tersusun dari atom-atom yang secara normal tidak bermuatan. Masing-masing atom memiliki nukleus yang mengandung neutron yang tidak bermuatan serta proton yang bermuatan positif. Elektron yang bermuatan negatif berada di orbit mengitari nukleus. Iradiasi pada bahan pangan dapat mengubah dari struktur molekul dengan cara menumbuk elektron sehingga keluar dari orbit. Hal ini akan mengakibatkan atom menjadi bermuatan dan menjadi suatu bentuk baru yang dikenal sebagai radikal bebas (Roggenthen, 1984). Radikal bebas yang
terbentuk dapat menyebabkan terjadinya reaksi berantai autooksidasi. Radikal bebas tersebut dapat berikatan dengan sesamanya radikal bebas atau berikatan dengan antioksidan, atau berikatan dengan komponen molekul pangan seperti karbohidrat, lemak, dan protein. Senyawa antioksidan berperan dalam menekan terjadinya efek autooksidasi (Will, 1981).
Dalam penelitian ini ekstrak sampel pepes ikan mas iradiasi yang digunakan bervariasi menurut tahun penyinarannya dengan kontrol pepes non iradiasi sebagai pembandingnya. Pengukuran kapasitas antioksidan yang dimaksud di sini bukanlah mengukur kapasitas antioksidan awal sampel, namun yang diukur adalah kapasitas antioksidan ekstrak sampel yang tersisa selama penyimpanan sampel pepes akibat senyawa antioksidan yang telah teroksidasii selama proses penyimpanan. Antioksidan dalam sampel pepes berasal dari rempah-rempah yang dibalurkan pada daging pepes ikan mas iradiasi. Komponen antioksidan yang terdapat pada sampel tersebut merupakan jenis antioksidan non enzimatis yang terdiri atas antioksidan larut air dan larut lemak. Contoh komponen antioksidan larut air pada sampel pepes tersebut adalah asam askorbat pada lemon, sedangkan contoh komponen antioksidan larut lemak misalnya gingerol dan shagaol pada jahe
Gambar 6. Kapasitas antioksidan sampel per pengenceran
Berdasarkan hasil yang diperoleh, dengan asumsi bahwa kapasitas antioksidan awal sampel adalah 100%, ekstrak sampel dengan pengenceran 1x yang memiliki kapasitas antioksidan tertinggi adalah sampel pepes D,
yaitu sebesar 33.83%. Kapasitas antioksidan kedua terbesar untuk pengenceran 1x adalah sampel pepes C yaitu 31.91%. Urutan selanjutnya adalah sampel pepes A sebesar 21.06% dan terakhir yang terendah adalah sampel pepes B sebesar 20.42%. Berdasarkan data tersebut, dapat disimpulkan sementara bahwa semakin lama tahun penyinaran, akan dihasilkan sampel dengan kapasitas antioksidan terukur yang rendah. Penelitian dilakukan oleh Diehl (1979), menunjukkan hasil bahwa terjadi penurunan kandungan alfa tokoferol sebesar 20% pada rolled oats selama penyimpanan 6-8 bulan akibat proses iradiasi pada kondisi terekspos udara. Penurunan kandungan tokoferol juga tetap terjadi walau rolled oats
disimpan pada kondisi penuh nitrogen meskipun penurunan yang terjadi tidak signifikan.
Menurut Diehl (1990), kondisi penyinaran yang dilakukan pada suhu beku akan memberikan efek perlindungan pada sampel. Efek radiolitik yang bersifat reaktif akan dihambat oleh kondisi makanan yang beku serta mencegah kemungkinan terjadinya reaksi dengan dirinya sendiri atau substrat. Kenaikan suhu penyimpanan secara bertahap akan kembali memungkinkan radikal bebas yang terbentuk kembali aktif dan bereaksi dengan sesamanya untuk saling menetralkan. Namun tidak menutup kemungkinan radikal bebas yang aktif berikatan dengan substrat sampel . Pernyataan tersebut mengindikasikan bahwa berkurangnya kapasitas antioksidan sampel akibat penyimpanan dapat dikarenakan oleh aktivitas radikal bebas yang aktif kembali atau terbentuk yang berikatan dengan antioksidan. Artinya, bahwa semakin lama masa simpan sampel pepes ikan mas iradiasi, kemungkinan kontak yang terjadi antara radikal bebas dan antioksidan akan semakin sering terjadi. Hal ini lah yang menyebabkan sampel dengan masa simpan lebih dari 12 bulan memiliki kapasitas antioksidan tersisa yang rendah.
Hasil yang menyimpang terjadi pada sampel pepes B di mana memiliki kapasitas antioksidan yang lebih rendah apabila dibandingkan dengan sampel pepes A. Hal ini dapat disebabkan karena kondisi pengekstrakan sampel yang kurang sempurna sehingga tidak semua komponen antioksidan
pada sampel terekstrak. Menurut Shahidi (1995), tidak ada sistem ekstraksi yang sangat cocok untuk isolasi semua jenis senyawa fenolik dan bahkan jenis spesifik tertentu dari senyawa fenolik tersebut.
Sampel pepes D pada pengeceran 1x memiliki kapasitas antioksidan tertinggi. Sampel pepes D ini diduga dilakukan penyinaran pada tahun yang lebih baru dibandingkan sampel pepes yang lain. Hal ini mengakibatkan senyawa antioksidan yang berada pada ekstrak sampel belum terlalu banyak teroksidasi oleh radikal bebas yang terbentuk selama proses iradiasi atau penyimpanan.
Apabila kapasitas antioksidan semua ekstrak sampel pepes iradiasi pengenceran 1x dibandingkan dengan sampel pepes kontrol, ternyata ekstrak sampel pepes iradiasi memiliki kapasitas antioksidan yang lebih tinggi. Hal tersebut disebabkan karena proses iradiasi akan membantu membuka matriks bahan pangan sehingga komponen antioksidan akan mudah terekstrak. Sampel pepes kontrol menghasilkan kapasitas antioksidan sebesar 15.53%. Kenaikan persentase kapasitas antioksidan sampel pepes iradiasi apabila dibandingkan terhadap pepes kontrol adalah lebih dari 31.49%. Menurut Wierbicki (1980) dan Giroux (1998), proses iradiasi dapat menyebabkan degradasi dari jaringan ikat yang akan menyebabkan tekstur menjadi rapuh. Jaringan kolagen akan mudah diputus menjadi unit yang lebih kecil pada dosis iradiasi lebih dari 50 kGy.
Pengenceran 2x dan pengeceran 4 x yang dilakukan terhadap ekstrak sampel secara keseluruhan menghasilkan penurunan kapasitas antioksidan. Hal tersebut disebabkan karena jumlah senyawa antioksidan pada ekstrak yang dapat berikatan dengan senyawa DPPH menjadi berkurang akibat pengenceran. Selain itu, adanya pengenceran akan menyebabkan peningkatan ketersediaan air yang dapat dioksidasi oleh radikal bebas menjadi bentuk radikal hidroksil. Vas (1969) melakukan penelitian dengan meiradiasi pektin eterase pada kondisi basah dan kering.data penelitian tersebut menunjukkan bahwa enzim yang diiradiasi pada kondisi basah aktifitasnya akan menjadi inaktif, sedangkan pada kondisi kering aktifitas enzim masih terjaga walau menurun. Penelitian Vas (1969) tersebut
membuktikan bahwa dengan meningkatnya kandungan air dalam suatu bahan akan menyebabkan kandungan radikal bebas pada bahan pangan tersebut mengalami peningkatan.
Pada sampel pepes A pengenceran 2 x memiliki kapasitas antioksidan sebesar 16.17%, pengenceran 4 x sebesar 15.10%. Sampel pepes B pengenceran 2x memiliki kapasitas antioksidan sebesar 16.60%, pengenceran 4x sebesar 8.51%. Sampel pepes C pengenceran 2x memiliki kapasitas antioksidan sebesar 16.17%, pengenceran 4x sebesar 14.04%. Sampel pepes D pengenceran 2x memiliki kapasitas antioksidan sebesar 24.45%, pengenceran 4x sebesar 19.14%. Sampel pepes kontrol pengenceran 2x memiliki kapasitas antioksidan sebesar 14.26%, pengenceran 4x sebesar 12.23%. Perbandingan juga dilakukan antara kontrol asam askorbat dan masing-masing ekstrak. Berdasarkan hasil yang diperoleh asam askorbat dengan konsentrasi 1000 ppm (100 mg/ 100 ml) dengan aktifitas peredanan sebesar 92.65% memiliki kapasitas yang jauh lebih tinggi apabila dibandingkan dengan kapasitas antioksidan semua ekstrak sampel pepes. Hal ini dapat disebabkan masih adanya senyawa antioksidan pada sampel yang belum terekstrak
C Pengaruh Penambahan Ekstrak Pepes terhadap Hemolisis Eritrosit